Abstract
Meget aneuploide svulster er vanlig i epiteliale eggstokkreft (EOC). Vi undersøkte om NUMA uttrykk var assosiert med dette fenomenet.
Numa protein nivåer i normale og tumorvev, eggstokkene cellelinjer og primærkulturer av ondartede celler avledet fra eggstokkene ascitisfluider ble analysert ved Affymetrix microarray analyse, immunoblotting, immunhistokjemi (IHC) og immunfluorescens (IF), med resultater korrelert til tilknyttede kliniske data. Aneuploidy status i primærkulturer ble bestemt ved FACS-analyse.
Affymetrix microarray data indikerte at Numa ble overuttrykt i svulstvev, primærkulturer og cellelinjer i forhold til normal eggstokkvev. IHC avslørte lav til svak Numa uttrykk i normalt vev. Expression ble oppregulert i svulster, med en signifikant sammenheng med sykdom stadium i mucinkjertler EOC undergrupper (p = 0,009), spredning til lymfeknuter (p = 0,03) og pasientens alder (p = 0,04). Ytterligere diskontinuerlige data analyse viste at høye Numa nivåer i svulster redusert med Karakter (p = 0,02), men økte med sykdom stadium (p = 0,04) i serøs EOC. Numa uttrykk redusert i slutten av sykdomsstadiet 4 endometrioid EOCs. Høye Numa nivåer redusert med økt tumorinvasjon i alle undergrupper (p = 0,03). IF av primærkulturer viste at høye Numa nivåer ved mitotiske spindel polene var signifikant assosiert med en redusert andel av celler i cytokinese (p = 0,05), økt binucleation (p = 0,021) og multinucleation (p = 0,007), og Aneuploidy (p = . 0,008)
Numa er sterkt uttrykt i EOC svulster og høye Numa nivåer korrelerer med økning i mitotiske defekter og Aneuploidy i primærkulturer
Citation. Brüning-Richardson A, Bond J, Alsiary R , Richardson J, Cairns DA, McCormac L, et al. (2012) NUMA Overuttrykte i ovarialcancer. PLoS ONE 7 (6): e38945. doi: 10,1371 /journal.pone.0038945
Redaktør: J.Christopher stater, University of Louisville, USA
mottatt: 26 januar 2012; Godkjent: 14 mai 2012; Publisert: 14 juni 2012
Copyright: © 2012 Brüning-Richardson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet og Dr. Brüning-Richardson ble finansiert av Yorkshire Cancer Research [L328]. The University of Leeds støtter Dr. Bond, Dr. Burns, Dr. Hall og Dr. Morrison. Dr. Bell er støttet av Breast Cancer Campaign [2007NovPR53], Dr. Alsiary av et stipend fra Saudi Arabian departementet for høyere utdanning, Dr. Cairns av den britiske Medical Research Council [G0802416], Dr. McCormac av Oncolytics Biotech Inc, (Calgary, Canada) og Dr. Wilkinson og Dr. Hutson ved Leeds Teaching Hospitals NHS Trust. Dr. Bond, Dr. Burns, Dr. Wilkinson, Dr. Morrison og Dr. Bell holde finansiering fra Yorkshire kreftforskning, GDH fra Cancer Research UK, og Dr. Burns og Dr. Wilkinson fra Wellbeing av kvinner. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
238 kDa atom mitotiske apparat (NUMA) protein er en del av inter kjernen og mitotisk spindel pol matrisen [1]. Numa har funksjoner i spindelenheten gjennom sin tilknytning til mikrotubulidynamikk motorer [2], [3] og i spindel posisjonering under asymmetrisk celledeling [4]. En ytterligere inter rolle som en kjernefysisk stillas protein har blitt foreslått [4] – [6]. Numa er allestedsnærværende uttrykt [6], [7]. De kjernefysiske og spindel pol lokaliseringer av Numa er godt karakterisert normalt vev [8], [9] og i tumorvev ved immunhistokjemi (IHC) i Human Protein Atlas. Rollen som mitotiske proteiner som Numa kan spille i kreft har nylig blitt en gjenstand for fornyet interesse som det har blitt klart at Aneuploidy er et felles trekk ved svulster som kan drive sin progresjon [10], [11].
EOC er en kompleks sykdom som er vanskelig å behandle på grunn av sen presentasjon, tilbakefall av sykdommen etter behandling og høy forekomst av cellegift-motstand. Biologi EOC er dårlig forstått og forbedringer i diagnostikk og behandling er svært ønskelig [12]. Ovarian karsinomer er ofte preget av Karyotyper med alvorlig Aneuploidy grunn av kromosom ustabilitet (CIN) og triploidization [13]. Det har blitt foreslått at Aneuploidy er en funksjon i tidlige avvik i EOC [14]. Aneuploid svulster svare mindre gunstig behandling enn diploide tumorer, som fører til lavere overlevelse [15].
NUMA1
genet kart til kromosom 11q13 [16], en region ofte forsterket i eggstokkreft [17]. Men så vidt vi vet ingen publikasjoner har knyttet Numa uttrykk for Aneuploidy i EOC. Vi analyserte Numa nivåer i primærkulturer av ondartede celler avledet fra eggstokkene ascitisfluider, i tilhørende tumorvev, i vev fra ubeslektede primære ovarietumorer og i normal eggstokkvev hjelp Affymetrix rekke analyse, slot blotting, IHC og immunfluorescens (IF). Numa uttrykk ble funnet å være oppregulert i tumorprøver sammenlignet med normale kontroller. IF analyse av primærkulturer identifisert en sammenheng mellom økte mengder Numa på spindel stolper og priser av binucleation og multinucleation, mens FACS analyse viste en positiv sammenheng mellom økt Numa uttrykk og Aneuploidy. Denne studien viser for første gang at Numa uttrykk er oppregulert i EOC og at dette er knyttet til Aneuploidy sett i denne kreftformen.
Resultater
Affymetrix microarray analyse
Eksamen av Affymetrix microarray data fra et panel av eggstokkreft cellelinjer, primære kulturer og tumorvev viste at Numa var konsekvent over-uttrykt på et transkripsjonsnivået sammenlignet med normal eggstokkvev. Bare to ascitiske prøvene hadde lavere ekspresjonsnivåer i forhold til en intern kontroll normal (N) (figur 1A). Dette innledende arbeidet antydet at videre studier av Numa uttrykk i EOCs var berettiget.
A. Affymetrix data som viser NUMA over-uttrykk i 6 eggstokkcellelinjer (JAMA-2, iove (ekstra udødelig eggstokkene epiteliale cellelinje), Skov-3, TR175, OVCA-433 (i tillegg) og 1847 (alle grå barer, betegnet CL) , 38 prøver av primære celler dyrket fra ascitesvæske (svarte striper, utpekt – A, inkludert noen prøver med påfølgende samlinger eller passasjer) og 4 primærkulturer etablert fra svulstvev (betegnet T1 til – T4) A1, A2 og A4 er. tumorvev (T1, T2, T4) er forbundet ascites prøver. intensitetsverdier oppnådd for prøvene ble normalisert til en intern kontroll (normal epitel ovarievev (N)) og genekspresjon nivåer er vist som forholdet mellom intensitetsnivåer /styre intensitetsnivå som en log10 verdi. B. Numa nivåer i cellelysatene. et representativt eksempel på en lysates analysert for Numa uttrykk ved sporet blot Svart asterix indikerer eggstokkcellelinjer (1847, TR175, JAMA-2), brun asterix den neuroblastom cellelinje SH- SY5Y, rosa asterix kolon adenokarsinom cellelinje SW480, blå asterix livmorhalskreft cellelinje HeLa, og gul stjerne brystkreft cellelinje MCF7. Alle andre prøver er lysatene fra eggstokkene primærkulturer. C. Histogram sammenligne Numa nivåer i eggstokkene cellelinjer, en primær cellelinje avledet fra en godartet gynekologisk lidelse (1153-A1) og primærkulturer etter normalisering mot α-tubulin. D. Seksjon for normal (N) eggstokkreft epitelial og stromal vev og matchet eggstokkreft (Ca) på x10 og x40 forstørrelse etter Numa farging. Pilene viser epitelceller. Lav til middels nivåer av nukleær Numa farging kan sees i de normale epitelceller, med høyere nivåer av nukleær farging Numa i eggstokkreft epitelceller. E. Analyse av en liten ovarian TMA viser at Numa fargeintensitet øker med karakter i eggstokkene svulstvev.
Slot Blotting
I alt 35 prøver ble analysert ved slot blotting. Denne kohorten besto av 7 etablerte cellelinjer (JAMA-2, TR175, 1847, SW480, MCF-7, HeLa og SH-SY5Y), en godartet prøve (1153-A1) og 25 primærkulturer. Lysates innhentet fra 2 eggstokkene tumorvev dyrket i vevskultur (BE4163-T1 og AQ70880-T1) ble også inkludert. Et representativt eksempel på et spalt-avtrykks-bilde av noen av prøvene er vist i figur 1B. Normalisering mot en intern α-tubulin kontroll bekreftet at det var variasjon i Numa protein nivåer mellom prøvene som ble testet (figur 1C). Blant de cellelinjer, 1847 hadde den høyeste Numa uttrykk nivå, etterfulgt av TR175 og JAMA-2. Den godartet prøve 1153-A1 hadde en middels NUMA nivå, mens det var variasjon blant de primære ascites kulturer med 3 (1141-A1, 1134-A1 og AE6792-A1) som uttrykker de høyeste Numa nivåer av alle prøvene. Ingen signifikant sammenheng mellom Numa immunoblottingforsøk resultater og de tilhørende kliniske data ble sett. Betryggende, Numa protein nivåer generelt samsvarer godt med RNA uttrykk nivåer sett for de primære kulturer og eggstokkene cellelinjer undersøkt av Affymetrix microarray analyse.
Immunohistochemistry
Farging indikerte at Numa uttrykk i hele seksjoner av normal ovarievev var variabel, som strekker seg fra meget lav til svak nivåer i stromale og epiteliale cellekjerner (n = 7) (figur 1D). For de 5 tilfeller av normalt vev med tilhørende svulstvev, ble en klar økning i Numa uttrykk i 40% (2/5) av tumorprøver identifisert. Opp til 95% av kjerner i primærsvulster vises medium til sterk Numa farging (figur S1A-d). Numa ble også observert på spindel polene av mitotiske tumorceller (figur S1b, pil). Analyse av en liten internt genererte eggstokkreft TMA viste at 95% av tumorcellekjerner ble positivt farget for Numa i 24 av 25 kjerner. Påfallende, analyse av data etter påføring av et poengsystem som deles prøvene til lav Numa (alle negative, veldig svake og svake score) og høye Numa nivåer (middels og høye poengsummer) viste at høye Numa nivåer ble bare påvist i klasse 3 svulster (33%; figur 1E). Farging av et større ovarial TMA bekreftet lav og høy ekspresjon Numa mellom kjernene (figur 2). Innledende analyse av de samlede data uavhengig av kreft subtype viste at høye Numa nivåene økte med svulst Karakter (fra 20,3% for klasse 1 svulster til 24,1% for karakteren 3 svulster,
p
= 0,0016) og sykdom scenen (en øke fra 19,6% for stadium 1 til 33,3% for stadium 4,
p
= 0,0077) (data ikke vist). Analyse av kontinuerlige data for svulst klasse og stadium av sykdommen, som inkluderte inndeling i krefttyper som nok data var tilgjengelig (serøs, mucinous og endometrioid), indikerte at Numa uttrykk korrelert med økende grad i mucinous subtype (
p
= 0,009) (figur 3A). En signifikant korrelasjon med spredning til lymfeknuter (
p
= 0,03) (figur 3B) og alder (
p
= 0,04) (figur 3C) ble sett i alle undergrupper. Videre analyse av resultatene som usammenhengende data (lav Numa vs høy NUMA) viste flere statistisk signifikante assosiasjoner. Andelen av prøver med høye Numa nivåer redusert med Karakter (
p
= 0,02) (Figur 3D) og økt i slutten av sykdom stadium i serøs EOC (
p
= 0,04) (figur 3E) . I mucinkjertler EOCs, Numa nivåene økte med Karakter (
p
= 0,005) (figur 3F). I sent stadium endometrioid EOCs, redusert Numa uttrykk (figur 3G) og høy Numa redusert med en økning i tumorinvasjon status (
p
= 0,03) (alle undergrupper) (figur 3 H). Lav Numa uttrykk ble observert i hele utvalget befolkning på 13 klare celle EOCs uavhengig av sykdomsstadiet.
Lave og høye Numa fargemønstre observert i kjerner fra serøs, mucinous, endometrial og klare karsinomer i stor skala eggstokkreft TMA. Forstørrelse x10.
A. Statistisk analyse av den store eggstokkreft TMA viser Numa uttrykk øker med sykdom stadium i mucinous subtype. B. Numa uttrykk er forbundet med spredning til lymfeknuter (T3cN1MO) (alle undergrupper). C. Numa uttrykket er assosiert med pasientens alder (alle undergrupper). D. Høye nivåer av Numa avta med svulst karakter i serøs subtype. E. Høy Numa nivåer er assosiert med stadium 4 sykdom i serøs EOCs. F. Høy Numa nivåene øker med svulst karakter i mucinkjertler EOCs. G. Høy Numa nivåer reduseres med sykdom stadium i endometrioid EOC. H. Høy Numa nivåer reduseres med tumorinvasjon status (T1 til T3) (alle undergrupper).
immunfluorescens Analyser
Hvis analysen avslørte eksistensen av en interatom Numa fargemønster i alle cellelinjer, en primær kultur tilpasset som en cellelinje (GYNA0089) og 23 primære kulturer (figur 4A, B). I mitose ble Numa funnet på spindel staver (Figur 4C) i alle cellelinjer og primærkulturer undersøkt. Tilstrekkelig antall mitotiske celler for videre analyse ble identifisert i 16 primærkulturer. I disse prøvene delende celler ble undersøkt for mitotisk staging og tilstedeværelsen av spesifikke mitotiske defekter. Til slutt ble en undersøkelse av interfase indikatorer på Aneuploidy utført i alle prøvene.
A. Eksempler på interfase kjerner med lav (a-d) og høy (e-h) NUMA nivåer, og mitotiske spindler med lav (i-l) og høy (m-s) numa nivåer ved spindel polene. Grønn – Numa, rød – a-tubulin, blå – DAPI. Scale bar = 5 mikrometer. B. Histogram sammenligne Numa atom fluorescens fargeintensitet i fire eggstokkreft cellelinjer, en cellelinje etablert fra en primær kultur (GYNA0089) og 23 primærkulturer avledet fra ascitesvæske. C. Histogram sammenligne Numa fargingsintensitet på spindel polene i undergruppe av cellelinjer og kulturer hvor et tilstrekkelig antall mitotiske celler var for analyse.
Farging intensiteter skilte seg blant prøvene (figur 4). Det ble bemerket at noen av prøvene var sammensatt av celler med lavt nivå Numa farging i interfase kjerner og ved mitotiske spindel poler (figur 4A, a-D- og I-l, 4B, C) og noen prøver ble sammensatt av celler med høy NUMA farging intensiteter (figur 4A, e-h og m-p; figur 4B og C). Vi har også bemerkes at hver prøve var forskjellig med hensyn til hvor stor andel av cellene på hvert mitotisk trinn, og at de oppviste et bredt spekter av mitotiske defekter. Disse inkluderte meta defekter som Tripolar og multipolar spindler (figur 5A, a-d) og spindel forskyvning (figur 5A, e); anaphase defekter som henger kromosomer og kromosom bridging (figur 5B, a-c); og cytokinetic mangler inkludert kromatid brodannelse og dannelse av ulikt dimensjonerte datterceller (figur 5C, a-d). Binucleation, multinucleation og nærværet av mikrokjerner var vanlige defekter i interfase-celler (figur 5D, a-c). De eksemplene som er vist i figur 5E var de mest vanlige mitotiske feil observert.
A. Mitotiske defekter ved meta inkludert (a) asymmetrisk bipolar spindler (b) flere spindel stolper, (c) Tripolar spindler, (d) bipolare spindler med flere spindel polene (e) celler med forlagt og feiljustert spindler (celle periferien skissert). B. Mitotiske defekter på anaphase inkludert henger kromosomer og anaphase bridging (a -c). C. Mitotiske defekter under telophase og cytokinese inkludert (a) unormale spindler, (b) unormal cytokinese med mikronuklei dannelse, (c), kromatid bygge bro og (d) dannelse av ujevnt størrelse datterceller. D. Eksempler på (a) binucleation, (b) multinucleation og (c) mikrokjerner i primære kulturer. Grønn – Numa, rød – a-tubulin, blå – DAPI i alle paneler. Scale bar i A og B = 5 mikrometer. Målestokken i C og D = 10 um. E. Pie skjema som illustrerer den generelle hyppigheten av mitotiske defekter i primærkulturer.
En sammenligning av Numa fargeprofiler til mitotiske data ble utført. Høye nivåer av Numa i interfase kjerner var signifikant assosiert med en liten andel av celler i telophase (
p
= 0,012) og en høy andel av celler som viser en løs metafase-plate (
p = 0,032
) (figur 6A og B). Høye nivåer av Numa på mitotiske spindel polene signifikant korrelert med høy forekomst av binucleation (
p =
0,021) og multinucleation (
p =
0,007) (figur 6C og D) og igjen med løs meta plater (
p =
0,041) (figur 6E). Lave nivåer av Numa på spindel polene signifikant korrelert med en høy andel av celler i cytokinese (
p =
0,05) (figur 6F). Interessant, middels nivå av Numa den spindel polene signifikant korrelert med lave feilrater i cytokinese. (
p =
0,01) (figur 6G). For ytterligere å verifisere data som er observert i vårt immunofluorescensanalyse av de primære kulturer vi immunostained hele deler av fast tumor-vev fra 23 pasienter med ascitisk væske ble anvendt for å generere kulturer. Dette bekreftet at solide svulster viser høye nivåer av Numa flekker generert primære ascitiske kulturer hvor celler viste høy Numa uttrykk nivåer (Figur S1 a-d). For å forsikre seg om at den observerte inter og mitotiske defekter var også et felles trekk ved de tilhørende tumorvev vi analysert 23 tumorsnitt tilgjengelig for oss ved Numa farging og H E IHC farging. Vi har lagt merke til at de samme interfase og mitotiske defekter var til stede i disse tumorene som i ascites prøvene. Representative bilder og en oppsummering av de defekter mellom prøvene er vist i figur S2A-D. Dessuten ble cellekulturer med en høy mitotisk indeks funnet å vise høy mitotisk aktivitet i den tilknyttede tumorvevet (figur S3). Til slutt, vi utforsket forholdet mellom Numa uttrykk nivåer i primærkulturer og pasient overlevelse. Dette antydet at pasienter med moderat til sterk Numa farging den spindel polene i primærkulturer har en lavere overlevelse enn pasienter med svak NUMA farging, selv om dette foreløpige data nådde ikke statistisk signifikans (figur S4), kanskje på grunn av lav utvalgsstørrelse.
Sterk kjernekraft Numa uttrykk ble assosiert med (A) den laveste andelen av telophase celler og (B) den høyeste andelen av celler med en diffus metafase plate. Sterk Numa spindel pol merking var assosiert med høy forekomst av (C) binucleation, (D) multinucleation, (E) en diffus metafase plate og (F) den laveste andelen av celler i cytokinese. (G) Mellom spindel pol farging ble assosiert med lavest andel av celler som utviser en cytokinese defekt. (H) FACS analyse viste at bare celler med høye nivåer av Numa var aneuploid.
FACS
FACS analyse indikerte at bare celler fra primære kulturer med høy Numa spindel pol fargingsintensitet var aneuploid (figur 6 H), en statistisk signifikant observasjon (
p =
0,008).
Diskusjoner
i denne studien har vi som mål å undersøke
NuMA1
uttrykk i EOC og relatere dette til Aneuploidy funnet i denne krefttypen. En innledende Oncomine søk indikerte at Numa uttrykk er oppregulert i EOC. Våre pilot data generert av Affymetrix profilering også foreslått at
NuMA1
uttrykk ble oppregulert i eggstokkreft. Vi bekreftet denne observasjonen på proteinnivå ved IHC, og bemerker at atom Numa var til stede i lave nivåer i kjernen av normal eggstokk stroma og epitel mens eggstokkene primære svulster hadde forhøyet Numa nivåer. Høye nivåer av Numa var assosiert med svulst klasse, sykdom scenen, og spredning til lymfeknuter og omvendt til tumorinvasjon. Men ulik Numa uttrykk blant de fire store EOC subtyper. Mens Numa nivåer redusert med svulst klasse og økte med sykdom stadium i serøs subtype, økte de med svulst karakter i mucinous subtype og redusert med sykdom stadium i endometrioid subtype. I den klare celle subtype ble observert bare lave nivåer av Numa. Disse forskjellene er gjenspeiler sannsynligvis den molekylære heterogenitet av EOCs. Nylig EOCs er reklassifisert i henhold til deres molekylære funksjoner i type I (lav karakter serøs, lav karakter endometrioid, alle mucinkjertler og klare karsinomer) og type II (høy klasse serøs og endometrioid karsinom) med mutasjoner i hovedsak i
KRAS
og
PTEN
i type i og mutasjoner i
TP53
i type II [25], [26]. Numa nivåer i vår studie var høyest i type I EOCs (lav karakter serøs og mucinkjertler kreft), noe som tyder på Numa overekspresjon kan være et tidlig hendelse i kreftutvikling.
Ondartede celler avledet fra ascitisfluider har blitt brukt i det siste å generere et vell av informasjon om immunologi og terapi i EOC, og det har blitt foreslått at deres bruk kan utfylle vanlige diagnostiske prosedyrer [27]. Her IF studiet av primærkulturer tillates en ny og detaljert undersøkelse av bevis for Aneuploidy gjennom identifisering av både spesifikke mitotiske defekter og er mellom konsekvensene av slike feil. Interessant, har vi funnet at høye Numa nivåer på spindel polene var assosiert med høye nivåer av binucleation og multinucleation. Utviklingen av tetraploidy som følge av mislykket cytokinese representerer en potensiell tidlig begivenhet i utviklingen av kromosom ustabilitet (CIN) og til slutt aneuploide Karyotyper i kreftceller [10]. Mitotiske defekter som vi observerte i våre primære kulturer, for eksempel multipolar spindler og mangler i cytokinese, kan forklare forekomsten av binucleated og multinucleated cellene i disse prøvene. I samsvar med dette, har vi også funnet en statistisk signifikant sammenheng mellom Aneuploidy og høye nivåer av Numa på spindel polene i våre kulturer.
Etter å ha fastslått at Numa protein nivåer er oppregulert i EOC, og at dette er forbundet med Aneuploidy, neste skritt vil være å bestemme den funksjonelle medvirkning av Numa i utviklingen av denne Aneuploidy. Arbeid fra andre forskere har vist at betinget uttrykk for Numa i en muse myeloide cellelinjen resultater i Aneuploidy og apoptose [28]. Det ble foreslått at Numa overekspresjon alene var ikke tilstrekkelig til å drive malign transformasjon i leukemiceller, men at det kan bidra til kromosom ustabilitet, noe som gir genetiske hendelser som fremmer cellesyklusprogresjon eller beskyttelse mot apoptose å skje. En slik hendelse kan være oppkjøpet av p53 mutasjoner, for eksempel de som ble observert i høy grad serøs karsinom [29]. Alternativt samhandler Numa med motoren protein dynein under mitose, og det har vært antydet at metning av dynein aktivitet ved Numa overekspresjon kan motvirke trasé som kreftcellene bruker for å løse problemer som multipolar spindler. Disse vanligvis oppstår på grunn av tilstedeværelsen av overtallige centrosomes, som fører til en økning i genom ustabilitet drevet av defekter i mitose [30]. Denne hypotesen kan være aktuelt for EOC siden de biologiske konsekvensene av multipolar celledelinger er konsistent med resultatene observert i vårt immunfluorescens arbeid. Centrosomal forsterkning har også tidligere blitt bemerket i EOC celler og har vært knyttet til Aneuploidy og dårlig pasient utfall i serøs EOC. Dette fenomen synes å være forårsaket av overekspresjon av Aurora-A, et medlem av serin /treonin-kinase-familien som er involvert i mitotiske arrangementer [31], [32].
tumorantigen akrosin bindende protein (ACRBP) /OY-TES-1, er blitt vist å interagere med Numa. En co-avhengige forhold med en rolle i paclitaxel motstand i EOC er blitt foreslått [33]. Numa overekspresjon ble foreslått å forårsake mitotiske forstyrrelser som kreves for plastisitet av preneoplastiske genomet, med co-utvikling overekspresjon av ACRBP som svulster fremgang kjører oppkjøpet av egenskaper for normalisering av disse tidlige forstyrrelser som ellers kan være uheldig for kreftcelle spredning ved å fremme mitotisk katastrofe. Den samme studien viste også at de fleste aggressive sykdommen blant en kohort av EOC pasienter ble assosiert med kombinert høye nivåer av ACRBP og Numa. Muligheten for at Numa overekspresjon virker synergistisk med Aurora-A og ACRBP overekspresjon å fremme Aneuploidy, dårlig overlevelse og chemoresistance i EOC er spennende og verdig videre etterforskning. Som en del av dette, er våre foreløpige data tyder på at Numa uttrykk nivåer assosiert med overlevelse i EOC vil bli videre undersøkt i et større utvalg satt til å finne ut om dette fenomenet er statistisk signifikant.
I konklusjonen, viser vår data for første gang at Numa er overuttrykt i EOC og at høye Numa nivåer korrelerer med økt mitotiske feil og Aneuploidy i ascites kulturer avledet fra pasienter med ovarietumorer.
Materialer og Metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og Primær kulturer av Ondartede celler avledet fra eggstokk~~POS=TRUNC ascitisfluider
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP som brukes i dette prosjektet inkluderte fire eggstokkreft cellelinjer (JAMA-2, Skov-3, TR175 og 1847), en neuroblastom cellelinje (SH-SY5Y) , en kolon adenokarsinom-cellelinje (SW480), en livmorhalskreft cellelinje (HeLa) og en brystkreftcellelinje (MCF7). Cellelinjer ble innhentet fra Cancer Research UK, ECACC og ATCC cellebiologi Collection. Primære kulturer av celler avledet fra eggstokkene ascitisfluider (GYNA0089), eggstokkene tumorvev (BE4163-T1 og AQ70880-T1) eller godartede svulster (1153-A1) ble etablert som tidligere beskrevet [18]. Pasientinformasjon og kliniske data for eggstokkreft ascitisfluider har tidligere blitt beskrevet [18].
Normal Ovarian og Tumor Tissue
Patologisk eksemplarer av formalin faste, parafin innebygd vev som består av deler av normal eggstokk vev og primære svulster (inkludert svulster som produserte ascites som primærkulturer var forberedt) ble hentet fra St James «s University Hospital Histopatologi Arkiv, Leeds. Syv normalt vev var tilgjengelig, 5 som også var forbundet tumorprøver. I alt 23 tumorvev som samsvarer med primærkulturer avledet fra maligne celler ble oppnådd. Ytterligere 25 urelaterte primære ovarietumorer med tilhørende kliniske data ble identifisert og brukt til å lage en mini vev microarray (TMA) i huset. Den TMA består av 9 serøse adenokarsinomer, 6 endometrioid karsinom, 2 mucinkjertler, 2 blandet Mullerian, 5 blandet serøs og endometrioid, og en adenokarsinom. En høy tetthet eggstokkreft TMA består av 280 tilfeller av eggstokkreft adenokarsinom (serøs, mucinous og endometrioid), 13 klarcellet karsinom, en overgangsordning celle carcinoma, 20 tilstøtende normalt vev og 8 normalt vev i to eksemplarer, med scene og klasse informasjon ble innhentet fra Tissue Array Networks (OV6161, Tissue Array Network). Medfølgende kliniske data inkludert pasientens alder, spredning til lymfeknuter, tumorinvasjon og metastasering.
Pasientdata
tilknyttede kliniske opplysninger for pasienter som primærkulturer av ondartede celler avledet fra eggstokkene ascitisfluider ble etablert, ble beskrevet tidligere [18].
Affymetrix Profilering
data for eggstokkreft cellelinjer, primære kulturer og tilknyttede tumorprøver ble hentet fra en genekspresjon microarray analyse, generert med Genechip HG-U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix) som ble normalisert ved hjelp av MAS 5.0 som tidligere beskrevet [18].
antistoffer
Numa monoklonalt antistoff Ab-2 (klon 107-7, Calbiochem) ble brukt i denne studien . Dette har tidligere vært mye brukt for Western blotting, immunfluorescens og IHC [19], [20]. For IF studier rotte-anti-α-tubulin-antistoff (1/500, MCA77G, Serotec) ble brukt til å identifisere mikrotubuler og 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI 5 ug /ml, Sigma-Aldrich) brukes til å farge DNA .
Slot Blotting
Slot blotting av cellelysatene ble utført som tidligere beskrevet [18]. 0,01 mg av prøven ble lagt i hver brønn og Numa monoklonalt antistoff Ab-2 ble brukt på en 1/400 fortynning.
TMA Construction
For å skape en in-house eggstokkene TMA en protokoll beskrevet av Abd El-Rehim
et al product: [21] ble fulgt. Manuelle vev arrayer slag med en diameter på 0,6 mm (Beecher Instruments, Inc) ble brukt til å lage kjernene.
Immunohistochemistry
Lysbilder inneholder hele seksjoner eller TMA kjerner ble blokkert med 3% H
2o
2 i metanol etter de-voksing og rehydrering. Antigen henting ble utført ved trykk matlaging lysbilder i 2 minutter i Antigen avsløre Solution (lav pH, Vector Laboratories). Etter tre 5 minutters vaskinger i TBS-Tween-20 (0,2%) lysbildene ble blokkert i 10 minutter med 10 x kasein (Vector Laboratories) fortynnet 1:02 i destillert vann. Etter tre fem minutters vasker med TBS Tween-20 lysbilder som inneholder hele seksjoner ble plassert i Shandon sequenzer enheter mens lysbilder som inneholder TMA snitt ble lagt flatt inne en fuktet inkubasjon kammer for inkubasjon med det primære antistoff. NUMA antistoff Ab-2 fortynnet i antistoff-løsning (Zymed) ble påført på 1/300 for hele seksjoner og 1/100 for TMA lysbilder. Platene ble inkubert over natten ved 4 ° C. Etter tre vaskinger på 5 minutter hver med TBS-Tween-20 objektglassene ble inkubert i 100 pl kanin HRP /mus REAL ™ EnVision ™ (DAKO) i 30 minutter i sequenzer enheter eller inkubasjon kammer. Etter tre siste vaskinger med TBS i 5 minutter, ble fremkallerløsning (DAB + chromagen /substratbuffer, DAKO) tilsatt i opp til 10 minutter inntil farvefremkallingen var fullført. Farging ble intensivert i 0,5% CuSO4 (i 0,9% saltvann) i 5 minutter. Etter kontra i haematoxylin i 2 minutter, delene var dehydrert og montert i DPX (Sigma). TMA bilder ble skannet og analysert ved hjelp av Aperio ImageScope Viewer programvare. Lysbilder som inneholder hele seksjoner ble sett på med et Olympus BX61 mikroskop med Colourview kamera og CellP® programvare. En merking scoring system, som gjaldt to scoring kriterier ble benyttet [22]. Først, ble antallet fargede kjerner telles og uttrykkes som en prosentandel av det totale antall kjerner i vevet seksjon eller kjerne. For det andre ble det dominerende atom uttrykk intensitet scoret som 0 – ingen farging, 1 – spor, 2- svak, 3- medium og 4- sterk. Sluttresultatet ble beregnet som prosentandelen av fargede kjerner multiplisert med den dominerende uttrykket intensitet.
