Abstract
Kjemoterapi og anti-hormonell behandling er de vanligste behandlinger for ikke-organ-begrenset prostatakreft (PCA). Imidlertid er effektiviteten av disse behandlinger er begrenset, noe som nødvendiggjør utvikling av alternative tilnærminger. Foreliggende studie fokuserte på å analysere rollen til pterostilbene (Pter) -isothiocyanate (ITC) konjugat – en ny klasse av hybridforbindelsen syntetisert ved å føye til en ITC-del på Pter ryggrad – i å regulere funksjonene av androgenreseptoren (AR), for derved å forårsake apoptose av PCA celler. Konjugatmolekyl forårsaket 50% vekstinhibering (IC
50) ved 40 ± 1,12 og 45 ± 1.50 uM i AR positive (LNCaP) og negative (PC-3) -celler, respektivt. Den reduserte spredning av PC-3 og LNCaP-celler etter konjugatet korrelert med akkumulering av celler i G2 /M fase og induksjon av caspase avhengig apoptose. Begge PI3K /Akt og MAPK /ERK stier spilte en viktig og differensial rolle i konjugat-indusert apoptose av disse PCA celler. Mens den hemmer av Akt (A6730) eller Akt-spesifikk liten forstyrrelse RNA (siRNA) sterkt sensibiliserte PC-3-celler til å konjugere-indusert apoptose, tvert imot, ble apoptose akselerert ved hemning av ERK (med PD98059 eller ERK siRNA) i tilfellet fra LNCaP-celler, både til slutt kulminerte i uttrykket av spaltet caspase-3 protein. I tillegg ble anti-androgene aktivitet av konjugatet mediert av redusert ekspresjon av AR og dens ko-aktivatorer (SRC-1, GRIP-1), og dermed blande seg inn i deres interaksjon med AR. Alle disse data tyder på at konjugat-indusert inhibering av celleproliferasjon og induksjon av apoptose blir delvis formidlet ved nedregulering av AR, Akt, og ERK-signalering. Disse observasjonene gir en begrunnelse for å utforme nye terapeutiske tilnærminger for behandling PCa ved hjelp konjugat alene eller i kombinasjon med andre behandlingsformer
Citation. Nikhil K, Sharan S, Chakraborty A, Roy P (2014) pterostilbene-Isothiocyanate konjugat undertrykker Vekst av prostata kreft celler Uavhengig av androgen Receptor Status. PLoS ONE 9 (4): e93335. doi: 10,1371 /journal.pone.0093335
Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan
mottatt: 30 september 2013; Godkjent: 03.03.2014; Publisert: 03.04.2014
Copyright: © 2014 Nikhil et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra Rådet for industriell og teknisk forskning og Ministry of Human Resources and Development (MHRD), Government of India som stipendiatstillinger til kN og prosjektassistant til PR, henholdsvis. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Videre PR ønsker også å tank andre virkemiddelaktører, Institutt for bioteknologi (BT /PR14836 /AAQ /01/455/2010) og Institutt for vitenskap og teknologi (SR /SO /HS-39/2009) for sin økonomiske støtte. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for betydelige innsatsen som er gjort mot ablasjon av kreft, prostatakreft (PCA) er den hyppigst diagnostisert kreft og den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn i USA, med anslagsvis 217,730 nye tilfeller og 32 050 dødsfall i 2010 [1]. Selv om etiologien av PCa forblir ukjent, forhøyede nivåer av steroidhormoner, slik som androgener og østrogener, så vel som vekstfaktorer, slik som insulin-lignende vekstfaktor 1, anses å være viktige risikofaktorer [2] – [4]. Androgen ablasjon har en første reaksjon, men de fleste pasienter med fremskreden PCa hvert utvikle resistens overfor denne terapi og utvikler seg til hormon ildfast prostatakreft (hrpc), for hvilken det ikke finnes noen helbredende terapi [5]. Mangel på effektive behandlingstilbud for forvaltningen av hrpc forsterke behovet for å utvikle nye forbindelser som virker enkeltvis eller i kombinasjon.
Androgen og AR funksjoner spille en sentral rolle i kreftutvikling og progresjon av PCA samt i normal prostata utvikling [6], [7]. Handlingene til androgener, for eksempel testosteron og dihydrotestosteron (DHT) er mediert ved AR, som er et medlem av den nukleære reseptor superfamilien ligand-avhengige transkripsjonsfaktorer [8]. I tillegg til androgen, kan AR-aktivitet også modifiseres ved molekyler i andre cellesignalveier. Opp regulering av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) og etterfølgende økning i ekstracellulære regulerte kinase (ERK) og Akt-signalering, er implisert i progresjon PCa [9]. Akt regulerer AR signalveien ved fosforylering og /eller transkripsjonen regulering av AR. Akt phosphorylates AR på seriner 210/213 og 790/791 og transaktiverer endelig sin aktivitet. En tidligere studie viste at inhibering av Akt pathway opphever HER-2 /neu-indusert AR signaleringsaktivitet [10]. Disse resultater antyder at Akt er en aktivator av AR som kreves for androgen-uavhengig overlevelse og vekst av PCA-celler. Forskning har vist at inhibering av en eller begge av disse banene har en mer dyptgående effekt på tumorcelleutvikling og død, noe som gjør dem attraktive kombinatoriske mål i PCa terapi. Derfor, AR, Akt og ERK kan være potensielle mål for behandling av PCa.
Bioaktive mat komponenter, i særdeleshet, er i økende grad blir vurdert som potensielle PCA chemopreventive midler på grunn av deres antatte sikkerheten [11]. En slik forbindelse er pterostilbene (Pter), en naturlig forekommende dimetyleter analog resveratrol (RESV), som har høyere oral biotilgjengelighet og forbedret styrke sammenlignet med RESV [12]. Flere studier har vist at Pter kan hemme veksten av en rekke hormonresponsiv kreft, for eksempel brystkreft [13] – [15] og PCa [14], [16] – [18] både
in vitro og
in vivo
. Selv om anti-metastaserende, anti-tumor og anti-leukemiske egenskaper Pter har blitt godt etablert i brystkreft, det er begrenset rapporter om virkningen av Pter i spredning av PCA celler indusert av steroidhormoner [16]. Tilsvarende er isotiocyanater (ITCS) naturlig forekommende, med lav molekylvekt, organiske forbindelser med den generelle formel R-NCS [19]. Disse chemoprotective agenter er funnet i et bredt utvalg av cruciferous grønnsaker som brokkoli, blomkål, kål, rosenkål og grønnkål [20]. Epidemiologiske studier har antydet at økt inntak av cruciferous grønnsaker kan være beskyttende mot PCa risiko [21] – [24]. Men til tross for overbevisende epidemiologisk sammenheng, er aktiviteten til ITCS mot PCA celler som ennå ikke er systematisk vurdert. Siden de enkelte rollene Pter og ITC har allerede vært innblandet i PCA ment vi å utvikle et konjugat av Pter-ITC på jakt etter potente anti-kreft molekyler. Konjugatet ble utarbeidet ved å legge ITC inneholder thiosemicarbazide pharmacophore med Pter ryggrad som beskrevet tidligere [25]. Overraskende, Konjugatmolekyl når de ble testet in vitro, viste effektiv cytotoksisitet i rekke kreftcellelinjer på relativt lavere dose sammenlignet med dens opphavsforbindelsen dvs. Pter [25]. Videre vår studie viste at den anti-proliferative aktivitet av konjugatet mot humane brystcancercellelinjer var på grunn av dens evne til å stanse celler i G2 /M fase og aktiveringen av caspase, og også korrelert med blokade av Akt og ERK signalveier [ ,,,0],25].
i denne studien undersøkte vi detaljert effekt og molekylære virkningsmekanismer av Pter-ITC konjugat ved hjelp av androgen-avhengige (LNCaP) og androgen-uavhengig (PC-3) PCA celler. Videre har vi også sammenlignet effekten av Pter-ITC konjugat med moderforbindelsen av Pter dvs. RESV. Vår undersøkelse således identifiseres den nyutviklede konjugatet for å være en potent AR-inhibitor som sterkt svekker veksten av PCA-celler in vitro ved å modulere AR ekspresjon, så vel som regulering av cellesyklusprogresjon og apoptose.
Materialer og Metoder
reagenser
All celle kultur reagenser ble oppnådd fra GIBCO (Invitrogen, CA, USA), med mindre annet er oppgitt. Penicillin, streptomycin, MTT (3- (4, 5-dimetyl-2-tiazolyl) 2,5diphenyl-2H-tetrazoliumbromide), cellekulturkvalitet dimetylsulfoksid (DMSO), agarose og alle analytisk kvalitet kjemikalier var fra HiMedia (Mumbai, India ). Omvendt transcription- polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) kits var fra Genei (Bangalore, India). RESV, Pter, DHT, akt1 /2 kinase inhibitor, PD98059 (ERK-hemmer), Z-VAD-FMK (pan caspase-hemmer), Z-LEHD-FMK (caspase-9 spesifikk hemmer), Z-IETD-FMK (caspase- 8 spesifikk hemmer) og BCA protein estimerings kits var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Polyfect transfeksjon reagens ble kjøpt fra Qiagen (Valencia, CA, USA). Pifithrin-α (p53-hemmer), antistoffer for caspase-3, Bax, Akt, p-Akt, ERK, p-ERK, SRC-en, GRIP-1, N-Cor, β-aktin og små interfererende RNA (siRNAs) mot Akt (SC-43609), ERK (sc-35335) og kontroll (SC-37007; negativ kontroll for eksperimenter ved hjelp av målrettet siRNA transfeksjon, hver består av en kodet sekvens som ikke vil føre til at den spesifikke nedbrytning av hvilken som helst kjent cellulær mRNA) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Pter-ITC konjugat ble syntetisert i asymmetrisk syntese laboratorium ved Institutt for kjemi, Indian Institute of Technology Roorkee, India, i henhold til prosedyren beskrevet tidligere [25] og heretter betegnet som konjugat i manuskriptet (Fig. 1a).
(A) Oppbygging av Resveratrol, pterostilbene og pterostilbene-isothiocyanate konjugat. (B) Effekten av konjugat på apoptose av PC-3 og LNCaP-celler som demonstrert ved en representant FACS-analyse ved bruk av Annexin V som markør. (C) Et histogram som viser data for FACS-analyse, hvor resultatene er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. # Og * representerer statistisk signifikant forskjell med hensyn til deres spesifikke kontroller (kjøretøy behandlet) for celler i tidlig og sen apoptose henholdsvis
p
. 0,05
Cellelinjer og kultur
prostata carcinom cellelinjer (AR-positive LNCaP og AR-negative PC-3) og noncancer cellelinjer (CHO og COS-1) ble hentet fra Nasjonalt senter for Cell Science (NCCer), Pune, India. PC-3, ble CHO og COS-1-celler opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), mens LNCaP-celler ble holdt i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (varmeinaktivert) under 5% CO
2 ved 37 ° C. Alle forsøkene ble utført ved anvendelse av LNCaP, PC-3, CHO og COS-1 celler fra passasje under 29, 34, 20 og 30 respektivt. Cellene ble vasket ordentlig før du endrer mediene til steroid-free komplett media før hver behandling med forbindelsene, med mindre annet er oppgitt.
cytotoksisitetsassayer
MTT analysen ble utført som beskrevet tidligere [ ,,,0],25]. I korte trekk ble 5 x 103 celler i 200 ul medium utsådd i 96-brønners plater (Griener, Tyskland
).
Etter 24 timer ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0,1, 1, 10, 100 og 1000 mm) av RESV, Pter og konjugat. Kontrollcellene ble behandlet med 0,1% DMSO (bærerkontroll). De dyrkede celler ble målt etter 24 timer ved tilsetning av 20 ul av 5 mg /ml MTT etterfulgt av inkubering ved 37 ° C i 4 timer. Den MTT inneholder media ble deretter aspirert og 200 mL DMSO (Himedia, Mumbai, India) ble tilsatt for å løse de formazone krystaller. Den optiske tetthet (OD) ble målt ved 570 nm ved bruk av ELISA-plateleser (Fluostar optima, BMG LABTECH, Tyskland). Den prosentvise inhibering ble beregnet som:
doseresponskurve og IC
50-verdier ble erholdt ved ikke-lineær regresjonsanalyse [ikke-lineær regresjon (sigmoidal dose respons med variabel skråning)] med Graph Pad Prism, versjon 5,02 programvare (Graph Pad Software Inc., CA, USA).
Cellesyklus syklus~~POS=HEADCOMP distribusjon og apoptose analyse av flowcytometri
Cellesyklus syklus~~POS=HEADCOMP distribusjon og Annexin V /propidiumjodid (PI) positive celler analysert ved hjelp av strømningscytometri. I korte trekk første cellene ble sådd og behandlet med 0, 10, 20 og 40 uM konjugatet i komplett medium i 24 timer. Dette ble etterfulgt av trypsinizing og fiksering i 70% etanol, og til slutt vasking med PBS. Deretter ble cellene behandlet med RNase A (50 ug /ml), farget med PI (50 ug /ml) og inkubert i mørke i 30 minutter ved romtemperatur og analysert ved strømningscytometri for cellesyklusfordeling. For apoptose ble konjugerte behandlede celler farget med Alexa-Fluor 488-konjugert Annexin-V med Vybrant-apoptose analysesett fra Invitrogen (USA) i henhold til produsentens protokoll. De fargede cellene ble deretter analysert ved fluorescens aktivert celle sortering (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og dataene ble standardisert ved hjelp Cell quest 3.3 software.
Caspase Assay
caspase aktivitet ble bestemt ved hjelp ApoTarget caspase kolo protease analyse sampler kit (KHZ1001; Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, både PCA-celler ble behandlet med økende doser av konjugat og RESV i 24 timer. Cellene ble deretter samlet, vasket i PBS og lysert i 50 ul lyseringsbuffer på is i 10 min. Etter sentrifugering ble supernatanten inneholdende 150 ug protein ble inkubert med 200 pM av caspase-3 (Ac-DEVD-pNA), caspase-8 (Ac-IETD-pNA) og caspase-9 (Ac-LEHD-pNA) substrater henholdsvis i reaksjonsbuffer ved 37 ° C i 1 time i 96-brønners flatbunnet plate. Nivåer av utgitt pNA ble deretter målt ved 405 nm bølgelengde med ELISA plateleser (Fluostar optima, BMG Labtech, Tyskland). Den sammenleggbare økning av caspase-3, -8, -9 og aktiviteter ble bestemt ved direkte sammenligning med nivået av un-induserte kontroll. For kaspaseinhibitor-analyse ble celler forbehandlet med en syntetisk pan-kaspase-inhibitor (Z-VAD-FMK), caspase-8-inhibitor (Z-IETD-FMK) og caspase-9-inhibitor (Z-LEHD-FMK) i 1 time før tilsetning av konjugatet og celledød ble analysert ved MTT-analyse som omtalt tidligere.
RT-PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert fra de behandlede celler ved anvendelse av RNA isolering sett oppnådd fra Genei ( Bangalore, India). De ekstraherte RNA prøver ble deretter kvantifisert og lik mengde av de enkelte behandlinger ble transkribert ved hjelp av en RT – PCR kit fra Genei (Bangalore, India) i henhold til produsentens anvisninger. PCR ble utført med denaturering ved 94 ° C i 60 sekunder, annealing ved forskjellige temperaturer (avhengig av primerparene benyttes) i 45 s og forlengelse ved 72 ° C i 2 minutter, etterfulgt av antall sykluser for forsterkning. Primere for BCL-2, BCL-XL, Bax, AR og β-Actin ble utviklet med hjelp av Primer 3 programvare og standardisert i laboratoriet. PCR-produktene ble deretter separert på 2% agarosegel og visualisert i en gel dokumentasjonssystem (Bio Rad, USA). Intensiteten av båndene på agarosegeler ble analysert ved hjelp av ImageJ 1,43 programvare (NIH, USA) og normalisert med hensyn til p-aktin PCR-produktene. Hver av RT-PCR ble utført tre ganger. Tabell S1 viser primersekvensen, produktstørrelse, glødetemperatur, og antallet sykluser som brukes for alle primere.
Immunofluorescence Farging
For immunfluorescens farging, LNCaP-celler ble vasket med PBS, fiksert i tre % paraformaldehyd, permeabilisert med 0,1% Triton X-100 og til slutt blokkert med 1% BSA i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble deretter inkubert med AR kanin polyklonalt antistoff fortynnet 1:200 i blokkeringsbuffer i 1 time ved RT. Til slutt, ble cellene vasket med PBS og inkubert med FITC-merket anti-kanin-sekundært antistoff fortynnet 1:1000 i blokkeringsbuffer i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble så observert under et fluorescens mikroskop (Zeiss, Axiovert 25, Tyskland).
Co-immunoutfelling og Western blot-analyse
LNCaP-celler ble sådd ut i 100 mm kulturskåler og behandlet med konjugat eller DHT i 24 timer. De hel-celle-lysater ble fremstilt som beskrevet tidligere [26] i immunutfelling (IP) buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, og 1% Triton X-100. Protein alikvoter av 500 ug ble deretter inkubert over natten ved 4 ° C ved anvendelse av 2 ug av antistoff rettet mot AR. Protein A-Cl agarosekuler ble deretter tilsatt og ytterligere inkubert i 6 timer ved 4 ° C. Immunopresipitatene ble vasket fire ganger med IP-buffer, og immunkomplekser ble gjenvunnet ved koking i SDS prøvebuffer. Til slutt ble western blot ble utført ved anvendelse av anti-AR, anti-SRC-1 og anti-GRIP-1-antistoffer (Santa Cruz, CA, USA). For western blot-analyse ble cellelysatene fremstilt etter høsting dem i lyseringsbuffer. Omtrent 40 ug totalt protein ble underkastet elektroforese på 12% SDS-PAGE, og Western blotting ble utført ved anvendelse av standardprotokollen. I korte trekk ble analysert proteinene overført til nylonmembraner. Blottene ble deretter blokkert med TBST-buffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM natriumklorid, 0,05% Tween-20) inneholdende 5% skummet melkepulver. De ble deretter vasket med TBST-buffer og inkubert over natten ved 4 ° C med den samme buffer inneholdende passende mengder av primære antistoffer: caspase-3, Bax, Bcl-2, Akt, p-Akt, ERK, p-ERK, AR, SRC -1, GRIP-en (1:500) og β-aktin (1:1000). Blottene ble deretter vasket og inkubert med anti-kanin-sekundært antistoff (1:20,000) konjugert med pepperrot peroksidase (HRP). Fargeutvikling ble utført i mørket ved hjelp av en ECL (Amersham, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). De utviklede blotter ble utsatt for densitometrisk analyse av ImageJ 1,43 programvare (NIH, USA) ved hjelp av β-actin som intern kontroll.
Transfeksjon
LNCaP cellene ble dyrket og transient transfektert med pMMTV-neomycin -luciferase plasmid (300 ng /105 celler) i RPMI media supplert med 10% FBS bruker polyfect transfeksjon reagens (Qiagen, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter, 24 timer etter transfeksjon, er cellekulturmedier ble endret med media inneholdende 5% trekull-strippet FBS for å redusere de forurensende steroider fra serum og inkubert i ytterligere én dag før initiering av behandlingene. Ved PC-3 celler, ble de tilsvarende transfektert, men i tillegg til pMMTV-neomycin-luciferase konstruksjon, ble de også transfektert med pSG5-har-puro plasmid (full lengde hår i pSG5 uttrykk vektor) i forholdet 5: en som angitt ovenfor. For forsøk med co-regulatorer, 50 ng av co-aktivator plasmider (25 ng hver av GRIP-en og SRC-1) sammen med pMMTV-neo-luc (250 ng) ble transfektert til LNCaP celler. For å evaluere transfeksjonseffektiviteten, 500 ng /105 celler av SV40 promoter-Renilla luciferase (PRL-SV40) vektor (Promega Madison, USA) ble ko-transfektert som intern kontroll. Cellene ble deretter behandlet med enten bærer eller forskjellige konsentrasjoner (1-40 uM) av konjugat og /eller 10 nM DHT i 24 timer og luciferase-aktiviteten ble målt i henhold til instruksjonene i den kit (Promega, Madison, USA ). Hvert forsøk ble utført i triplikat og varierte med mindre enn 10%. Verdiene av luciferase for hver lysatene ble normalisert til den Renilla luciferase aktivitet.
For lokaliseringsstudier, ble pEGFP-AR plasmidet transfektert til LNCaP og PC-3 celler (300 ng /105 celler). Cellene ble deretter inkubert med 10 nM DHT med /uten 10 og 20 mikrometer konjugat og overvåkes regelmessig til 12 timer under fluorescens mikroskop (Zeiss, Axiovert 25, Tyskland).
siRNA Transfeksjon
sirnas mot menneske Akt og ERK og kontroll siRNA ble kjøpt kommersielt fra Santa Cruz Bioteknologi (USA). De LNCaP og PC-tre PCA celler ble transfektert med sirnas (til en endelig konsentrasjon på 100 nM) med polyfect transfeksjon reagens (Qiagen, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 24 timer med transfeksjon, ble cellene vasket riktig og erstattet med friskt medium. Cellene ble deretter behandlet med 20 uM konjugat i 24 timer, og endelig protein lysater ble fremstilt ved fullføring av behandlingen. Nivåene av p-Akt, p-ERK og spaltes kaspase-3 uttrykk ble påvist ved Western blot-analyse.
Statistical Analysis
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM og evaluert statistisk ved hjelp av en- veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni
post hoc
test med Graph Pad Prism 5,04 programvare (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). En
p
-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
Hemming av celleproliferasjon ved konjugert
LNCaP (AR positiv ) og PC-3 (AR negative) celler ble dyrket med forskjellige konsentrasjoner av RESV, Pter og konjugat i 24 timer i komplett RPMI og DMEM medier, henholdsvis. Våre data viser at behandling av LNCaP og PC-3-celler med PCA RESV, Pter og konjugat som resulterte i en doseavhengig inhibering av celleproliferasjon. Som vist i tabell 1, i tilfelle av LNCaP-celler, konjugatet resulterte i nesten 50% reduksjon i antallet av levende celler ved 40 ± 1.12 uM mens det var rundt 66,4 ± 1,39 og 82,2 ± 2,19 uM i tilfellet av Pter og RESV behandlede cellene henholdsvis etter 24 timer med behandling. På samme måte, i tilfelle av PC-3-celler IC
50 verdi av konjugat, Pter og RESV ble funnet å være 45 ± 1,50, 75 ± 2,55 og 95,0 ± 1,13 uM henholdsvis etter 24 timers behandling (tabell 1). Videre, når testet i noncancer cellelinjer som CHO og COS-1, ble alle forbindelsene funnet å ha IC
50-verdier over 100 uM konsentrasjon. Således både kreftcellelinjer ble funnet å være mer følsomme for behandling konjugat sammenlignet med Pter og RESV som vist ved den nedre IC
50-verdier på dem alle. Videre vår Resultatet viste at Pter-ITC-konjugat er et potent cytotoksisk middel i både AR AR positive og negative cellelinjer om enn til en marginalt høyere nivå i den førstnevnte i forhold til sistnevnte.
Differential Sensitivity of PC-3 og LNCaP celler til konjugert apoptose
i miljøet av MTT analyseresultatene, utvidet vi vår studie for å undersøke om PCA celler gjennomgår apoptose etter konjugerte behandling ved hjelp Annexin-V /PI dobbel farging analyse og flyt cytometri analyse. Etter PCA-celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av konjugat, ble cellene farget med Alexa Fluor 488-konjugert Annexin V-og PI, som kan vurdere de tidlige og sene apoptotiske cellepopulasjoner. Som vist på fig. 1B, produsert konjugatet en doseavhengig økning i den apoptotiske cellepopulasjonen i både PCA-celler ble studert. Behandling av PC-3-celler med økende doser av konjugat i 24 timer resulterte i en økning i begynnelsen av apoptotiske celler fra omtrent 44% til 68% og sene apoptotiske celler fra 12% til 16% ved 20 og 40 uM-konsentrasjoner, i forhold til kjøretøyet behandlede gruppene henholdsvis (fig. 1B øvre panel). Ettersom PC-3-cellene mangler et funksjonelt p53-protein, var det av interesse å bestemme hvorvidt nærværet av villtype p53 påvirker cellulær følsomhet til celledød forårsaket av konjugatet fordi p53 er kjent for å regulere apoptose i forskjellige stimuli. Vi har løst dette spørsmålet ved å bestemme følsomheten av LNCaP-celler (vill-type p53) i retning mot konjugat-indusert apoptose ved FACS-analyse. Behandling av LNCaP-celler i 24 timer med økende doser av konjugat som resulterte i en gradvis økning av tidlig apoptotiske celler (Annexin V positiv) fra 52% til 72% ved 20 uM og 40, henholdsvis (fig. 1B, nedre panel). På slutten av apoptotiske celler (Annexin V og PI positiv) økte også signifikant fra 8% til 18,5% (fig. 1B, nedre panel) sammenlignet med bare 0,23% av tidlige apoptotiske celler og nesten ubetydelig antall sene apoptotiske celler i den negative kontrollen gruppe behandlet med 0,1% DMSO. Histogrammet i den høyre panel (fig. 1C) indikerer statistisk analyse av tre lignende uavhengige eksperimenter for begge cellelinjer. Interessant, det totale antall av apoptotiske celler var statistisk ikke-signifikant (
p
0,05) mellom LNCaP og PC-3-celler når de ble testet med forskjellige konsentrasjoner av konjugatet, noe som tyder på at p53-protein var ikke involvert i reguleringen av konjugat-indusert apoptose av PCA celler.
konjugert induced Stage Spesifikk Arrest av prostata kreft celler
Basert på vekst og DNA syntese hemmende reaksjoner konjugat i PCA celler, vi neste undersøkt effekten på cellesyklusprogresjon. Som vist på fig. 2A og 2B, behandling av PC-3 og LNCaP-celler med økende doser av konjugat i 24 timer førte til en doseavhengig økning i akkumuleringen av celler i G2 /M fase med samtidig reduksjon i G1 faseceller. I tilfelle av PC-3-celler, er effekten observert ved 40 uM konjugat var størst med ca. 50% av cellene å bli arrestert i G2 /M-fase, sammenlignet med bare 22% i kontrollgruppen (fig. 2A). En lignende trend i G2 /M fase rest ble også demonstrert i LNCaP-celler (35% i de behandlede cellene mot 11% i kontrollceller), selv om den totale populasjonen av cellene ikke kunne nå et høyt nivå på 50% som ble observert i PC-3 celler. Som vist på fig. 2B, konjugatet behandlingen resulterte i en opphopning av 16-35% av celler i G2 /M fase med økende doser av konjugat. Således konjugat-formidlet vekstinhibering av både PC-3 og LNCaP-celler korrelert med G2 /M fase cellesyklus-stans.
Cell syklus fordeling av (a) PC-3 og (B) LNCaP-celler etter behandling med varierende doser av konjugat. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * Betegner statistisk signifikant forskjell med hensyn til kjøretøy behandlede PC-3 og LNCaP-celler som henholdsvis svarer til hver fase av cellesyklusen ved
p
0,05. (C) Virkningen av varierende doser av konjugat (venstre panel) og resveratrol (høyre panel) på kaspase-8, -9 og -3 aktivitet i PC-3 og (D) LNCaP-celler. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * Representerer statistisk signifikant forskjell med hensyn til å kontrollere celler for respektive caspases testet på
p
0,05. (E) Virkningen av kaspaseinhibitorer på konjugat-indusert celledød i PC-3 og (F) LNCaP-celler. Cellene ble forbehandlet med 20 uM av respektive kaspaseinhibitorer: Z-LEHDFMK (caspase-9-inhibitor); Z-IETDFMK (caspase-8-hemmer); og Z-VAD-FMK (generelt kaspase-inhibitor) i 1 time før tilsetning av 20 uM konjugat. Celledød ble målt 24 timer etter behandling konjugatet ved hjelp av MTT-analyse. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * Og # representerer statistisk signifikant forskjell med hensyn til kontroll (kjøretøy) og konjugerte behandlede celler henholdsvis for hver cellelinjer på
p
0,05. ns, ikke-signifikant.
Konjugat Aktiverer Caspase-3 via Caspase-9
Aktivering av både ytre og indre kaspase veier som allerede er kjent for å være de viktigste mekanismer for apoptotiske cellen død i de fleste cellulære systemer. For bedre å forstå de underliggende cellulære trasé for konjugat-indusert død av PCA-celler, ble en mulig rolle av caspase i denne prosessen undersøkt ved å måle aktiviteter av kaspase-8, -9, og -3 i disse tumorceller. Mens caspase-8 og caspase-9 er essensielle proteaser av ytre og indre apoptotiske veier henholdsvis caspase-3 fungerer som nedstrøms effektorer av begge disse banene. Behandling av PC-3-celler med økende doser (10, 20 og 40 uM) konjugat og RESV i 24 timer forårsaket en doseavhengig forsterkning i caspase-9 og caspase-3-enzymaktivitet. Denne økningen var betydelig større i tilfelle av konjugerte behandlede celler sammenlignet med celler behandlet med samme dose av RESV (Fig. 2C). For kaspase-8, selv om det var marginal økning i aktivitet ved høye doser av RESV behandling, ble ingen slik induksjon observert i tilfelle av konjugat behandling (Fig. 2C). Tvert imot, de oppnådde resultater i tilfelle av LNCaP-celler viste en signifikant økning i alle de tre caspase dvs. caspase-8, -9 og -3 på konjugat behandling indikativ for involvering av både indre (via caspase-9) og ytre (via caspase-8) baner i apoptotiske prosess av konjugatet i denne cellelinjen (fig. 2D, venstre panel). Videre er resultatene indikerte at aktiveringen av caspase-9 inntreffer før den av caspase-8 (ved lavere dosering), noe som antyder at den mitokondrielle reaksjonsveien kan være avgjørende for konjugat-indusert apoptose. På den annen side, RESV behandlingen viste også betydelig økning i kaspase -9 og -3 aktiviteter, men i mindre grad i forhold til konjugatet (figur 2D, høyre panel). (
p
0,05). Således dataene ovenfor klart viser at konjugat indusert apoptose i PC-3-celler blir mediert via den indre reaksjonsvei, mens både de indre og ytre baner bidrar til apoptose i LNCaP-celler. Også konjugatet ble funnet å være mer effektiv enn RESV å indusere apoptose i både PCA-cellelinjene som ble testet.
Videre, for å belyse den veien som var fremherskende for konjugat-indusert apoptose, farmakologiske inhibitorer av spesifikke kaspasene ble benyttet for å undersøke om de kan beskytte cellene mot gjennomgår apoptose. Som vist på fig. 2E og 2F, Z-VAD-FMK, en generell kaspaseinhibitor, viste signifikant inhibering av celledød i både PC-3 og LNCaP-celler tyder på at apoptose er den dominerende form for celledød indusert av konjugatet. I tilfelle av PC-3-celler, Z-LEHD-FMK, en spesifikk inhibitor av kaspase-9 også inhiberte konjugat indusert celledød ved 73%, mens Z-IETD-FMK, en spesifikk inhibitor av kaspase-8, var fullstendig ineffektiv i å blokkere konjugat indusert celledød (
p
0,05) (fig. 2E). Videre, i tilfelle av LNCaP-celler, en inhibitor av kaspase-9 nesten fullstendig blokkert konjugatet induserte apoptose mens inhibitor av kaspase-8 bare delvis hemmet den (fig. 2F). Konjugatet induserte celledød var mest fremtredende inhibert når cellene ble forbehandlet med både caspase-8 og caspase-9-inhibitorer. Sammen utgjør disse dataene styrker våre funn at konjugerte indusert apoptose innebærer caspase -9 /-8 /-3 og caspase-9 /-3 trasé i LNCaP og PC-3 celler henholdsvis.
BCL-2 og Bax er involvert i apoptose av konjugert
BCL-2 danner en heterodimere kompleks med apoptotisk Bax protein, og dermed nøytralisere sin apoptotisk effekt. Derfor er forholdet mellom Bax /BCL2 ofte betraktet som en avgjørende faktor for bestemmelse av celledød eller overlevelse. I denne studien, behandling av celler med konjugat resulterte i en reduksjon i uttrykket av
BCL-2 Hotell og
BCL-xL
med en samtidig økning i
Bax
genet både i LNCaP og PC-3-celler (Fig. 3). Dette resulterte i en betydelig økning i Bax /BCL2 grad, som generelt favoriserer apoptose. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig.
