Abstract
inaktivering av tumor suppressor genet p53 er ofte observert i menneskelige prostata kreft og er assosiert med terapeutisk motstand. Vi har tidligere vist at grønn te polyfenoler (GTP) indusere apoptose i prostatakreftceller uavhengig av p53 status. Men de molekylære mekanismene bak disse observasjonene forblir unnvikende. Her undersøkte vi mekanismene for GTP-indusert apoptose i menneskelig prostata kreft LNCaP celler stabilt-transfektert med kort hårnål-RNA mot p53 (LNCaPshp53) og kontroll vektor (LNCaPshV). GTP behandling indusert p53 stabilisering og aktivering av nedstrøms mål P21 /waf1 og Bax på en doseavhengig måte spesifikt i LNCaPshV celler. Men GTP-indusert FAS oppregulering gjennom aktivering av c-Jun-N-terminal kinase resulterte i FADD fosforylering, caspase-8 aktivering og avkutting av BID, som fører til apoptose i både LNCaPshV og LNCaPshp53 celler. Parallelt behandling av celler med GTP resulterte i hemming av overlevelse vei, formidlet av Akt deaktivering og tap av BAD fosforylering mer fremtredende i LNCaPshp53 celler. Disse distinkte ruter av celledød konvergerte til en felles reaksjonsvei, som fører til tap av mitokondriell transmembranpotensialet, cytokrom c frigjøring og aktivering av terminal kaspaser, som resulterer i PARP-spaltning. GTP-indusert apoptose ble svekket med JNK-inhibitor, SP600125 i begge cellelinjer; mens PI3K-Akt hemmer, LY294002 resultert i økt celledød fremtredende i LNCaPshp53 celler, etablere rollen som to forskjellige veier av GTP-mediert apoptose. Videre GTP eksponering resulterte i inhibering av klasse I HDAC-protein, akkumulering av acetylert histon-H3 i total cellulær kromatin, noe som resulterer i øket tilgjengelighet av transkripsjonsfaktorer til å binde med den promotorsekvensene av p21 /waf1 og Bax, uavhengig av p53 status av -celler, i samsvar med effekter fremkalt av en HDAC-inhibitor, trichostatin A. Disse resultater viser at GTP induserer prostatakreft celledød ved to forskjellige mekanismer uten hensyn til p53 status, og dermed identifisere spesifikke veldefinerte molekylære mekanismer som kan bli målrettet ved Kjemopreventivt og /eller terapeutiske strategier
Citation:. Gupta K, Thakur VS, Bhaskaran N, Nawab A, Babcook MA, Jackson MW, et al. (2012) Grønn te polyfenoler Frem p53-avhengig og p53-uavhengige apoptose i prostata kreft celler gjennom to forskjellige mekanismer. PLoS ONE 7 (12): e52572. doi: 10,1371 /journal.pone.0052572
Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 29. mars 2012; Godkjent: 19 november 2012; Publisert: 20.12.2012
Copyright: © 2012 Gupta et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen arbeidet er støttet av USA Public Health service Grants RO1 CA115491, RO1 CA108512, RO1 AT002709, og R21 CA109424 og legat midler til SG. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne er er takknemlig til Dr Mark W Jackson, som soner en co- forfatter i dette manuskriptet, og er en faglig redaktør av PLoS ONE. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Med begrensede behandlingstilbud tilgjengelig for prostatakreft, er pasienter med relapsing sykdom behandlet med anti -androgens. Imidlertid er utgangs klinisk respons ofte etterfulgt av fremveksten av hormon ildfast og til slutt kjemoterapi resistent kreft [1]. Det er godt etablert at kreftceller kan anskaffe chemoresistance gjennom en rekke mekanismer, de fleste av dem innebærer en endret apoptotisk program [2]. Nyere studier har vist at p53 status kan være en kritisk determinant for chemo-følsomhet i humane svulster [3], [4]. Mer enn 50% av humane kreftformer, inkludert prostata cancer, utstillings tap av normale p53-funksjon og /eller defekter i p53-signalveien, så vel som missense mutasjoner eller delesjoner; disse molekylære endringer er forbundet med resistens til celledød [4], [5]. Den relative ineffektivitet av aktuelle kjemoterapeutiske regimer rettferdiggjør en fortsatt søken etter trygge og effektive midler som kan forbedre behandling og /eller hemmer utvikling av resistens mot kjemoterapi.
p53 protein, en tumor suppressor, funksjoner i transkripsjon av vekst- hemmende gener som er involvert i apoptose, cellesyklus-stans og DNA-reparasjons [4] – [6]. Svulsten undertrykkende funksjon av p53 er i hovedsak knyttet til sin rolle i en av to mekanismer: enten å fremme reparasjon og overlevelse av skadede celler, eller fremme permanent fjerning av uopprettelige skader cellene gjennom apoptose [6], [7]. For eksempel forårsaker p53 cellesyklus-stans i første rekke ved å aktivere transkripsjonen av et cyklin-avhengig kinase inhibitor, P21 /waf1, og induserer apoptose via transkripsjonelle aktivering av de pro-apoptotiske BCL2 familie gener, Bax, Puma og Noxa [7]. Et alternativt og supplerende signalveien som fører til programmert celledød omfatter den ekstrinsiske reaksjonsvei død reseptoren. Den ytre vei innledes ved reseptor-ligering av FAS /CD95 ligand mediert av en adapter molekyl FAS-assosiert død domene (FADD) som bygger bro over reseptoren med den nedstrøms effektor, kaspase 8, noe som resulterer i sammenstillingen av dødsinduserende aliserte kompleks [ ,,,0],7], [8]. De ytre og indre apoptose trasé er koblet sammen med den caspase-8-mediert spalting av pro-apoptotiske Bcl-2 familiemedlem Bud. Avkortet Bud (tBid) translocates til mitokondriene, hvor det induserer frigjøring av cytokrom C, fulgt av induksjon av apoptose [9].
Som dereguleringen av p53-reaksjonsveien i en kreftcelle er et vanlig arrangement og kan bidra til legemiddelresistens, er kjemoterapeutiske strategier rettet mot denne defekt mekanisme nødvendig. For eksempel kan en ny terapeutisk tilnærming, som omfatter farmakologisk hemning av histon deacetylases (HDACs), tillater lokal remodellering av kromatin og dynamiske forandringer i nukleosomale emballasje, via acetylering /de-acetylering av kjerne histon-proteinet, og dermed spiller en sentral rolle i regulering av tilgang til kromosomalt DNA, og derved, ved regulering av gentranskripsjon [10]. Blant de viktigste regulatorer av slike fenomener er spesifikke enzymer som regulerer N-terminal acetylering av lysinresidier på H3 og H4 histoner, de histone acetyltransferases (hatt) og HDACs [10], [11]. Disse enzymene kan bli rekruttert til å endre spesifikke gener i komplekser av sekvensspesifikke transkripsjonsfaktorer. Inhibering av HDAC aktivitet fører til cellesyklus og apoptose i kreftceller, primært gjennom transkripsjonen aktivering av p53-medierte pro-apoptotisk respons og induksjon av cellesyklus kinase inhibitor p21 /waf1 og Bax, samt gjennom transkripsjonelt uavhengig direkte binding av p53 til Bax, BCL2 og Bcl-
xL [12], [13].
ved siden av inaktivering av apoptotiske signalelementer svulster også utvikle kjemoterapi motstand ved aktivering av overlevelse signalering som phosphatidylinositide 3-kinase ( PI3K) /Akt sti [14]. Aktivering av PI3K av reseptor-tyrosinkinaser fører til rekruttering av proteinkinase B (PKB /Akt) til plasmamembranen, hvor det deretter blir aktivert ved fosforylering ved restene Thr308 og Ser473, som i sin tur fosforylert av fosfoinositid-avhengige kinaser. Aktivert Akt forbedrer overlevelse av celler både ved inhibering av pro-apoptotiske proteiner
viz
. BAD eller caspase-9 og ved aktivering av anti-apoptotiske proteiner og dermed fremme celle overlevelse [14], [15].
I de siste tiårene har en rekke naturlige polyphenolic forbindelser har blitt evaluert for deres mulig bruk i forebygging og behandling av kreft [16]. Grønn te polyfenoler, hovedbestanddelen som er epigallocatechic-3-gallat (EGCG), er blitt vist å indusere cellesyklus og apoptose i forskjellige cancercelletyper [17]. Vårt laboratorium har gjennomført omfattende undersøkelser av mekanismene bak den anti-kreftfremkallende effekten av grønn te polyfenoler i menneskelige prostata kreft celler [12], [13]. Vi har tidligere vist at grønn te polyfenoler forårsake apoptose i prostatakreftceller uavhengig av androgen forening og p53 status [13]. Videre viste vi at GTP og EGCG økning p53 transkripsjonen aktivitet og acetylering ved å undertrykke klasse I Histone deacetylases [12]. I denne studien, våre resultater viser at grønn te polyfenoler indusere apoptose i prostatakreftceller ved å aktivere FAS død reseptor /caspase-8 sti og hemme p-Akt /p-BAD celle overlevelse veien. Vår akkumulerte funnene har viktige implikasjoner for forståelsen av den molekylære mekanismen for chemoresistance i prostatakreftceller, og i særdeleshet, rollen av p53 og Akt i denne prosessen. Siden chemoresistance er en begrensende faktor i arbeidet med å gi vellykket behandling for prostatakreft, er det avgjørende å forstå hvordan GTP forskjellig seirer terapeutisk motstand og induserer apoptose i prostatakreftceller med varierende typer p53 unormalt.
Materialer og metoder
Cell Kultur og reagenser
LNCaPshV og LNCaPshp53 celler ble generert ved å infisere menneskelige prostata kreft LNCaP celler hentet fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) med shp53 lentivirus fremstilt i laboratoriet ved trans 293T-celler med lentivirale vektorer pLVTHSiGFP eller pLVTHMshp53RNA og pakking konstrukter som tidligere beskrevet [18], [19]. Celler ble dyrket og opprettholdt i RPMI 1640 medium (Hyclon, Thermo Fischer, Logan, UT) supplert med 1% penicillin-streptomycin og 10% føtalt bovint serum (Foundation, West Sacramento, CA) ved 50-70% konfluens. Celler mottok følgende behandlinger: 20 ng /ml trichostatin A (Sigma, St. Louis, MO), oppløst i DMSO; 20-80 mikrogram /ml Polyphenon e® (Mitsui Norin, Japan) heretter omtalt som grønn te polyfenoler (GTP) for angitte tidspunkter. Konsentrasjoner på 10 ug /ml Polyphenon E samsvarer med 14 uM EGCG som bestemt ved HPLC-analyse. Bestanddelene som er tilstede i Polyphenon e® er tidligere beskrevet [20]. Antistoffer for anti-p53 (SC-126), anti-p21 /waf1 (SC-397), anti-Akt (SC-8312), anti-Bax (SC-493), anti-BID (SC-6538), anti -HDAC1 (SC-7872), anti-HDAC2 (SC-6296), anti-HDAC3 (SC-11417), anti-HDAC8 (SC-11405), anti-FAS (SC-715), anti-FADD (SC- 5559), anti-p-FADD Ser194 (SC-12439), ble anti-caspase-8 (SC-7890) og anti-β-aktin (SC-47778) som er kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Antistoffer for anti-histon H3 (05-928), anti-histon acetyl H3 Lys9 /18 (07-593) fra Upstate (EMD Millipore, Billerica, MA), og BID (44-4334) ble anskaffet fra Invitrogen Corporation (Camarillo , CA). Antistoffer for anti-caspase-9 (# 9502), anti-caspase-3 (# 9662), kløyvde PARP (# 9544), anti-c-IAP (# 3130), anti-X-IAP (# 2045), anti -SAPK /JNK (# 9258), anti-p-JNK Thr183 /Tyr185 (# 9251), anti-p-Akt Ser473 (# 4051), anti-BAD (# 9292), anti-p-BAD Ser136 (# 9295 ) og anti-VDAC (# 4866) ble kjøpt fra cellesignalisering Technologies (Danvers, MA).
generasjon av LNCaPshV og LNCaPshp53 Cells
293T emballasje celler ble sådd ut i 100 mm-platene dag før transfeksjon i DMEM inneholdende 10% varme-inaktivert FBS uten penicillin-streptomycin. Cellene ble transfektert med 6 mikrogram shp53 eller shGFP (kontroll) RNA sammen med andre generasjons emballasje konstruksjoner (pCMV-dR8.74 og pMD2G) ved hjelp lipofectamin Plus reagens (Invitrogen Corp.) som per protokoll levert av leverandøren. For to påfølgende dager, ble media samlet og lagt på de LNCaP celler etter tilsetning av 10 pl 4 mg /ml polybrene per 10 ml og sterilisere gjennom filtrering.
Proliferation Assay
Effekten av GTP på celleformering ble bestemt ved MTT [3- (4, 5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2, 5-difenyl tetrazoliumbromide] assay og veksthemming ble vurdert som prosent levedyktigheten hvor bærer-behandlede celler ble tatt som 100 % levedyktige som tidligere beskrevet [21].
metylenblått Farging og Kvantifisering
Celler ble sådd ut i 6 brønners kulturplater og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av camptothecin (50-200 ng /ml) i 24 timer. Media ble så fjernet og cellene fiksert med metylenblått-løsning etter behandling, og platene ble holdt på rysteapparat i 1 time. Platene ble vasket forsiktig med dobbeltdestillert vann for å fjerne overskudd av fargestoff, tørket og skannet.
lysmikroskopi
LNCaPshV og LNCaPshp53 celler ble dyrket til 70% konfluens og ble behandlet med 20-40 ug /ml konsentrasjon av GTP i 24 timer. Fotografiene ble tatt til fange på x40 forstørrelse ved hjelp av lysmikroskop.
DNA Fragmentering analysen
Cellene ble dyrket til ca 70% samløpet og behandlet med 40 mikrogram /ml konsentrasjon av GTP i 48 timer. Cellene ble deretter underkastet behandling for DNA-isolering og fragmentering assay. Båndene ble visualisert under en UV transilluminator, etterfulgt av digital fotografering som tidligere beskrevet [21].
Cell Død analysen
Cell apoptose ble målt med
in vitro
fastsettelse av cytoplasmatiske histon-assosiert-DNA-fragmenter (mono og oligonucleosomes) etter induksjon av celledød ved fotometriske enzym immunoassay ved hjelp av celledød Detection ELISA kit fra Roche (Cat # 11774425001) som per leverandørens protokoll. I korthet ble cellene behandlet med 20 uM LY294002 eller 20 uM SP600125 i 8 timer og 40 ug /ml GTP i 16 timer eller i kombinasjon i 24 timer og cytoplasmatiske celleekstrakter ble overført til streptavidin belagte mikrobrønnplater med immuno-reagens inneholdende anti- histon-biotin, anti-DNA-POD. Etter inkubasjonen ble enzymatisk reaksjon utført, og fargen ble avlest ved 405 nm ved å bruke referansebølgelengde som 490 nm. Bakgrunnsverdier (inkuberingsbuffer alene) ble subtrahert, og OD-verdier som representerer nukleosomale DNA-fragmenter i behandlede prøver ble sammenlignet med de verdier som oppnås fra ubehandlede kontrollceller, og uttrykt som ganger økning.
Western Blot analyse
Celler ble lysert i radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) buffer (inneholdende 1% NP40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS i PBS og ferskt tilsatt fullstendig protease inhibitor cocktail (Roche Applied Sciences, Indianapolis, iN). Proteinkonsentrasjonen konsentrasjonen~~POS=HEADCOMP i cellelysat ble bestemt ved bruk av detergent-kompatibel proteinanalyse fra Bio-Rad (Hercules, CA). protein~~POS=TRUNC prøver~~POS=HEADCOMP ble underkastet SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembran. membranen ble inkubert med primært antistoff over natten blokkert i 5% fettfri melk i PBS. Neste dag membranen ble fjernet fra primære antistoff, vasket med vaskebuffer og deretter inkubert med passende pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Membranen ble så utviklet med forbedret chemiluminescence reagens (GE Healthcare, Piscataway, NJ) og utsatt for Hyblot CL autoradiografi film (Denville Scientific, Metuchen, NJ). Bilde digitalisering og kvantifisering ble utført med Kodak 2000 imaging system.
Utvinning og ekspresjon av acetylert histonproteinene
Menneskelig prostatakreft LNCaPshV og LNCaPshp53 celler ble behandlet med 20-80 mikrogram /ml GTP for 24 h og ble høstet deretter vasket to ganger med is-kald fosfat-bufret saltvann (PBS) supplert med 5 mM natriumbutyrat. Etter vask ble cellene resuspendert i Triton utvinning buffer [PBS inneholdende 0,5% Triton X-100 (vol /vol), 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,02% (vekt /volum) NaN3] og lysert på is i 10 min med forsiktig omrøring sentrifugert ved 2000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Pelleten ble vasket i Triton utvinning buffer og deretter resuspendert i 0,2 N HCl. Histoner ble syren ekstrahert over natten ved 4 ° C og sentrifugert ved 2000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Prøvene ble behandlet for analyse av histoner ved hjelp av immunblotting.
Chromatin Immunoutfelling (chip) Assay
human prostatakreft LNCaPshV og LNCaPshp53 celler ble behandlet med 20-80 ug /ml doser av GTP oppløst i PBS eller bare med PBS (kontroll) i 3 dager. Ved slutten av behandlingen, ble celler inkubert i seruminneholdende 1% formaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur for tverrbinding. Reaksjonen ble deretter avsluttet ved å bruke 0,125 M sluttkonsentrasjon av glysin. Den kromatin ble spaltet med monococcal nuklease-enzym og inkubert med anti-acetylert histon H3 (Cat # 07-593, Upstate Biotechnology) antistoff over natten ved 4 ° C. Tverrbinding ble reversert ved å inkubere prøvene over natten ved 65 ° C. DNA ble renset ved hjelp av fenol-kloroform-isoamyl-løsning med ekstraksjon etterfulgt av etanolutfelling. DNA ble så resuspendert i nuklease-fri vann. Primere som brukes til p21 /waf1 genet arrangøren var som følger: termin primere 5′-GTGGCTCTGATTGG CTTTCTG-3 «, reverse primere 5′-GTGAAAACAGGCAGCCCAAG-3′ og for Bax genet promoter, termin primere 5»-TAATCCCAGCGCTTTGGAA-3 «og revers primere 5»-TGCA henholdsvis GAGACCTGGATCTAGCAA-3 «,. Immunoutfelt DNA, perler eller innsats kontroller ble underkastet polymerasekjedereaksjon (PCR) amplifikasjon i 30 sykluser av følgende sykkel betingelser: Trinn-1-95 ° C i 2 minutter (1 syklus), trinn-2-95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 1 min (30 sykluser), trinn-3-72 ° C i 3 minutter (1 syklus). PCR produktene ble utsatt for elektroforese bruker 2% agarosegel.
Cell Cycle Analysis og apoptose Detection
Effekten av GTP på cellesyklus og subG1 ble målt ved å utføre flowcytometrisk analyse. LNCaPshV og LNCaPshp53 celler ble behandlet med GTP og ble høstet ved trypsinering etterbehandling (både festet og flytende celler fra etterbehandling media) ble samlet. Cellene ble vasket to ganger med PBS. Ca, 1 x 10
6-celler ble fiksert i 90% kald metanol og igjen på is i minst 30 minutter og lagret ved -20 ° C inntil behandlet for cellesyklus. Celler ble pelletert, vasket og resuspendert i 0,04 ug /ml propidiumjodid og 100 ug /ml RNase i PBS. Prøvene ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter og flow-cytometri ble utført på EPICS-XL MCL strømningscytometer og analysert ved hjelp av Cell quest Analysis programvare Modfit for å bestemme antall celler i hver fase av cellesyklusen.
statistisk analyse
Alle eksperimenter ble gjentatt minst to ganger i duplikat. Resultatene er uttrykt som middelverdier ± SD. Bildene ble digitalisert og kvantifisering ble utført ved hjelp av et program med Kodak 2000 imaging system. Statistiske sammenligninger ble utført ved ANOVA etterfulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest.
P
verdier. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
Selv om effekten av GTP i indusere apoptose i en rekke kreftcelletyper har blitt godt dokumentert [22] – [24], effekten av GTP i fravær av p53-abnormiteter er ikke undersøkt i detalj. Tidligere studier har vist at inaktivering av p53 ved siRNA i human prostata cancer LNCaP-celler økte resistens mot EGCG-mediert apoptose [25]. For å utvetydig etablere rollen p53 og å undersøke trasé ansvarlige for økt cellulær motstand, genererte vi isogene celler med lentivirus vektor bakgrunn av permanent knockdown p53 i LNCaP celler til å generere LNCaPshp53 og transfektert med kontroll vektor for å danne LNCaPshV celler. For å bestemme om p53-nivåer påvirker celledød reaksjon ble isogene cellene behandlet med camptothechin, et DNA-ødeleggende anticancermiddel som forårsaker apoptose i forskjellige humane kreftceller [26]. Som vist i figur 1A, behandling med 50 og 100 ng /ml camptothechin i 24 timer resulterte i signifikant økning av LNCaPshV celler i G1 fasen av cellesyklusen. Sammenlignet med ubehandlet kontroll, prosentandelen av celler i G1 fase økes fra 67,36% til 79,62% og 86,22% etter behandling med 50 og 100 ng /ml konsentrasjoner av camptothecin. Likeledes LNCaPshp53 celler oppviste G1 faserest etter camptothecin behandling med 74,43% og 71,42% etter behandling med 50 og 100 ng /ml camptothecin, sammenlignet med ubehandlede celler med 62,51% i G1 fase. I tillegg til G1 fase arrest, camptothecin også forårsaket betydelig opphopning av celler i subG1 fase, en indikasjon på apoptose. Sammenlignet med ubehandlede celler (3,37%), behandling av celler med kamptotecin LNCaPshV øket fra 34,91% ved 50 ng /ml og 51,97% ved 100 ng /ml i sub-G1 fase. Imidlertid LNCaPshp53 celler var mer resistente overfor camptothechin-mediert apoptose med 23,87% og 29,59% ved 50 ng /ml og 100 ng /ml doser i subG1 fase, sammenlignet med 1,71% i de ubehandlede kontroller. Lignende resultater ble observert i den klonogene assay hvor knockdown av p53 resulterte i øket motstand mot camptothechin-mediert celledød (figur 1B).
isogene celler med lenti-virusvektor bakgrunn ble samlet ved permanent knockdown av p53 i LNCaP celler [LNCaPshp53] og transfektert med kontroll vektor, LNCaPshV celler. [A] Cell behandlet med 50 og 100 ng /ml camptothecin i 24 timer ble høstet, farget med PI og analysert ved flow-cytometri for å måle sub-G1 og G1 befolkning. [B] Celler ble behandlet med 50, 100 og 200 ng /ml camptothecin i 24 timer og farget med metylenblått. Intensiteten av metylenblått tas opp av levende celler ble målt spectrophotometerically etter eluering av fargestoff i 0,1 N HCl og sammenlignet med ubehandlede celler. [C] knockdown av p53 oppregulert Akt /BAD signalisering i prostatakreftceller. LNCaPshV og LNCaPshp53 cellene ble lysert og Western blotting ble utført for p53, Akt, p-Akt (Ser473), dårlig, p-BAD (Ser136) proteiner. Aktin ble benyttet som intern kontroll lasting. [D] Relative intensiteter av p-Akt og p-Bad protein i LNCaPshV og LNCaPshp53RNA cellene der band var normalisert til aktin og uttrykt i relative verdier i forhold til den opprinnelige protein. Detaljene er beskrevet i materialer og metoder delen.
knockdown av p53 Øker Akt Survival signalveien
Siden studier har vist at aktivert Akt kan føre til nedregulering av p53 nivåer [27 ], vi neste bestemmes effekten av p53 knockdown på Akt nivåer og nedstrøms mål. Som vist på figur 1C, knockdown av p53 forårsaket en signifikant økning i p-Akt (Ser473) og p-BAD (Ser136) ekspresjon i LNCaPshp53 celler, sammenlignet med LNCaPshV celler. En 2,0 ganger økning i p-Akt nivåer og 3,78 ganger økning i p-BAD nivåer ble observert etter p53 knockdown i LNCaPshp53 celler, sammenlignet med LNCaPshV celler (figur 1D).
Grønn te polyfenoler indusere apoptose i begge LNCaPshV og LNCaPshp53 Cells Uavhengig av p53 status
for å karakterisere p53 status på effekten av GTP behandling, senere studier ble utført i LNCaPshV og LNCaPshp53 celler. Som vist i figur 2A, MTT-analyse utført etter 24 timer med behandling med 20-80 ug /ml konsentrasjon av GTP oppviste inhibering doseavhengig i celleviabilitet fra 100% til 33,98% i LNCaPshV og 100% til 66% i LNCaPshp53 celler. I forhold til LNCaPshp53 celler, LNCaPshV cellene mer følsomme for GTP eksponering i de første 24 timer av behandlingen. For å studere effektene av mer langvarig eksponering for GTP, ble tidsavhengige studier utført med 40 mikrogram /ml dose av GTP. Behandling av celler med GTP forårsaket markert akkumulering av celler i G0 /G1 fase; 71,02% til 84,57% i LNCaPshV celler, sammenlignet med 78,39% til 81,19% i LNCaPshp53 celler mellom 48-96 timer, respektivt (figur 2B). Antall celler i subG1 økte også signifikant ved 96 timer etter behandling GTP i begge cellelinjer; 0,53% til 66,97% i LNCaPshV celler og 0,31% til 83,94% i LNCaPshp53 celler, uavhengig av deres status p53 (figur 2C). GTP behandling resulterte også i apoptose av både LNCaPshV og LNCaPshp53 celler som observert ved lysmikroskopi og DNA-fragmentering analysen (figur 2 D kjøretøy-behandlede celler ble ansett som 100% levedyktig. Stolpene representerer middelverdi ± SD av minst to uavhengige eksperimenter hver utført i duplikat, **
p
0,001 representerer signifikante forskjeller sammenlignet med kontroll gruppe uten GTP behandling. [B] Cell ble behandlet med 40 ug /ml GTP til 24, 48, 72 og 96 h og fordeling av celler ble tatt opp i ulike stadier av cellesyklus analysert ved hjelp av FACS-analyse. [C] Celler ble behandlet med 40 og 80 ug /ml GTP i 96 timer, og antall celler som gjennomgår apoptose ble bestemt ved å måle cellepopulasjon i sub G1-fasen av cellesyklusen. Stolpene representerer middelverdi ± SD av minst to uavhengige eksperimenter hver utført i duplikat, **
p
0,001 representerer signifikante forskjeller sammenlignet med kontroll gruppe uten GTP behandling. [D] Lette mikroskopiske bilder av LNCaPshV og LNCaPshp53 celler behandlet med 40 og 80 mg /ml GTP i 96 timer. GTP behandling viser morfologiske forandringer forenlig med apoptose i begge disse cellene. [E] DNA-fragmentering assay. Cellene ble behandlet med 40 ug /ml konsentrasjon av GTP i 48 timer, oppsamlet for DNA-isolering og underkastet agarosegelelektroforese, etterfulgt av visualisering av båndene under UV-lys. Detaljene er beskrevet i materialer og metoder delen.
Tidligere har vi rapportert at i menneskelige prostata kreft celler som inneholder funksjonell p53, oppregulerer GTP bestanddel EGCG behandling p53 og dens fosforylering på kritiske serinresidua og P14
ARF-mediert nedregulering av MDM2 i p53-avhengig måte [28]. Behandling av LNCaPshV celler med 20-80 mikrogram /ml konsentrasjoner av GTP i 24 timer viste en doseavhengig økning i p21 /waf1, Bax og PUMA, kjente nedstrøms mål for p53, mens ingen signifikante endringer ble observert i p-BAD og p-Akt nivåer. I LNCaPshp53 celler, GTP behandling også resulterte i en doseavhengig økning i ekspresjon av P21 /waf1, Bax og Puma, men ikke i den grad observert i LNCaPshV celler, noe som viser både p53-avhengig og p53-uavhengig induksjon av pro-apoptotiske proteiner i disse cellene (figur 3A). Etter behandling med GTP en betydelig nedgang i Akt og BAD fosforylering var tydelig i LNCaPshp53 celler. I samsvar med apoptose, ble tidsavhengige økninger i spaltede caspase 9 og caspase 3 observert i begge cellelinjer (figur 3B).
[A] Celler ble behandlet med 20-80 ug /ml konsentrasjon av GTP til 24 h og Western blotting ble utført for p53, Akt, p-Akt (Ser473), dårlig, p-BAD (Ser136), p21 /waf1, Puma og Bax proteiner. [B] Celler ble behandlet med 40 ug /ml konsentrasjon av GTP til 3, 6, 9, 12, 24 og 48 h og Western blotting ble utført for procaspase-9, spaltet caspase-9 og spaltet caspase-3-proteiner. En typisk aktin blot viser interne lasting kontroll. Cytokrom c utgivelse fra mitokondriene til cytosol ble bestemt ved Western blotting i GTP behandlede celler. En typisk aktin blot viser intern lasting kontroll for cytosol, mens VDAC som intern lasting kontroll for mitokondriene. [D] Celler ble behandlet med 20 uM konsentrasjon av PI3K-Akt-inhibitor LY294002 i 8 timer og med 40 ug /ml GTP i 16 timer alene, eller LY294002 i 8 timer fulgt av GTP behandling i kombinasjon, etterfulgt av Western blotting for p-Akt , Akt, p-BAD og dårlige proteiner. Uttrykkene av innfødte proteiner ble ansett som lasting kontroller. [D] Celledød målingen ble utført ved fotometriske enzym immunoassay celledød Detection ELISA kit. Stolpene representerer middelverdi ± SD av minst to uavhengige eksperimenter hver utført i duplikat, **
p
0,001 representerer signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen. [E] Lys mikroskopiske bilder av LNCaPshV og LNCaPshp53 celler behandlet med LY294002 og GTP alene eller i kombinasjon. Detaljene er beskrevet i materialer og metoder delen.
Deretter analyserte vi effektene av GTP eksponering på nedstrøms apoptotiske sti, spesifikt, effektorer av mitokondrie død cascade, ved å evaluere cytokrom C utgivelse i cytosol. Behandling av LNCaPshV og LNCaPshp53 celler med GTP betydelig økt cytokrom C nivå i cytosol som toppet seg på 12 timer etter GTP eksponering. Translokasjon av cytokrom C fra mitokondriene til cytosol ble observert i begge cellelinjer i en tidsavhengig måte (figur 3B).
Grønn te polyfenoler Hemme Akt Ser473 fosforylering og nedstrøms Targets i LNCaPshp53 Cells
tidligere vi vist at p53 knockdown resulterte i økt uttrykk av Akt og økt fosforylering på Ser473. Neste vi behandlet begge cellelinjer med GTP og /eller LY294002, en spesiell PI3K-Akt inhibitor. Fosforylering av Ser473 og T308 aktiverer Akt å fosforylere target proteiner gjennom sin kinase aktivitet for å fremme overlevelse og hemme apoptose [29]. Som vist i figur 3C D, behandling av celler med LY249002 forårsaket en reduksjon i p-Akt nivåer og resulterte i økt apoptose i begge cellelinjer selv om omfanget av apoptose var høyere i LNCaPshp53 celler. Tilsvarende GTP behandling hemmet Akt fosforylering ved Ser473, som var i samsvar med økt apoptose, og kombinert behandling med GTP og LY294002 resulterte i en enda høyere grad av celledød i LNCaPshp53 celler enn i LNCaPshV celler. Konsekvent, fosforylering av BAD ble betydelig redusert som følge av redusert fosforylering av kinase aktiviteten til Akt ved LY294002 og GTP; dette korrelert med samtidig økt celledød av LNCaPshp53 celler. Lignende virkninger av lavere størrelsesorden ble observert i LNCaPshV celler (figur 3 D & E). Disse resultater viser at selv om omfanget av celledød er forårsaket av GTP eksponering er lik i begge cellelinjer, de veier som fører til apoptose er forskjellige, og kan bli påvirket av p53 status.
grønn te polyfenoler indusere død Receptor pathway i human prostata kreft celler
for å undersøke mulige mekanismer som er involvert i GTP-indusert apoptose, vi neste fokusert på ytre vei gjennom FAS. Som vist i figur 4A, behandling med GTP skyldes induksjon av FAS i 10 min i begge cellelinjer, etterfulgt av økte nivåer av fosforylert FADD ved Ser194, mens det totale FADD nivåer forble uendret. Imidlertid basalnivåer av FADD var mye høyere i LNCaPshp53 celler sammenlignet med LNCaPshV celler. Søker etter oppstrøms effektorer av FAS oppregulering viste at JNK ble aktivert av GTP, som var tydelig fra økningen i p-JNK status.
