Abstract
Macrophage hemmende cytokin-en (MIC-1 /GDF15), et divergerende medlem av TGF-β superfamilien, er overuttrykt ved mange vanlige kreftformer, inkludert de av prostata (PCA) og dens ekspresjon er forbundet med kreft resultat. Vi har evaluert effekten av MIC-1 /GDF15 overekspresjon på PCa utvikling og spredning i TRAMP transgen modell av spontan prostatakreft. Tramp mus ble krysset med MIC-1 /GDF15 overekspresjon mus (MIC-1
FMS) for å produsere syngene TRAMP
fmsmic-1 mus. Overlevelse, prostata svulst størrelse, histopatologiske karakterer og omfanget av fjerne organmetastaser ble sammenlignet. Metastasering av TC1-T5, en androgen uavhengig TRAMP-cellelinjen som mangler MIC-1 /GDF15 ekspresjon, ble sammenlignet ved å injisere intravenøst i MIC-1
fms og syngene C57BL /6 mus. Mens TRAMP
fmsmic-1 overlevde i gjennomsnitt 7,4 uker lengre, hadde signifikant mindre urin (GU) svulster og lavere PCA histopatologiske karakterer enn Tramp mus, flere av disse musene utviklet fjerntorganmetastaser. I tillegg ble det observert et høyere antall TC1-T5 lunge svulst kolonier i MIC-1
FMS mus enn syngene WT C57BL /6 mus. Våre studier sterkt at MIC-1 /GDF15 har komplekse handlinger på svulst oppførsel: det begrenser lokal tumorvekst, men kan med fremskridende sykdom, fremme metastaser. Som MIC-1 /GDF15 er indusert av alle kreftbehandlinger og metastasering er den viktigste årsaken til kreft behandlingssvikt og kreftdødsfall, disse resultatene, hvis det er aktuelt for mennesker, kan ha en direkte innvirkning på pasientbehandlingen.
Citation : Husaini Y, Qiu MR, Lockwood GP, Luo XW, Shang P, Kuffner T, et al. (2012) Macrophage Hemmende cytokin-en (MIC-1 /GDF15) Senker kreftutvikling, men øker metastaser i TRAMP Prostate Cancer Liggende Mus. PLoS ONE 7 (8): e43833. doi: 10,1371 /journal.pone.0043833
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 28 april 2012; Godkjent: 30 juli 2012; Publisert: 27 august 2012
Copyright: © Husaini et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Prostate Cancer Foundation of Australia (https://www.prostate.org.au), Cancer Council of New South Wales (https://www.cancercouncil.com.au/) og The National Health and Medical Forskningsrådet Australia (https://www.nhmrc.gov.au/). DAB er en National Health and Medical Research Council Biomedical Career Development Fellow. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. DAB og SNB er oppkalt oppfinnere på patenter som eies av St Vincent Hospital som hører til klinisk bruk av MIC-1 /GDF15 for diagnostisk analyse og modulerende behandling. Disse patentene er lisensiert til Novo Nordisk og Roche Diagnostics. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet online på https://www.plosone.org/static/policies.action#sharing.
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste diagnosen kreft i menn etter hudkreft og er den nest største årsaken til mannlige kreftdødsfall. I 2011, i USA alene, det var 240,890 nye tilfeller av PCa og ca 33 720 dødsfall [1]. PCa, som mange kreftformer, er karakterisert ved den endrede ekspresjon av cytokiner og vekstfaktorer. Et slikt cytokin er MIC-1 /GDF15, et divergerende medlem av den transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) superfamilien [2] som er overuttrykt ved mange pasienter med vanlige kreftformer, inkludert de i prostata, og kan være ytterligere Induced av kreft terapier inkludert kirurgi, cellegift og radio-terapi av prostata, tykktarm og brystkreft [3] -. [9]
MIC-1 /GDF15 protein uttrykk er vesentlig styrket i kreftvev, og kreftcellelinjer . I kreftformer, slik som den av prostata, er den største kilden til MIC-1 /GDF15 den maligne epitelcelle seg selv [5], [10], men det kan også være et bidrag fra stromale tumorceller [11] og infiltrerende fagocytter [12]. Denne tumor ekspresjon av MIC-1 /GDF15 blir ofte gjenspeiles i de blodnivåer, som øker med kreft utvikling og progresjon [5], [10], [13] – [27], generelt i forhold til det stadiet og graden av sykdom . For eksempel er serumnivået stiger gradvis hos pasienter fra normal til lav grad av colonic polypper, høy grad av colonic polypper, lokalisert tykktarmskreft og endelig spres tykktarmskreft [13]. Pasienter med tykktarmskreft som har forhøyede serum MIC-1 /GDF15 nivåer har en dårligere samlet prognose og tidligere sykdom tilbakefall [13], [25]. Lignende resultater har blitt observert i mange andre maligniteter, inkludert melanom [28], [29] og kreft i bukspyttkjertelen [12], [19], [30], skjoldbruskkjertel [31], [32], eggstokk [26] og endometrium [27]. I prostatakreftpasienter, serum MIC-1 /GDF15 konsentrasjoner uavhengig spår beinmetastaser og total overlevelse [14], [21].
Hos pasienter med avansert kreft, serum MIC-1 /GDF15 stiger fra en gjennomsnittlig i ikke-kreftpasienter på omtrent 450 pg /ml [13] til opptil 10.000-100.000 pg /ml [5]. På grunn av dens virkning på ernæringssentre i hjernen, høyde i serumnivåer av MIC-1 /GDF15 er en viktig årsak til kreft-assosiert anoreksi /kakeksi [33]. Mengden av MIC-1 /GDF15 tilstede i serum hos kreftpasienter er, delvis, avhengig av andelen av MIC-1 /GDF15 lokalisert til tumoren versus som diffunderer inn i sirkulasjonen [34]. Den variable behandling av MIC-1 /GDF15 resultater i sekretet i en ubehandlet (med propeptid) og en bearbeidet form begge (uten propeptid) [34]. Som propeptid domene bindes til ekstracellulære matriks, forblir ubehandlet MIC-1 /GDF15 lokalisert til tumoren stroma, mens den prosesserte form raskt diffunderer inn i sirkulasjonen [12], [34]. I PCA en økt mengde av MIC-1 /GDF15 lokalisert til svulsten forbedrer pasientenes prognose, spesielt i de med en Gleason sum score på 6 eller mindre [34].
Selv om det er flere linjer med bevis som knytter MIC-1 /GDF15 til kreft generelt og PCA spesielt, overbevisende og konsistente data om sin biologiske rolle i patogenesen og progresjon av kreft er begrenset [4]. Bevis, i hovedsak fra
in vitro Hotell og xenograft eksperimenter gi tilsynelatende motstridende resultater. De fleste studier har antydet at MIC-1 /GDF15 har anticancer aktivitet og induserer tumorcelle-apoptose [35] – [38]. For eksempel, MIC-1 /GDF15 transfektert HCT-116, menneskelige kolorektal kreft celler utstilt økt basal apoptose, økt respons på ikke-steroid anti-inflammatoriske medisiner og redusert myk agar kloning effektivitet [35]. Den DU145 PCa cellelinje, en av de få som ikke uttrykker MIC-1 /GDF15, gjennomgår apoptose når behandlet
in vitro
med MIC-1 /GDF15 [36].
motsier over data, er det også bevis fra
in vitro
eksperimenter som MIC-1 /GDF15 kan fremme tumorprogresjon [39] – [42]. For eksempel håndheves MIC-1 /GDF15 overekspresjon eller behandling med renset rekombinant MIC-1 /GDF15 betydelig økt
in vitro
invasjonen av mage kreft cellelinjer. Dette ble formidlet av en økning i urokinase Type-plasminogen-aktivator (uPA) og er involvert aktivering av ekstracellulær signal regulert kinase-1/2 (ERK-1/2) [16]. Overekspresjon og knockdown eksperimenter i androgen-avhengige LNCaP-C33 human PCa-cellelinje og dens høyt metastatisk variant, androgen-uavhengig LNCaP-LN3 har vist at MIC-1 /GDF15 kan fremme spredning av androgenreseptoren (AR
+) – positive LNCaP-celler via stimulering av ERK-1/2-signal pathway [20]. Som kontrast, andre har ikke vært i stand til å identifisere noen handling av MIC-1 /GDF15 på
in vitro
spredning av LNCaP celler [36].
in vivo
kreftrelatert aktivitet av MIC-1 /GDF15, har også blitt undersøkt i et begrenset antall tumor xenograft studier. Tvungen MIC-1 /GDF15 overekspresjon i HCT-116 tykktarmskreftceller, xenopodet i nakne mus, resulterte i reduksjon i tumorstørrelse [35]. En glioblastom cellelinje, uten antiproliferativ respons til MIC-1 /GDF15
in vitro
, klarte ikke å vokse som en svulst xenograft i hårløse mus når transfektert med MIC-1 /GDF15 [43]. I kontrast, siRNA slå ned av MIC-1 /GDF15 i en melanoma cellelinje betydelig redusert vekst av xenopodet svulster [28].
Fordi MIC-1 /GDF15 er så ofte og betydelig overuttrykt i kreft, og fordi anti-kreftbehandling indusere MIC-1 /GDF15 uttrykk både i kreft og ikkekreft-vev, kan eventuelle effekter på tumorvirkemåten være av stor klinisk betydning. For å få de mest pålitelige data om den generelle rollen til MIC-1 /GDF15 i biologi PCA og ved analogi kreft generelt, vi utnyttet
T
ransgenic
En
denocarcinoma av
M
Ouse
P
rostate (TRAMP) prostatakreft utsatt mus. Tramp mus uttrykker SV40 tidlige gener (T og t, Tag) i prostata epitel under kontroll av rotte probasin (RPB) promoter [44]. Heterozygot Tramp hannmus utvikle progressiv prostatakreft utstilling spekteret av sykdommer som det forekommer i menn som er invasiv og i stand til metastatisk spredning til fjerntliggende områder, først og fremst bekkenet lymfeknuter, lever, nyre og lunger [45]. Vi krysset Tramp mus med MIC-1 /GDF15 overekspresjon mus (MIC-1
FMS) for å produsere trampe mus som overuttrykker MIC-1 /GDF15 (TRAMP
fmsmic-1). MIC-1
fms mus ekspresjon av MIC-1 /GDF15 er fra myeloide celler (makrofager, dendrittiske celler og neutrofiler), og er tilstrekkelig til å øke serumnivåene med om lag 10-90 gangers [33]. Vi har sammenlignet overlevelse, mønster av PCa vekst og spredning i TRAMP og TRAMP
fmsmic-1 mus. Disse studiene viser at mens Tramp
fmsmic-1 mus har mer langsomt voksende svulster, overleve ca 1/3 lenger og har lavere svulster klasse, de utvikler mye mer metastaser. Derfor liker TGF-β, har MIC-1 /GDF15 en kompleks effekt på tumor atferd, begrenser lokal tumorvekst, men øke metastatisk spredning.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle forsknings- og dyr omsorg prosedyrer ble godkjent av Garvan Institute /St Vincent Hospital forsøk med dyr etiske komité (Ethics No: 07/05 og 10/05) og var i samsvar med den australske anbefalingen for omsorg og bruk of Animals for Scientific Formål.
gene mus
Mann Tramp mus heterozygote for PB-Tag transgenet ble generert ved å parre TRAMP
+/- hunner (C57BL /6 bakgrunnen) med ikke-transgene C57BL /6 hanner. I Tramp mus, rettet mot den minimale rotte probasin (RPB) regulatorisk sekvens SV40 tidlig gen (T og t; Tag) uttrykk spesielt til prostata epitel [44]. Syngene mus overekspresjon MIC-1 /GDF15 under kontroll av myeloid cellespesifikke c-FMS promoter (MIC-1
FMS) ble brukt til å avle trampe mus som også overuttrykker MIC-1 /GDF15 (TRAMP
fmsmic-en ). MIC-1 /GDF15 uttrykk i MIC-1
fms mus er fra myeloide celler, men er nok til å også øke serumnivåer ved ca. 10-90 ganger [33].
Den doble transgen TRAMP
fmsmic-1 mus ble generert ved å krysse TRAMP
+/- kvinner med homozygot MIC-1
FMS menn. PB-SV40 T transgenet ble identifisert ved hjelp av DNA ekstrahert fra haleprøver og PCR primere rettet mot PB-SV40 T antigen sekvensen: Pb fremover: 5′-CCGGTCGACCGGAAGCTTCCACAAGTGCATTTA-3 «og SV40Tag-revers: 5′-CTCCTTTCAAGACCTAGAAGGTCCA-3» . PCR ble utført ved bruk av reaksjonsblandingen og betingelser som er beskrevet tidligere [46]. MIC-1 /GDF15 transgenet i TRAMP
fmsmic-1 mus ble identifisert ved PCR ved bruk primere, flagg fremover: 5′-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3 «og MS8-revers: 5′-CGAAGCCTACCGCGTGCACCGAG-3» og reaksjonsbetingelser: denaturering ved 95 ° C i 10 sekunder, annealing ved 60 ° C i 20 s, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek.
Survival Study
Basert på den statistiske analyse kraft for prøve størrelse, 35 tramp og 35 TRAMP
fmsmic-1 mus ble tildelt på 4-6 ukers alder, for en overlevelsesstudie. Fra den tiden, ble musene veid en gang i uken og overvåket to ganger i uken for tumorstørrelse og grad av palpating magen. Mus enten døde eller ble avlivet da de nådde etiske endepunktene av tumorstørrelse større enn 11 mm x 11 mm x 11 mm, mer enn 20% vekttap eller møte noen andre etiske endepunkts kriterier for aktiv dødshjelp. Den totale overlevelsen av individuelle mus ble beregnet fra fødselen til etisk endepunkt eller død fra tumor. Overlevelse Fordelingen ble beregnet ved hjelp av metoden ifølge Kaplan-Meier. Ved obduksjon i urin-kompleks (GU) bestående av prostata (inkludert rygg, lateral, ventral og fremre lapper), urinrør, ampullary kjertel, sædvæske (SV) og urinblæren ble tatt ut og veid. Vekt av GU, prostata, og SV av hver mus ble normalisert ved sin kroppsvekt (organ vekt /kroppsvektprosent).
primær tumorstørrelse
I en separat kullet til det ovenfor, GU og prostata tumorvekst ble sammenlignet i TRAMP og TRAMP
fmsmic-1 mus. Ved starten av studien 60 TRAMP og 60 tramp
fmsmic-1 mus, 15 av hver for hver etappe, var forhåndstildelt å bli ofret på ulike tidspunkter fra tidlig til avanserte kreft stadier (8, 17, 25 og 33 ukers alder). Ytterligere 3 mus ble tildelt til TRAMP, 33-ukers gruppe som tre av de opprinnelige mus i denne gruppen døde eller nådd etiske endepunktene mellom 23 og 33 ukers alder. For hver av de 60 musene obdusert, ble den skåret ut GU. Total GU, prostata og sædvæske vekt ble målt og prostata dimensjoner registrert. Alle målinger ble normalisert for donor mus totale kroppsvekten. Etter dette ble det vev som brukes for prostata svulst gradering.
Prostata Tumor Grading
Prostata vev fra 8, 17, 25 og 33 uker gamle TRAMP og tramp
fmsmic-1 mus over , ble plassert i en kassett og fiksert i 10% nøytral bufret formalin. Man sørget for å plassere og legge prostata fra alle musene i dette forsøk i samme retning. Snittene ble tatt på 200
–
mikrometer intervaller til vevet i blokken ble oppbrukt. Lysbilder ble farget med hematoksylin og eosin og alle delene for individuelle dyr ble undersøkt ved hjelp av lys mikroskopi, av en histopathologist opplevd i prostata patologi. Den histopathologist var blindet med hensyn til genotype av musene fra hvor svulsten oppsto. De vev seksjonene ble gradert ved hjelp av kriteriene for Gingrich et al [47]. I korthet (
en
) normal epitel ble tildelt en score på 1; (
b
) lav grad av prostata intraepitelial neoplasi (PIN) med tufte av Epitel og økt cellekjernen til cytoplasma ratio ble scoret som 2; (
c
) høygradig PIN med bemerket cribiform strukturer og en økning i mitotisk og /eller apoptotiske tall ble scoret som 3; (
d
) godt differensiert adenokarsinom med tap av interductal mellomrom og invasjonen av basalmembraner ble scoret som 4; (
e
) moderat differensiert adenokarsinom med totalt tap av ductal lumen med bevis for adenokarsinom ble scoret som 5; og (
f
) dårlig differensiert adenokarsinom med plater av anaplastiske celler ble scoret som 6. Hver seksjon fra hver mus ble gradert og andelen av prostata påvirkes av hver klasse ble estimert. Dataene fra alle delene i en gitt mus ble slått sammen for å gi en gjennomsnittlig andel av prostata påvirkes av hver prostatakreft klasse.
Identifikasjon av Tumor metastaser
Vi beregnet forekomst av metastaser på dødstidspunktet eller culling i overlevelse gruppe TRAMP og TRAMP
fmsmic-1 mus. Ved obduksjon bekken lymfeknuter, nyre, lever og endetarmssvulster (hvis den finnes) ble høstet og fiksert i 10% nøytral bufret formalin. Lungene ble skåret ut, veiet og fiksert i Bouins fiksativ (Sigma-Aldrich) for å visualisere og telle lungetumorkolonier. Metastatiske lesjoner på alle organene ble talt under et dissekere mikroskop. Noen av lesjoner ble bekreftet ved H E farging og videre ved farging av frosne vevssnitt med anti Tag antistoff (Santa Cruz) for å bekrefte prostatahyperplasi opprinnelsen av svulsten
For å sikre nøyaktigheten av metastase data innhentet. fra overlevelse gruppe mus de undersøkte vi en ytterligere kohort av TRAMP (n = 59) og TRAMP
fmsmic-1 (n = 33) mus. I denne gruppen, bestemt vi andelen av mus med metastaser som døde mellom 18-40 uker, en periode hvor tramp og tramp
fmsmic-1 mus nå etiske endepunktene i samme takt.
Evaluering av
MIC-1 /GDF15
Expression ved QRT-PCR
MIC-1 /GDF15
uttrykk i prostata på 8, 17 og 25 uker TRAMP (n = 5) og TRAMP
fmsmic-1 (n = 5) mus ble bestemt ved QRT-PCR og normalisert til
B-aktin plakater (huset holde genet) uttrykk. Prøver ble samlet sammen og plasseres umiddelbart i 1 ml RNAlater (Qiagen) for lagring ved -20 ° C inntil ekstraksjon. RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol (Invitrogen) og Ambion Purelink RNA Mini Kit (Invitrogen) med på kolonne DNase trinn utføres ved hjelp av RNA-Free DNase Set (Qiagen). AMV revers transkriptase (Roche Applied Sciences) ble anvendt for å utføre revers transkripsjon på 2 ug av RNA fra hver prøve. De spesifikke primere for PCR for mus
MIC-1 /GDF15
var, Forward: 5′-AGGACTCGATCAGAACCAAG-3 «og bakover: 5′-CGGTTGACGCGGAGTAGCA-3» og for
B-aktin
var Forward: 5′-TGACAGGATGCAGAAGGAGATTACTG-3 «og bakover: 5′-CCACCGATCCACACAGAGTACTTG-3». Utvannet cDNA prøvene (1:10) ble utsatt for PCR forsterkning med 25 mM MgCl
2 (Roche Applied Sciences), Taq polymerase (Roche Applied Sciences) og SYBR Grønn jeg fargestoff (Invitrogen). QRT-PCR ble utført på LightCycler LC480 instrument (Roche Applied Sciences). Reaksjonsblandingen ble denaturert ved 95 ° C i 10 s, etterfulgt av 60 til 67 ° C gløding i 15 s, og forlengelse ved 72 ° C i 20 sek. Spesifisiteten til produktene ble bekreftet ved å smelte kurver generert av LightCycler 480 software versjon 1.5 og ved PCR-størrelse på elektroforetiske geler produkt. Gene kopiantall for både
MIC-1 /GDF15 Hotell og
B-aktin
ble beregnet ved å lage standardkurver generert ved å forsterke seriefortynnet
MIC-1 /GDF15 Hotell og
B-aktin
PCR produktene. Cp verdier av prøvene ble bestemt ved bruk av andre avledede beregninger utført av LightCycler 480 programvareversjon 1.5.
MIC-1 /GDF15
kopiere numre ble normalisert til
B-aktin
kopiere nummeret.
Relativ
MIC-1 /GDF15
uttrykk i TC1- T5 cellelinjen ble også estimert ved QRT-PCR og sammenlignet med det i avansert TRAMP og TRAMP
fmsmic-en prostatakreft. TC1-T5-celler ble dyrket i seks-brønners plater som nedenfor. RNA fra TC1-T5-celler (n = 3) ble ekstrahert ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen). RNA fra TRAMP (n = 3) og TRAMP
fmsmic-1 (n = 3) prostata svulst ble ekstrahert som beskrevet ovenfor. 2 ug RNA fra hver prøve ble reverstranskribert og underkastet QRT-PCR ved anvendelse av den samme fremgangsmåte og
MIC-1 /GDF15
primersett som ovenfor.
TBP
ble forsterket som et husholdningsgenet bruker primer satt Forward: 5′-ACCCTTCACCAATGACTCCTATG-3 «og bakover: 5′-ATGATGACTGCAGCAAATCGC-3». Spesifisiteten av produktene ble bekreftet ved å smelte kurver generert av LightCycler 480 programvare versjon 1.5 og etter størrelse på elektro geler. Relative forholdet av
MIC-1 /GDF15
til
TBP
ble deretter beregnet ved hjelp LightCycler 480 programvare versjon 1.5.
Evaluering av TC1-T5 tramp lungesvulster
TRAMP C1 (TC1) er et androgen avhengige PCa cellelinje avledet fra TRAMP prostata svulst av Foster et al. [48]. TC1-T5 er et androgen uavhengig underlinjen av TC1 cellelinje [49]. TC1-T5 celler uttrykker ikke MIC-1 /GDF15 i kultur og er derfor egnet til å vurdere virkningene av MIC-1 /GDF15. TC1-T5-celler ble dyrket i DMEM-media (Invitrogen, Life Technologies) inneholdende 5% av trekull dekstran strippet føtalt kalveserum og 125U /l insulin (Humulin-BD Biosciences). For direkte å teste om TC1-T5-celler ville metastasise mer i MIC-1
FMS-mus, injisert vi 5 x 10
5-celler i et totalvolum på 100 ul via halevenen til 9 uker gamle MIC 1
FMS (n = 17) og syngene C57BL /6 (n = 14) mus. Ti uker senere ble musene avlivet; lungene ble skåret ut og fiksert i Bouin er fiksativ (Sigma-Aldrich). Lunge kolonier på overflaten av alle lobene av begge lunger ble talt under et disseksjonsmikroskop.
Statistical Analysis
Statistiske evalueringer av alle eksperimenter ble utført med GraphPad Prism programvare, versjon 5 (GraphPad Software , San Diego, CA, USA). Alle dataene er presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Sammenligninger mellom grupper ble gjort ved hjelp av uparet
t
tester eller Chi-kvadrat test som hensiktsmessig og tosidig p-verdier rapportert. Overlevelseskurver ble analysert ved Kaplan-Meier analyse og log-rank statistikken rapporteres. For å undersøke forholdet mellom metastaser med overlevelse gang vi brukte multivariat analyse. Alle faktorer signifikant assosiert med spredning av univariat regresjon ble inkludert i en multivariat regresjonsmodell med overlevelse. En p-verdi mindre enn 0,05 ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Overuttrykte av MIC-1 /GDF15 Forlenger PCa overlevelse i Tramp Mus
For å kunne vurdere virkningene av MIC -1 /GDF15 på total overlevelse av Tramp mus, overvåket vi en kohort av TRAMP og TRAMP
fmsmic-1 mus til døden eller etisk endepunkt. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste at dobbelt transgen TRAMP
fmsmic-1 overlevde betydelig lengre enn Tramp mus (Fig. 1A, p
=
0,0002, log-rank test).
Totalt overlevelse av individuelle mus fra fødsel til død vises (panel A). Overlevelsesdata for TRAMP (-▴-) og TRAMP
fmsmic-en (-Δ-) mus ble plottet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden. Den log-rank statistikk for median overlevelse tid vises. Den urin (GU), sædvæske (SV) og prostata svulst størrelser i TRAMP
fmsmic-en og tramp mus (n = 15 /gruppe) ofret på 8, 17, 25 og 33 ukers alder er vist i panel B , C og D. GU (panel B), SV (panel C) og prostatavekter (panel D) er presentert som gjennomsnitt mg vekt /g kroppsvekt ± SEM. p-verdiene er vist som * p
0,05; ** P
0,01; *** P
0,001
I utgangspunktet både TRAMP og TRAMP
fmsmic-1 mus døde i en lignende hastighet.. Men etter ca 38-40 uker, Tramp mus begynte å bukke raskere enn TRAMP
fmsmic-1 mus. Den 50% overlevelse på 40 uker i TRAMP mus ble utvidet til 51 uker i TRAMP
fmsmic-en gruppe. Videre mens bare 9,4% av TRAMP mus overlevde i uke 50, 52% av TRAMP
fmsmic-1 mus var fortsatt i live (Fig. 1a). Over alt, gjennomsnittlig overlevelse for TRAMP
fmsmic-1 mus var 47,4 uker, og var 41 uker for Tramp mus. Derfor, i gjennomsnitt, overlevde TRAMP
fmsmic-1 mus ca 7,4 uker (~ 2 måneder) lengre enn Tramp mus. Disse dataene indikerer at økt uttrykk av MIC-1 /GDF15 er i stand til å vesentlig forbedre PCa relatert overlevelse i tramp mus.
Overuttrykte av MIC-1 /GDF15 begrenser PCa Vekst
For å direkte vurdere virkningen av MIC-1 /GDF15 på prostatakreft vekst, tildelt vi 60 TRAMP og 60 TRAMP
fmsmic-1 mus ved 4-6 ukers alder og hentet dem gradvis gjennom 8-33 ukers alder. Sammenligninger ble gjort ved hjelp av 15 mus forhånds tildelt hver gruppe på fire forskjellige tidspunkter (8, 17, 25 og 33 uker), som representerer svært tidlig til avanserte kreft stadier. Data fra mus avlivet ved hvert tidspunkt indikerte at TRAMP
fmsmic-1 mus hadde signifikant mindre GU komplekser enn TRAMP-mus (figur 1B.) På alle stadier (p = 0,0004 p = 0,0005, s 0,0001, og p = 0,02, henholdsvis).
Når prostata og SV vekter ble analysert separat fra GU-komplekset, ble SV tumor størrelser betydelig redusert i TRAMP
fmsmic-1 mus ved alle tidspunkter (fig. 1C). En lignende, men mer variert, effekt av MIC-1 /GDF15 overekspresjon ble observert på prostatatumorvekst (Fig. 1D). Det var 17,0% og 26% reduksjon i prostata svulst vekt i uke 8 og 25 i henholdsvis TRAMP
fmsmic-en sammenlignet med tramp mus (p
=
0,04 og 0,01, henholdsvis). Selv om det ikke ble redusert tumorvekt i TRAMP
fmsmic-1 mus ved 17 uker ( 10%), forskjellen mellom de to gruppene var ikke signifikant. Ved 33 uker, selv om det var 55% reduksjon i den gjennomsnittlige prostatavekt i TRAMP
fmsmic-1-mus sammenlignet med det i tramp mus var forskjellen mellom de to gruppene var ikke signifikant på grunn av den store variasjonen i prostata tumorstørrelsen i TRAMP gruppen. Andre mus trengs for å bli tildelt denne gruppen så mange av de som opprinnelig ble randomisert musene døde /nådd etisk sluttpunktet mellom 23 og 33 uker, potensielt forspenning tramp resultatene, ved valg av TRAMP mus med mindre svulster. Disse mus med mindre svulster var mer sannsynlig å overleve til 33 ukers alder og velges. Men dataene foreslått, i samsvar med overlevelse kohort data, at MIC-1 /GDF15 overekspresjon reduserer tumorvekst.
TRAMP
fmsmic-1 mus har lavere karakter Kreft
I tillegg å følge tumorvekst, bestemt vi om MIC-1 /GDF15 kan også påvirke PCa klasse, ved å sammenligne histopatologiske score i TRAMP og doble transgen TRAMP
fmsmic-en prostatakreft. I uke 8, lav (grad 2) og høy (grad 3) karakter PIN var de dominerende patologi i TRAMP og TRAMP
fmsmic-en mus. Mens den gjennomsnittlige andelen av prostata påvirkes av PIN var høyere i TRAMP forhold til trampe
fmsmic-1 mus; men denne forskjellen var ikke statistisk signifikant (fig. 2A).
prostates av 15 TRAMP og 15 TRAMP
fmsmic-1 mus ble skåret ut ved uke 8 (panel A), 17 (panel B), 25 (panel C), og 33 (panel D). Seriesnitt ble gradert og score for hver klasse ble i gjennomsnitt for alle musene i gruppen. Grafen representerer gjennomsnittlig andel av prostata fra alle mus i den gruppe som har hver forskjellige patologiske karakter, mottok mellom 1 og 6 ± SEM. Tall på søylene viser antall mus i gruppen har en spesiell karakter. p-verdiene er vist som * p
0,05; ** P
0,01; *** P
.
0,001
I uke 17, klasse 2 og grad 3 patologier var fremdeles dominerende i begge mus linjer, men grad 4, 5 og 6 svulster begynte dukker opp i tramp prostata. På dette tidspunktet Tramp mus hadde betydelig mer Grad 3 sykdom (p 0,0001) og betydelig mindre grad 2 sykdom (p 0,0001). Enn TRAMP
fmsmic-1 mus indikerer raskere tumorprogresjon (Fig. 2B)
Ved 25 ukers alder, grad 4 svulster var mer fremtredende i Tramp mus, men regioner i grad 2 og grad 3 svulst var fortsatt til stede i begge mus linjer. Sammenligning mellom enkelte kreft karakterer i TRAMP og TRAMP
fmsmic-en prostata viste at en høyere prosentandel av TRAMP
fmsmic-en prostata hadde de lavere klassetrinn 2 og 3 svulster (p
=
0,004 og henholdsvis 0,02,) mens en betydelig lavere andel av TRAMP
fmsmic-en prostata hadde de mer aggressive Grad 4 svulster (fig. 2C, p
=
0,019).
av 33 ukers alder (fig. 2D), de fleste av musene i begge gruppene, hadde langt fremskreden sykdom og forskjellen i fordelingen av tumor karakterer mellom TRAMP og TRAMP
fmsmic-1 mus var ikke signifikant. Igjen disse dataene kan ha blitt påvirket av valg skjevhet i 33 uker TRAMP gruppe, omtalt ovenfor. Mus i TRAMP gruppe med mer aggressive svulster døde før 33 ukers alder, og bare mus med mindre aggressive svulster overlevd til denne alderen. Samlet er disse dataene antydet at Tramp
fmsmic-1 mus har en større andel av prostata til en lavere svulst grad enn TRAMP mus (Fig. 2A, B, C og D), noe som indikerer at MIC-1 /GDF15 overekspresjon bremser lokal svulst evolusjon.
TRAMP prostata Mangler MIC-1 /GDF15 Expression
for å utelukke muligheten for at uttrykket av MIC-1 /GDF15 av kreft i tramp mus kan påvirke på svulst vekst og endre forskjeller mellom dem og mus konstruert for å overuttrykker dette cytokin, kvantifisert vi MIC-1 /GDF15 uttrykk i prostata og sædvæske svulster fra TRAMP og TRAMP
fmsmic-1 mus. På grunn av utilgjengelighet av en etablert mus MIC-1 /GDF15 ELISA og en spesifikk anti mus MIC-1 /GDF15 monoklonalt antistoff, brukte vi QRT-PCR for å sammenligne MIC-1 /GDF15 uttrykk i TRAMP og TRAMP
fmsmic-en prostata og primære svulster. Det var ubetydelig MIC-1 /GDF15 uttrykk i Tramp mus, som er villtype for MIC-1 /GDF15, 8, 17 og 25 ukers alder (Fig. 3A) og med avanserte svulster (Fig. 3B). I motsetning TRAMP
fmsmic-1 mus uttrykt 44-166 ganger mer MIC-1 /GDF15 (Fig. 3A) i deres prostata som er forenlig med C-FMS drevet MIC-1 /GDF15 transgene uttrykk fra infiltrere myeloide celler.
(A)
MIC-1 /GDF15
uttrykk ble kvantifisert ved QRT-PCR i prostata av TRAMP og TRAMP
fmsmic-en mus på 8, 17 og 25 uker og normalisert til
B-aktin uttrykk
som beskrevet i materialer og metoder. (B) Relative
MIC-1 /GDF15
ekspresjon ble kvantifisert ved QRT-PCR i TC1-T5 cellelinje (n = 3) og sammenlignet med TRAMP (n = 3) og TRAMP
fmsmic- 1 (n = 3) prostatatumor etter normalisering med
TBP
uttrykk. Verdiene er presentert som gjennomsnitt normalisert
MIC-1 /GDF15
uttrykk ± SEM. p-verdiene for den tosidige uparede
t
test er vist som *** p
.
0,001
Mens TRAMP
fmsmic-en mus leve lenger de har mer metastaser
Siden metastase er den viktigste årsaken til død av solide svulster hos pasienter med PCA vurderte vi effekten av MIC-1 /GDF15 på forekomst og omfang av metastaser i Tramp mus. Selv Tramp
fmsmic-1 mus lever lenger og har lavere primærtumorvekst (Fig. 1 A, B, C og D), en betydelig høyere andel av disse musene viste organer med metastaser. 15 av 30 (50%) TRAMP
fmsmic-en mus hadde fjernt organ metastaser i forhold til 6 av 30 (20%) av Tramp mus (fig. 4A). En signifikant høyere andel av TRAMP
fmsmic-en mus hadde makroskopisk detekterbare metastatiske lesjoner i lever, nyre og endetarm. Mens andelen av TRAMP
fmsmic-1 mus med overflatelungesvulster ble også økt, falt dette kort av statistisk signifikans (fig. 4A). Interessant endetarms metastaser utviklet i 6 av 30 TRAMP
fmsmic-en, men ikke i noen av Tramp mus (fig. 4A). Det var ingen forskjell i lymfeknute vekt (data ikke vist), noe som tyder på at lymfatisk spredning ikke ble øket i TRAMP
fmsmic-1 mus. For å sikre at økningen i antall metastaser var ikke utelukkende på grunn av økt overlevelse ganger vi undersøkte data tilgjengelig ved multivariate logistisk regresjon. Denne analysen bekreftet at økningen i metastaser var uavhengig av lengden av overlevelse (p = 0,03; multivariabel regresjon). Videre var det bemerkelsesverdig at dette skjedde i møte med mindre svulster og lavere kreft karakterer i alle stadier av sykdommen, noe som tyder mekanismer uavhengig av effekten av MIC-1 /GDF15 på den primære svulsten.
(A) sammenligning mellom andel TRAMP (n = 30) og TRAMP
fmsmic-1 (n = 30) mus som har fjernt organ metastaser. Dataene blir analysert ved hjelp av Chi-kvadrat-test.
