Abstract
Det er vel etablert at lungesvulster indusere dannelsen av lymfekar. Men de molekylære mekanismene som styrer svulst lymphangiogenesis i lungekreft er ikke fullstendig avgrenset. I denne studien identifiserer vi et panel av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer som induserer lymphangiogenesis og bruke genome-wide mRNA uttrykk for å karakterisere de molekylære mekanismene som regulerer svulst lymphangiogenesis. Vi viser at Calu-1, H1993, HCC461, HCC827, og H2122 NSCLC cellelinjer danne svulster som induserer lymphangiogenesis mens Calu-3, H1155, H1975 og H2073 NSCLC cellelinjer danne svulster som ikke induserer lymphangiogenesis. Ved å analysere genom-wide mRNA uttrykk data, identifiserer vi en 17-genekspresjon signatur som skiller lymphangiogenic fra ikke-lymphangiogenic NSCLC cellelinjer. Viktigere er VEGF-C den eneste lymfatiske vekstfaktor i dette uttrykket signatur, og er omtrent 50 ganger høyere i lymphangiogenic gruppen enn i den ikke-lymphangiogenic gruppe. Vi viser at tvangs uttrykk for VEGF-C av H1975 celler induserer lymphangiogenesis og at knockdown av VEGF-C i H1993 celler hemmer lymphangiogenesis. I tillegg viser vi at triple angiokinase inhibitor, nintedanib (lite molekyl som blokkerer all FGFRs, PDGFRs, og VEGFRs), undertrykker svulst lymphangiogenesis i H1993 svulster. Sammen utgjør disse data tyder på at VEGF-C er den dominerende driveren av svulst lymphangiogenesis i NSCLC og avslører en spesifikk terapi som potensielt kan blokkere svulst lymphangiogenesis i NSCLC
Citation. Regan E, Sibley RC, Cenik BK, Silva A, Girard L, Minna JD, et al. (2016) Identifisering av genuttrykk Forskjeller mellom Lymphangiogenic og Non-Lymphangiogenic ikke-småcellet lungekreft cellelinjer. PLoS ONE 11 (3): e0150963. doi: 10,1371 /journal.pone.0150963
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 15 november 2015; Godkjent: 21 februar 2016; Publisert: 07.03.2016
Copyright: © 2016 Regan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Microarray resultater for NSCLC cellelinjer brukt i denne studien ble tidligere utgitt og arkiveres på Gene Expression Omnibus repository (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/; GEO sjonsnummer: GSE32036).
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av oppstartsmidler fra Kirurgisk avdeling ved UT Southwestern Medical Center til MTD og med en karriereutvikling pris fra NCI SPORE P50CA70907 til MTD. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall blant menn og kvinner i USA [1]. Lungekreftpasienter dør vanligvis fra effekten av metastaser på fjerntliggende organer. Lunge kreftceller vanligvis vises i regionale lymfeknuter før de blir observert i fjerntliggende organer. Av denne grunn er lymfeknuter tenkt å fungere som «kanarifugler i en kullgruve» og evalueres for å finne ut om kreftcellene har spredt seg fra sitt primære område [2]. Tilstedeværelsen av kreftceller i lymfeknuter er assosiert med en dårlig prognose, og er en av de viktigste prediktor for pasientens resultater for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og andre karsinomer [2, 3]. Denne klinisk observasjon drevet intens forskningsinnsats for å identifisere prosesser som styrer lymphogenous spredning av kreft, og i 2001 ble det rapportert at lymphangiogenesis, som er den spirende av nye lymfekar fra pre-eksisterende fartøy, letter metastaser til lymfeknuter [4- 6]. Dette landemerket funn antent stor interesse for å kartlegge de molekylære mekanismene som styrer svulst lymphangiogenesis.
I løpet av de siste 15 årene, betydelig fremgang har blitt gjort i feltet av svulsten lymphangiogenesis forskning. Vekstfaktorer så som Adrenomedullin, Angiopoietin-1, Angiopoietin-2, HGF, Netrin-4, PDGF-BB, VEGF-A, VEGF-C, og VEGF-D har alle blitt rapportert å fremme tumor lymphangiogenesis [4-12]. Til tross for denne fremgangen, de nøyaktige mekanismene som styrer svulst lymphangiogenesis forbli ufullstendig forstått. Dette er delvis fordi mange studier på tumor lymphangiogenesis bruke cellelinjer som er genmodifisert til å overuttrykker en lymfatisk vekstfaktor [4-12]. Selv om evalueringen av genmodifiserte cellelinjer har gitt verdifull informasjon om hvilken rolle lymfekar tjene i tumorer, har de ikke kaste lys over de nøyaktige mekanismene som kreftceller induserer dannelsen av lymfekar. En bedre forståelse av de molekylære mekanismene som styrer svulst lymphangiogenesis er nødvendig for å utvikle behandlinger som potensielt kan hindre spredning av kreft og forbedre klinisk utfall av pasienter med tidlig stadium sykdommen. Derfor setter vi ut for å identifisere et panel av cellelinjer som induserer lymphangiogenesis og bruke genom-wide mRNA expression data for å identifisere de molekylære mekanismene som styrer svulst lymphangiogenesis i NSCLC.
Resultater
Identifikasjon av lymphangiogenic og ikke-lymphangiogenic NSCLC cellelinjer
for å identifisere NSCLC cellelinjer som induserer lymphangiogenesis, farget vi et panel av 13 NSCLC svulst xenograft prøver fra tidligere dyreforsøk med antistoffer mot LYVE-1 og podoplanin (fig 1). Disse er to vanlig anslåtte markører for lymfatisk endotelceller. Et antistoff mot glattmuskel aktin (SMA) ble inkludert i podoplanin flekken for å skille podoplanin-positive lymfekar (podoplanin +; SMA-) fra podoplanin-positive fibroblaster (podoplanin +; SMA +). Graden av lymphangiogenesis ble kvantifisert ved å telle antall intratumorale lymfekar pr mikroskopisk felt og tumorer ble klassifisert som å være lymphangiogenic om de inneholdt mer enn 5 lymfekar pr mikroskopisk felt eller ikke-lymphangiogenic hvis de fullstendig manglet intratumorale lymfekar. Gjennom denne analysen, var vi i stand til å identifisere et panel av lymphangiogenic (Calu-1, H1993, HCC461, HCC827, og H2122) og ikke-lymphangiogenic NSCLC cellelinjer (Calu-3, H1155, H1975 og H2073) (fig 1) .
(A) Representative bilder av lungen tumorxenografter farget med et antistoff mot LYVE-1 (rød) (B) Representative bilder av lungen tumorxenografter farget med antistoffer mot podoplanin (grønn) og glatt muskulatur aktin (SMA , rød). (C) Graf som viser intratumoral lymfekar tetthet for podoplanin og LYVE-1 positive lymfekar i NSCLC xenografter dyrket i mus. Vi klassifisert Calu-en, HCC827, HCC461, H1993 og H2122 celler som lymphangiogenic og Calu-3, H1155, H1975 og H2073 som ikke-lymphangiogenic. Grafen viser gjennomsnitt ± SEM.
VEGF-C regulerer lymphangiogenesis av NSCLC celler
Etter å identifisere lymphangiogenic og ikke-lymphangiogenic NSCLC cellelinjer, vi setter ut for å finne forskjellene mellom disse to gruppene . Vi fant ut at det var ingen åpenbare forskjellen i veksttakten av lymphangiogenic og ikke-lymphangiogenic subkutane transplantater (fig 2). Vi fant også at muligheten for en cellelinje for å indusere lymphangiogenesis ikke var relatert til sin subtype klassifisering (adenokarsinom, plateepitelkarsinom, eller stor celle), stedet for opprinnelse (primærtumor versus metastase), eller mutasjonsstatus (tabell 1 og 2 ).
(A) Diagram som viser vekst av lymphangiogenic (Calu-en, HCC827, HCC461, H1993 og H2122) svulster. (B) Diagram som viser vekst av ikke-lymphangiogenic (Calu-3, H1155, H1975 og H2073) svulster. Grafen viser gjennomsnitt ± SEM.
Vi deretter analysert genom-wide mRNA expression data for å identifisere gener differensielt uttrykt mellom lymphangiogenic (Calu-1, H1993, HCC461, HCC827, og H2122 ) og ikke-lymphangiogenic (Calu-3, H1155, H1975 og H2073) celler. Denne analysen ga en 17-genekspresjon signatur som skilte lymphangiogenic fra ikke-lymphangiogenic NSCLC celler (figur 3). Vaskulær endotelial vekstfaktor C (VEGF-C), en ligand med reseptor-tyrosin-kinaser VEGFR2 og VEGFR3, var den eneste gen i denne signatur rapportert å stimulere lymphangiogenesis og var omtrent 50 ganger høyere i lymphangiogenic gruppen enn de ikke-lymphangiogenic gruppe . Vi har bekreftet at VEGF-C ble uttrykt ved et høyere nivå i lymphangiogenic celler enn ikke-lymphangiogenic cellene ved kvantitativ PCR (figur 3).
(A) Microarray resultater som viser gener differensielt uttrykte mellom lymphangiogenic (Calu-1, HCC827, HCC461, H1993 og H2122) og ikke-lymphangiogenic (Calu-3, H1155, H1975 og H2073) celler. (B) Kvantitativ PCR-resultater som viser at VEGF-C uttrykkes på et høyere nivå i lymphangiogenic enn i ikke-lymphangiogenic NSCLC-cellelinjer. VEGF-C-verdier er normalisert til husholdningsgenet GAPDH. Verdier for NSCLC cellelinjene er normalisert til en udødeliggjort human bronkial epitel cellelinje (HBEC3KT).
For å finne ut om VEGF-C uttrykk var tilstrekkelig til å indusere lymphangiogenesis av NSCLC celler, vi genmodifisert H1975 celler å stabilt uttrykke enten rød fluorescerende protein (RFP, H1975-Ctrl) eller full lengde human VEGF-C (H1975-VEGFC). Revers-transkripsjon PCR-analyse viste at H1975-VEGFC-celler uttrykte et høyt nivå av VEGF-C (figur 4). I tillegg kvantitativ PCR-analyse viste at nivået av VEGF-mRNA C er ca. 3 ganger høyere hos H1975-VEGFC celler enn H1993-celler (data ikke vist). Vi injisert disse cellene i flankene av NOD /SCID-mus og funnet ut at H1975-VEGFC svulster vokste noe raskere enn H1975-Ctrl svulster (fig 4). Tettheten av intratumorale blodkar var ikke signifikant forskjellig mellom H1975-VEGFC tumorer (16,18 ± 1,998, n = 7) og H1975-Ctrl tumorer (13.75 ± 1.263, n = 7, fig 4). Imidlertid tettheten av intratumorale lymfekar var signifikant større i H1975-VEGFC tumorer (11,83 ± 3,125, n = 7) enn H1975-Ctrl tumorer (0,4286 ± 0.4286 N = 7; figur 4). Disse data viser at tvangs ekspresjon av VEGF-C er tilstrekkelig til å indusere lymphangiogenesis ved en NSCLC cellelinje.
(A) RT-PCR-resultater som viser at H1975-VEGFC-celler, men ikke H1975-Ctrl-celler, uttrykker VEGF C. (B) Tumor vekstkurver for mus injisert subkutant med enten H1975-Ctrl eller H1975-VEGFC celler. (C, D) Representative bilder av H1975-Ctrl og H1975-VEGFC tumorsnitt farget med et anti-endomucin antistoff. (E) Antallet blodkar per mikroskopiske feltet er ikke signifikant forskjellig mellom H1975-Ctrl tumorer (13,75 ± 1,263, n = 7) og H1975-VEGFC tumorer (16.18 ± 1.998, n = 7). (F, G) Representative bilder av H1975-Ctrl og H1975-VEGFC tumorsnitt farget med en anti-LYVE-1 antistoff. (H) Det er betydelig mer lymfekar per mikroskopisk felt i H1975-VEGFC tumorer (11,83 ± 3,125, n = 7) enn i H1975-Ctrl tumorer (0,4286 ± 0,4286 N = 7). **
P
0.01
For å finne ut om VEGF-C uttrykk var nødvendig for NSCLC celler for å indusere lymphangiogenesis, vi genmodifisert H1993 celler til å stabilt uttrykke enten grønt fluorescerende protein. (GFP, H1993-Ctrl) eller en shRNA mot VEGF-C (H1993-shVEGFC). Effektiv knockdown av VEGF-C i H1993-shVEGFC celler ble vist av kvantitativ PCR (fig 5). Vi fant ut at det ikke var noen forskjell i vekst mellom H1993-shVEGFC og H1993-Ctrl tumorer (figur 5), og at tettheten av intratumorale blodkar var ikke signifikant forskjellig mellom H1993-shVEGFC tumorer (10,42 ± 1,182, n = 7) og H1993 -Ctrl tumorer (11,17 ± 0.7817, n = 6, fig 5). Men tettheten av intratumorale lymfekar var betydelig lavere i H1993-shVEGFC tumorer (0,61 ± 0,400, n = 7) enn H1993-Ctrl tumorer (27.61 ± 1.391, n = 6, fig 5). Disse resultatene viser at VEGF-C er nødvendig for NSCLC celler for å indusere tumor lymphangiogenesis.
(A) qPCR resultater som viser at H1993-shVEGFC celler uttrykker et lavere nivå av VEGF-C enn H1993-Ctrl celler. (B) Tumor vekstkurver for mus injisert subkutant med enten H1993-Ctrl eller H1993-shVEGFC celler. (C, D) Representative bilder av H1993-Ctrl og H1993-shVEGFC tumorsnitt farget med et anti-endomucin antistoff. (E) Antallet blodkar per mikroskopiske feltet er ikke signifikant forskjellig mellom H1993-Ctrl tumorer (11,17 ± 0,7817, n = 6) og H1993-shVEGFC tumorer (10,42 ± 1.182, n = 7). (F, G) Representative bilder av H1993-Ctrl og H1993-shVEGFC tumorsnitt farget med en anti-LYVE-1 antistoff. (H) Tettheten av intratumorale lymfekar er betydelig lavere i H1993-shVEGFC tumorer (0,61 ± 0,400, n = 7) enn H1993-Ctrl tumorer (27,61 ± 1,391, n = 6). ****
P
0,0001.
Nintedanib hemmer tumor lymphangiogenesis
Deretter søkte vi å finne ut om hemming av VEGF-C /VEGFR3 signaliserer akse med en klinisk relevant forbindelse kunne undertrykke svulst lymphangiogenesis. Nintedanib er et lite molekyl-inhibitor som blokkerer alle FGFRs (IC
50 = 37-108 nM), PDGFRs (IC
50 = 59-65 nM), og VEGFRs (IC
50 = 13-34 nM ) ved binding til ATP-bindingssetet i kinasedomenet av reseptorer [13]. Nintedanib har tidligere blitt vist å blokkere tumorangiogenese og vekst i flere musemodeller [13, 14]. I tillegg har kombinasjonsterapi av nintedanib med docetaxel er rapportert å forlenge overlevelsen av stadium III /IV NSCLC pasienter som tidligere er behandlet med en platinabasert terapi [15]. For å avgjøre om nintedanib kan blokkere svulst lymphangiogenesis, analyserte vi svulster fra en tidligere studie som evaluerte effekten av nintedanib på veksten av H1993 svulster [14]. Vi har funnet at tettheten av intratumorale lymfekar var signifikant lavere i nintedanib behandlet H1993 tumor (5,254 ± 2,745, n = 5) enn kjøretøy behandlet H1993 tumor (22,19 ± 2,536, n = 6; figur 6). Disse dataene viser at nintedanib er effektiv ved å hemme tumor lymphangiogenesis.
(A, B) Representative bilder av LYVE-1-farget deler av H1993 svulster fra kjøretøy og nintedanib behandlede mus. (C) Tettheten av lymfekar i H1993 xenotransplantater er betydelig lavere i nintedanib behandlede mus (5,254 ± 2,745, n = 5) enn i bærerbehandlede mus (22,19 ± 2,536, n = 6). **
P
0.01.
VEGF-C kopiantall variasjon påvirker VEGF-C uttrykk
Kreftceller ofte gjennomgå genomisk endringer som resulterer i forsterkning og sletting av gener. Disse genomiske forandringer kan påvirke uttrykket av gener. For å avgjøre om
VEGF-C
genet forsterkes eller slettes i lungekreftceller, analyserte vi SNP array-data for 59 lunge kreft cellelinjer. Denne viste at
VEGF-C
genet ble forsterket i 22% (13/59; området mellom 3-5 kopier av
VEGFC
), til stede som 2 eksemplarer i 54% (32 /59), og slettes i 24% (14/59) av lungekreftcellelinjer som vi analysert (fig 7). For å avgjøre om endringer i antall kopier av
VEGF-C
genet påvirket uttrykk for
VEGF-C
, vi evaluert log transformert microarray verdier for
VEGF-C
i dette panelet av 59 lunge kreft cellelinjer. Denne viste at nivået av
VEGF-C
var betydelig lavere i celler som hadde sletting (3,582 ± 0,3033) av
VEGF-C
gen sammenlignet med celler som hadde enten 2 eksemplarer (7,029 ± 0,5023) eller forsterkning (8,742 ± 0,6856) av
VEGF-C
genet (fig 7). Disse data viser at
VEGF-C
kopiantall variasjon kan påvirke uttrykket nivået av
VEGF-C
.
(A) Bildet viser
VEGFC
kopitallet variant for forskjellige lungecancercellelinjer. Rader viser data for enkelte lunge kreft cellelinjer. Kolonner markere ulike posisjoner langs
VEGFC
genet. Forsterkede posisjoner er farget rød, diploide posisjoner er farget svart, og slettede regioner er farget grønn eller hvit. (B) Graf som viser log transformert
VEGF-C
mRNA nivåer fra microarray data for cellelinjer som har mer enn 2 eksemplarer (Rekkevidden er mellom 3-5 kopier av
VEGFC
), 2 eksemplarer eller mindre enn 2 eksemplarer av
VEGFC
genet. Grafen viser gjennomsnitt ± SEM. ****
P
0,0001
Diskusjoner
Studiet av molekylært kommenterte lungekreftcellelinjer har økt vår forståelse av trasé kjøre tumorigenesis og har ført til identifisering av nye biomarkører og terapeutiske mål for lungekreft . I denne studien bruker vi et panel av molekylært kommenterte NSCLC cellelinjer for å undersøke de molekylære mekanismene som styrer svulst lymphangiogenesis. Vi viser at VEGF-C uttrykk regulerer svulst lymphangiogenesis av NSCLC celler og at hemming av VEGF-C-indusert signale med nintedandinb kan blokkere svulst lymphangiogenesis av NSCLC celler.
VEGF-C har dukket opp som en sentral skikkelse i felt lymphangiogenesis forskning. VEGF-C har vist seg å være tilstrekkelig til å indusere tumor lymphangiogenesis av melanom [16, 17], brystkreft [4, 12, 18], fibrosarkom [17], og gastrisk karsinom-celler [19]. I tillegg inhibering av VEGF-C er blitt rapportert å undertrykke lymphangiogenesis av prostata [20, 21], bukspyttkjertel [22], bryst [23-25], gastrisk [26] og lungekreftceller [27]. VEGF-C-ekspresjon er også blitt rapportert å korrelere med lymfekar tetthet i mange forskjellige humane tumorer, inkludert NSCLC [28-31]. Vi viser at VEGF-C uttrykk skiller NSCLC cellelinjer som induserer lymphangiogenesis fra NSCLC cellelinjer som ikke induserer lymphangiogenesis. I tillegg viser vi ved overekspresjon og knockdown eksperimenter som VEGF-C regulerer svulst lymphangiogenesis av NSCLC celler. Disse funnene ytterligere å demonstrere betydningen av VEGF-C for å fremme tumor lymphangiogenesis og tyder på at det er den dominerende føreren av tumor lymphangiogenesis i NSCLC.
Nintedanib er et lite molekyl-tyrosinkinase-inhibitor som blokkerer alle FGF, PGDF, og VEGF reseptorer. Nintedanib ble tidligere vist for å vise anti-kreft effekt i et antall prekliniske modeller for NSCLC og i NSCLC [14, 15]. Vi viser at nintedanib kan blokkere tumor lymphangiogenesis i en musemodell av NSCLC. Selv om vi vise at nintedanib har anti-lymphangiogenic aktivitet, ble denne forbindelsen tidligere rapportert å ikke hemme tumor lymphangiogenesis i en transgen musemodell for bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster (PNET) som ble genmodifisert til å overuttrykker VEGF-C [32]. Mangelen på en anti-lymphangiogenic effekt av nintedanib i
RIP1-Tag2; RIP1-Vegfc
transgene mus kan være fordi et omfattende nettverk av uregelmessige lymfekar kan ha vært til stede i bukspyttkjertelen før starten av behandlingen. Det har blitt rapportert at nydannede lymfekar kan vedvare i lang tid etter tilbaketrekningen av VEGF-C eller i møte med anti-lymphangiogenic terapi [33]. Derfor er lymfekar som dannes i
RIP1-Tag2, RIP1-Vegfc
transgene mus før starten av behandlingen kan potensielt være motstandsdyktig mot anti-lymphangiogenic effekter av nintedanib. Alternativt kan forskjellen mellom våre funn og de av Bill et al., (2015) være fordi vi undersøkt ulike krefttyper eller fordi vi brukte en umanipulerte cellelinje og de brukte en genmodifisert modell for å overuttrykker VEGF-C.
De molekylære mekanismene som styrer
VEGF-C
mRNA nivåer er ikke godt forstått. Vi viser at endringer i antall kopier av
VEGF-C
gen påvirker uttrykket av
VEGF-C
. Vi fant at lungekreft cellelinjer som har mistet en av sine kopier av
VEGF-C
genet har en tendens til å uttrykke et lavt nivå av
VEGF-C
. Men flere mekanismer også sannsynlig kontrollere ekspresjonen av VEGF-C av NSCLC celler. MAPK, mTOR, og NF-kB signalveier har alle blitt rapportert til å styre VEGF-C-ekspresjon av kreftceller [34-37]. Disse banene kan også spille en rolle i å kontrollere uttrykket av VEGF-C av NSCLC celler. Fremtidige studier med vårt panel av cellelinjer vil bidra til å bestemme den potensielle rolle disse og andre veier i å kontrollere uttrykket av VEGF-C av NSCLC celler.
I konklusjonen, resultatene av denne studien viser at VEGF-C er en kritisk regulator av svulst lymphangiogenesis i NSCLC og vise at nintedanib hemmer tumor lymphangiogenesis. Disse funnene belyse de molekylære mekanismene kjøring svulst lymphangiogenesis og har potensial til å påvirke utformingen av fremtidige kliniske studier som tar sikte på å blokkere spredningen av tidlig stadium NSCLC.
Materialer og metoder
Etikk Statement
dyreforsøk som er beskrevet i dette manuskriptet ble utført i samsvar med et dyr protokoll (APN 2013-0121) godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av uT Southwestern Medical Center. Alle mus i denne studien ble kjøpt fra en leverandør på campus. Mus ble opprettholdt i ventilerte microisolater bur i et patogen-gratis anlegget og ble matet en standard bestrålt diett ad libitum. Musene ble gitt nestlets og igloer som berikelse elementer. Musene ble overvåket for tegn på stress som apati og endringer i pels utseende. Hvis mus dukket alvorlig syke eller døende, ville de bli avlivet ved en overdose av karbondioksid fulgt ved halshugging. Ingen mus ble alvorlig syke eller døde før den eksperimentelle endepunktet. Fremgangsmåten for eutanasi for de eksperimentelle endepunktene besto av et inhaleringsmiddel overdose av karbondioksid eller isofluran etterfulgt ved cervikal dislokasjon. Disse metodene er i tråd med anbefalinger fra American Veterinary Medical Association (AVMA) Retningslinjer for aktiv dødshjelp.
Cellelinjer
Den menneskelige bronkial epitel cellelinje (HBEC3KT) og det meste av den menneskelige NSCLC cellen linjer som brukes i denne studien (H1993, HCC461, HCC827, H2122, H1155, H1975 og H2073) ble etablert i laboratorier av Dr. Adi Gazdar og Dr. John Minna [38-40]. NSCLC cellelinjer Calu-1 og Calu-3 ble ervervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). NSCLC cellelinjer ble dyrket i DMEM + 10% FBS under standard betingelser (5% CO
2 ved 37 ° C). Den HBEC3KT-cellelinjen ble dyrket i keratinocytt-serum-fritt medium inneholdende 5 ng /ml EGF og 50 ug /ml bovint hypofyseekstrakt under standard betingelser (5% CO
2 ved 37 ° C). Alle NSCLC-cellelinjer ble DNA-fingeravtrykk og mycoplasma-testet
Kvantitativ PCR og RT-PCR
RNA ble isolert fra forskjellige cellelinjer med en RNeasy Mini Kit (Qiagen, katt nr.: 74104) og cDNA ble generert med en iScript cDNA syntese kit (Bio-Rad, kat: 170-8890). Gene-spesifikk TaqMan prober ble brukt til å analysere nivået av
VEGFC plakater (Applied Biosystems, Hs01099206_m1) og
GAPDH plakater (Applied Biosystems, Hs02758991_g1) og den komparative
C
t metoden ble brukt til å beregne relativ mRNA uttrykk nivåer. De følgende primere ble anvendt i RT-PCR-reaksjoner for å forsterke
VEGF-C plakater (5′- GTTCGTACATGGCCGTCTGT-3 «og 5′- GGACCAAACAAGGAGCTGGA-3») og
GAPDH plakater (5′- CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3 «og 5’GTTAAAAGCAGCCCTGGTGA-3»).
Generering av stabile cellelinjer
for å overuttrykker VEGF-C i en ikke-lymphangiogenic NSCLC cellelinje, infisert vi H1975 celler med kommersielt tilgjengelige lentiviral partikler som inneholder et plasmid som uttrykker full lengde human VEGF-C (Precision LentiORF VEGFC w /stoppkodon, åpen Biosystems, katten no: OHS5899-202618255). For å generere kontrollceller, infisert vi H1975 celler med lentiviral partikler som uttrykker RFP (Precision LentiORF RFP positiv kontroll, åpen Biosystems, katt no: OHS5833). Cellene ble dyrket i media inneholder blasticidin (30 ug /ml) i flere uker for å velge for stabilt transfekterte celler.
Å stabilt knockdown VEGF-C i et lymphangiogenic NSCLC cellelinje, infisert vi H1993 celler med kommersielt tilgjengelig lentiviral partikler som uttrykker en shRNA målretting VEGF-C (TRCN0000425238, Sigma, katten no: SHCLNV-NM_005429). For å generere kontrollceller, infisert vi H1993 celler med lentiviral partikler som uttrykker GFP (MISSION® TRC2 pLKO.5-puro-CMV-TurboGFP ™ positiv kontroll Transduction partikler; Sigma, katt no: SHC203V). Celler ble dyrket i medium inneholdende puromycin (1 pg /ml) i flere uker for å selektere for stabilt transfekterte celler.
Dyreforsøk
NOD /SCID-mus mottok en subkutan injeksjon av 1 million H1975- Ctrl, H1975-VEGFC, H1993-Ctrl, eller H1993-shVEGFC celler. Musene ble veid og tumorene ble målt to ganger i uken. Tumorvolumer ble beregnet med formelen
V = (a
2
xb) /2
, med
en
og
b
som representerer de små og store tumordiameter, henholdsvis. Musene ble avlivet før deres tumorer nådde 1500 mm
3 og sine vev ble samlet for histologisk analyse
Antistoffer
Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt for immunhistokjemi eller immunfluorescens farging av svulster. Geit anti-LYVE-1 (R D Systems, katt ingen AF2125.), rotte anti-endomucin (Santa Cruz, katt ingen sc-65495.), Cy3-konjugert mus anti-glatt muskel aktin (Sigma, katt ingen C6198.) og hamster anti-podoplanin (Abcam, katt nei. ab11936). Alle sekundære antistoffer ble kjøpt fra Jackson Immunoresearch.
immunfluorescens /immunhistokjemi flekker
Lysbilder ble de-paraffinized med xylen og rehydrert gjennom en synkende EtOH serien. Antigen gjenfinning ble utført med 0,01 M sitronsyre (pH 6,0) i en trykkoker. Glassene ble deretter vasket med PBS og blokkert i en time med TBST + 20% Aquablock. Primære antistoffer fortynnet i TBST + 5% BSA ble deretter tilsatt og inkubert over natten ved 4 ° C. Objektglassene ble vasket med TBST og deretter sekundære antistoffer fortynnet i TBST + 5% BSA ble tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Slides ble deretter vasket igjen med TBST og Dekk ble montert med forlenge Gold pluss DAPI. Immunhistokjemi ble utført ved hjelp av en lignende protokoll unntatt endogen peroxydaseaktivitet ble blokkert ved å inkubere lysbilder med hydrogen peroxide fortynnet i MeOH og signal ble oppdaget via DAB kromogen system (Dako, katt nei. K3468).
Kvantitativ analyse av blod og lymfekar
Lysbilder ble analysert med et Nikon Eclipse E600 mikroskop og bildene ble tatt med NIS-Elements bildebehandlingsprogrammer. For å analysere blodårene, ble 4 bilder tatt av hver svulst og antall fartøy ble regnet per mikroskopisk felt. Å analysere lymfekar, ble 3-5 bilder tatt av «hot spots» i hver svulst og antall fartøy ble regnet per mikroskopisk felt.
Mutasjon status av cellelinjer
Mutasjonen status av de cellelinjer ble bestemt ved å analysere data fra publiserte kilder [38-42] og kosmisk (Sanger Institute, UK).
Microarray analyse
RNA-kvalitet og konsentrasjon ble sjekket ved Bio- Rad Experion Bioanalyzer per produsentens protokoll. 500 ng av total RNA fra hver prøve ble benyttet for å merke probene cRNA ved Ambion Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (katt nr: IL1791). 1,5 ug av de forsterkede og merket Crna prober ble hybridisert til Illumina Menneskelig WG-6 v3.0 Expression BeadChip (kat no: BD-101-0203) over natten ved 58 ° C, deretter vasket, blokkerte og oppdaget av streptavidin-Cy3 per produsentens protokoll. Etter tørking ble chips skannet av Illumina iscan system. Bead-nivå data ble innhentet, og pre-behandlet med R-pakken mbcb for bakgrunnskorreksjon og probe samandrag (Ding et al, Nucl Syrer Res, 36: E58, 2008). Forhånds bearbeidede data ble deretter quantile-normalisert og log-transformeres. Microarray resultater for NSCLC cellelinjer ble tidligere utgitt [43] og arkiveres på Gene Expression Omnibus repository (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/; GEO sjonsnummer: GSE32036).
Forskjellig uttrykte gener mellom to klasser av prøvene ble bestemt ved å beregne ganger endring og T-test
P
verdier og bruker vilkårlige tidsavgrensninger for seleksjon (f.eks 4 ganger endring og
P
0,05.
Takk
Vi takker Rolf Brekken samt medlemmer av JMST og TIG for nyttige diskusjoner og kritisk lesing av manuskriptet.
