Abstract
Mangler ved ATM-genet er den underliggende årsaken til ataksi telangiectasia , et syndrom karakterisert ved nevrologiske, motor og immunologiske defekter, og en predisposisjon for kreft. MicroRNAs (mirnas) er nyttige verktøy for kreft profilering og prediksjon av terapeutiske svar på kliniske regimer. Vi har undersøkt konsekvensene av ATM mangel på miRNA uttrykk og tilhørende genekspresjon i normale menneskelige mammary epitelceller (HME-CCS). Vi identifiserte 81 signifikant forskjellig uttrykt mirnas i ATM-mangel HME-CCs ved hjelp av små RNA sekvensering. Mange av disse har vært implisert i tumordannelse og proliferasjon, og inkluderer nedregulert tumor suppressor mirnas, slik som HSA-MIR-29C og HSA-MIR-16, så vel som over-uttrykte pro-onkogene mirnas, slik som HSA-speil 93 og HSA-MIR-221. MikroRNA endringer ble integrert med genom brede genuttrykk profiler for å undersøke mulige miRNA mål. Forut mRNA målene for mirnas betydelig regulert etter ATM uttømming inkludert mange gener assosiert med kreft dannelse og progresjon, slik som SOCS1 og proto-onkogen MAF. Mens en rekke miRNAs har blitt rapportert som endret i kreftceller, er det liten forståelse for hvordan disse små RNA kan være drivkraften kreft formasjon eller hvordan de kan brukes som biomarkører for kreft mottakelighet. Denne studien gir foreløpige data for å definere miRNA profiler som kan brukes som prognostiske eller prediktive biomarkører for brystkreft. Vår integrerte analyse av miRNA og mRNA uttrykk tillater oss å få en bedre forståelse av signal involvert i brystkreft predisposisjon og foreslår en ordning for brystkreft utsatt fenotype sett i ATM-manglende pasienter
Citation. Hesse JE, Liu L, Innes CL, Cui Y, Palii SS, Paules RS (2013) Genome-Wide små RNA sekvensering og analyse av genuttrykk avslører en mikroRNA Profile of Cancer Følsomhet i ATM-Mangel menneskelige mammary Epitelceller. PLoS ONE 8 (5): e64779. doi: 10,1371 /journal.pone.0064779
Redaktør: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 12. desember 2012; Godkjent: 17 april 2013; Publisert: 31 mai 2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av egenutført Program av National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES021157). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ataksi telangiectasia mutert (ATM) protein spiller en avgjørende rolle i en lang rekke cellulære responser inkludert cellesyklusregulering, apoptose, og DNA skade respons. Personer med komplett mangler i ATM lider av alvorlig ataksi, immunologiske lidelser, og har forhøyet risiko for å utvikle lymfoproliferativ kreft [1]. I tillegg til fullstendig tap av ATM-funksjonalitet, er det anslått at så mange som 1% av USAs befolkning bære en mutert kopi av ATM [2], [3] og er underlagt konsekvensene av haploinsufficiency. Mens heterozygote bærere ikke lider av ataksi telangiectasia syndrom, de har en økt risiko for å utvikle hjertesykdom, diabetes og kreft, spesielt brystkreft, sammenlignet med personer med normal ATM uttrykk nivåer [2], [3]. Nyere epidemiologiske studier har vist at ATM-mutasjoner, noe som forårsaker ataksi telangiectasia i homozygot tilstand, er også brystkreft resistens alleler i heterozygote bærere [4], [5], [6], [7], [8], [9 ], [10]. I tillegg har det vært innblandet at epigenetisk stanse av ATM gjennom metylering kan også spille en rolle i brystkreft mottakelighet [11], [12]. Til tross for denne koblingen mellom reduserte minibank nivåer og brystkreft, er mangler i ATM protein ikke hyppig observert i ikke-familiære brystkreft populasjoner [13]. Denne observasjonen antyder muligheten for at signalveier eller genutrykksmønster som er under ATM kontroll kan være en plausibel mekanisme knytte ATM uttrykk status til brystkreft predisposisjon. Her foreslår vi ATM-avhengige endringer i epigenetisk regulering, særlig miRNA regulering av genekspresjon, spiller en rolle i dannelsen av brystkreft.
microRNAs (miRNA) er en stor regulatorisk klasse av små RNA som har vært beskrevet å poste-transcriptionally endre genuttrykk. Det høye nivået av bevaring i miRNA sekvenser på tvers av arter streker deres viktige regulerende rolle. Den primære virkningsmåte for miRNA regulering av genekspresjon binding til 3’UTR regionen av budbringer RNA (mRNA), som fører til en reduksjon i mengden av mRNA som er tilgjengelig i cellen, gjennom enten RNA-degradering eller forebygging av oversettelse. MicroRNAs spiller avgjørende roller i utvikling, differensiering og sykdomsutvikling, og er spådd til å målrette mer enn 60% av mRNA hos mennesker [14]. Mer nylig mirnas er blitt anvendt ved diagnose, identifisering og forutsigelse av terapeutiske responser av cancer [15], [16], [17], [18], [19], [20]. MikroRNA profilering av forskjellige typer kreft har blitt brukt for å identifisere kreftfremkall mirnas, betegnet oncomirs, så vel som tumor-suppressor mirnas [20], [21], [22]. Mange forskjellige grupper har generert miRNA profiler i brystkreftceller for å utvikle potensielle biomarkører for diagnostisering og behandling [23]. Flere mirnas vises i mange av miRNA profilering eksperimenter som blir deregulert i brystkreft. Imidlertid var de fleste av disse studier ble utført i kreftceller og svulster. Her undersøker vi hvilken rolle ATM på uttrykket nivåer og sammensetning av miRNAs i normale ikke-kreft menneskelige mammary epitelceller (HME-CC). Vi er interessert i å forstå hvordan endringer i miRNA uttrykk på grunn av ATM-mangel kan bidra til kreft predisposisjon og lokke fram endringer i normale fysiologiske veier. Utnytte Illumina Next-Generation Sequencing, utførte vi genome-wide sekvensering av små RNA fra normal villtype (WT) og ATM-mangel HME-cert. I tillegg til dyp sekvensering av små RNA, utførte vi hele genomet genekspresjonsanalyser hjelp Agilent hele genom mikromatriser. Kombinasjonen av både genekspresjon og miRNA profiler mulig for oss å identifisere mulige gen mål for betydelig regulert miRNAs. Ved å forstå komposisjon og uttrykk for miRNAs i ATM-mangel mammary epitelceller vi håper å få innsikt i mekanismene og underliggende fysiologi gjennom hvilke brystkreft tumordannelse inntektene.
Materialer og metoder
Cell kultur
HME-CC-LacZ (villtype) og HME-CC-ATM1 (ATM-mangel) menneskelige mammary epiteliale cellelinjer ble avledet som beskrevet [24]. Cellene ble dyrket og vedlikeholdes i HuMEC Ready Media (Invitrogen 12752010) med 4 mikrogram /ml blasticidin (Invitrogen 46-1120).
Cell Harvest og RNA Utvinning
Wild type og ATM-mangelfull menneske mammary epiteliale logaritmisk voksende celler ble høstet ved bruk av 0,25% trypsin-EDTA (Invitrogen 25200072), som ble nøytralisert ved bruk av TNS (Lonza CC-5002). Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av Ambion Mirvana miRNA isolasjonskit ved hjelp av standardprotokollen for total RNA isolering. Det isolerte samlede RNA ble deretter delt i porsjoner, slik at den samme RNA ble anvendt for små RNA-sekvensering og for genekspresjon analyse.
Illumina små RNA-sekvensering
Triplikate biologiske prøver av totalt RNA var sendes til NIH utført Sequencing Center. Biblioteker av små RNA cDNA ble opprettet ved hjelp av Illumina små RNA Prøvepreparering Alternative v1.5 protokoll med bare små avvik fra produsentens protokoll. Disse cDNA bibliotekene ble deretter sekvensert på Illumina Genome Analyzer IIx med 35 basepar leser i henhold til produsentens instruksjoner. Hvert bibliotek ble kjørt på ett kjørefelt i flyten celle med 36 sykluser ved hjelp Illumina versjon 5 kjemi. Etter justering til genomet, lese tellinger ble normalisert beregning mirnas per million miRNA justeringer. Listen over betydelig regulert miRNAs ble opprettet ved hjelp av en t-test analyse (p≤0.05) og fold endring (≥1.5) cut-off mellom ATM-manglende celler sammenlignet med villtype celler.
Agilent hel-genom
Isolert total RNA ble sendt til NIEHS Microarray Core-anlegg for microarray analyse. Genekspresjon analyse ble utført ved bruk av Agilent Hele menneskelige genom 4 × 44 multiplex format oligo arrays (Agilent Technologies, 014850) etter Agilent 1-farge microarray-baserte genekspresjonsanalyse protokollen. Fra og med 500 ng total-RNA, Cy3-merket cRNA ble fremstilt i henhold til produsentens protokoll. For hver prøve ble 1,65 ug av Cy3 merket CRNAs var fragmenterte og hybridisert i 17 timer i en roterende ovn hybridisering. Lysbilder ble vasket og deretter skannet med en Agilent Scanner. Data ble innhentet ved hjelp av Agilent Feature Extraction programvare (v9.5), ved hjelp av en fargeinnstillinger for alle parametre. Agilent Feature Extraction programvare utføres feil modellering, justert for additiv og multiplikativ støy. De resulterende data ble bearbeidet og analysert ved hjelp av Partek Genomics Suite (Partek® Genomics Suite programvare, versjon 6.6beta, Copyright © 2009, Partek Inc., St. Louis, MO, USA). En t-test ble utført mellom villtype og ATM-mangelprøver, genererer forbundet
p
-verdier. Kombinert med en fold endring på +/- 1,5, en
p
-verdi av ≤0.05 ble brukt til å generere en liste med forskjellig uttrykt gener.
Integrering av mikroRNA og genuttrykk data
Ved hjelp TargetScan 5.2 [14], [25], [26], en liste over biologisk spådd målene for vår forskjellig uttrykt mirnas ble bestemt. Denne listen av mål ble deretter sammenlignet med vår liste over differensielt uttrykte gener for å bestemme mulige miRNA -. MRNA interaksjoner
Funksjoner Analyser i Oppfinnsomhet
Betydelig regulert mirnas og mRNA ble analysert med Oppfinnsomhet Pathway Analysis ( IPA) [25], [26]. Nettverk og funksjonelle analyser ble generert basert på de 40 viktigste mirnas og 202 betydelige spådd genet mål kommenterte i IPA. En rett-tailed Fishers eksakte test ble brukt til å beregne en p-verdi bestemme sannsynligheten for at hver biologisk funksjon og /eller sykdom tilordnet den datasettet er grunn til tilfeldighetene alene. Funksjoner med en
p
-verdi på mindre enn 0,01 ble betraktet som signifikant.
Data Access
Data fra mikromatriser og små RNA sekvensering brukt i denne studien har blitt arkivert på . Gene Expression Omnibus database (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)
GEO tiltredelse nummer for små RNA-sekvensering er GSE36267 og kan gjennomgås på http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=jxezrakumucekru acc=GSE36267.
GEO sjonsnummer for Agilent hele genomet uttrykk rekke data er GSE36082 annonsen kan gjennomgås på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=jvixzkwsaqiqwps acc=GSE36082.
Accompanying Supplerende data består av 7 tabeller som kan bli funnet på nettet.
Resultater
Sekvensering og dataanalyse
Illumina dypt sekvensering ble brukt til å generere små RNA leser fra 3 biologiske replikat hver av villtype og ATM-mangel ikke-kreft HME-cert. Filtrering basert på kvalitetspoeng og sekvense gjenstander tillatt for valg av bare robust sekvens leser (figur 1A). Ved hjelp av FastX verktøysett [27], adapter sekvenser ble klippet fra 3′-enden av sekvensen som leser og sekvenser som ikke kan adapter-sekvens eller med mindre enn 16 nukleotider som blir igjen etter fjerning av adapteren, ble utelukket fra videre analyse. Clipped leser ble justert ved hjelp av Bowtie [28] til hg19 menneskelige genom bygge. Vi tillot ingen uoverensstemmelser i 15bp frø region av sekvensen leser og tillates inntil 3 linjer per sekvens lese. Justeringer ble merket med UCSC liten genomet spor (WgRNA) på hg19. Les tellinger ble normalisert ved å beregne koder per million miRNA justeringer (TPM). Sequence filtrering, adapter klipping, og Bowtie justeringen ble utført ved hjelp av en kombinasjon av kommandolinjeprogrammer og åpne web-basert plattform Galaxy [29], [30], [31]. Oppsummerende statistikk for alle 6 prøver ble sporet for å sikre likhet i sekvense går, justeringer og kommentarer (Figure1B).
A) Small RNA Sekvense rørledning oversikt. B) Oppsummering statistikk over små RNA sekvense data på ulike stadier av dataanalyse.
Sammensetning av miRNA i villtype og ATM-manglende celler
Neste generasjon dypt sekvensering gjør det mulig for en stor dynamisk omfang i å oppdage mirnas (tabell S1). Når du vurderer alle våre prøver, identifiserte vi 390 mirnas stede i to av tre prøver i enten villtype eller ATM-mangelfulle prøver med minst en TpM (figur 1B). Hvis du vil begrense vår analyse til bare de mest robuste mirnas, vurderte vi bare mirnas med minst 10 TpM i to av tre prøver i enten villtype eller ATM-mangel prøver i videre analyse. 259 mirnas ble vurdert til stede i alle prøver og flyttet til den neste fasen av analysen (tabell S2). Sekvens koder per million miRNA justeringer (TPM) ble importert til Partek Genomics Suite for videre analyse (Partek® Genomics Suite programvare, versjon 6.6beta, Copyright © 2009 Partek Inc., St. Louis, MO, USA). En precursory titt på uttrykket nivåer av de 259 mirnas streker den brede dynamiske område uttrykk oppdaget av neste generasjon dypt sekvensering. Vi var i stand til å detektere mirnas med bare noen få transkripter samt mirnas med robust uttrykk, slik som HSA-MIR-21, som har en gjennomsnittlig WT uttrykk for 113949 TPM. Et høyt nivå gjennomgang av den foreløpige miRNA profilen avslører spesifikke effekter av uttømming av ATM på uttrykk. Vi observerte ikke bare mirnas hvem som uttrykk ble påvirket av tap av ATM, men vi var også i stand til å identifisere mirnas som synes å være upåvirket av ATM uttømming.
Endringer i Expression Profiler av mirnas etter Nedbryting av ATM
for å vurdere omfanget og betydningen av endringen i miRNA uttrykk etter uttømming av ATM, gjennomførte vi en t-test på 259 mirnas vurderes til stede i både villtype og ATM-mangelfulle prøver. Assosierte
p-
verdiene ble beregnet og kombinert med en fold endring for å generere en liste med vesentlig forskjellig regulert (
p
≤0.05; ganger endring ≥1.5) miRNAs. Denne er identifisert 81 mirnas som vesentlig differensielt uttrykte mellom de to HME-CC-genotyper (figur 2 Tabell S3), således mer enn 30% av den miRNA vurderes til stede i analysen er signifikant forskjellig reguleres etter uttømming av ATM. Vi fant flere godt karakteriserte mirnas som var statistisk uendret etter uttømming av ATM, inkludert la-7 familie og HSA-MIR-21. Blant de 81 vesentlig regulert mirnas, er det 55 mirnas med høyere nivåer av ekspresjon og 26 sammen med lavere nivåer av ekspresjon sammenlignet med villtype HME-cert. Interessant nok har disse regulerte mirnas omfatte flere som har vært implisert i kreft formasjon eller metastase. Utnytte TAM verktøy for kommentering mirnas [32] og den menneskelige miRNA sykdom database [33], identifiserte vi 4 trykt miRNA tumor suppressors og 7 over-uttrykt oncomirs [21], [22], [34] i ATM-manglende celler (for eksempler, se figur 3). Denne observasjonen av deregulering av miRNAs viktige i kreftdannelse eller undertrykkelse antyder ATM-avhengige miRNA uttrykk endringer kan endre biologiske mekanismer og funksjonalitet som fremmer kreft formasjon. Basert på miRNA kreft profilere prosjekter, flere ATM-avhengige mirnas fortjente nærmere undersøkelse (figur 3). For eksempel tap av ATM resulterer i en redusert ekspresjon av tumor undertrykkende mirnas, speilene 96, som er kjent for å målrette KRAS [35], og den MIR-29-familien, som innbefatter MIR-29b-1, MIR-29b- 2, og MIR-29c. En reduksjon i ekspresjon av alle tre medlemmer av MIR-29-familien har blitt implisert i mange typer kreft [36], og har en sammenheng med prognose [37]. I tillegg er tap av ATM resulterer i en økning i ekspresjon av MIR-10b, som er sterkt uttrykt i metastatisk brystkreft [38], [39] og MIR-221, som kan indusere proliferasjon og celleoverlevelse [40]. For ytterligere å forstå de biologiske effektene av miRNA uttrykk endringer, vi foretok hele genomet genekspresjonsanalyse.
Differensial miRNA uttrykket mellom villtype og ATM-mangel HME-CCs hentet fra tre uavhengige replikater av hver.
y
-aksen viser ATM-mangel til WT uttrykk ratio,
x
-aksen viser gjennomsnittlig uttrykk for hver miRNA; begge aksene er i logaritmisk skala. Forskjellig uttrykt mirnas av
p
-verdi ≤0.05 og minst 1,5 ganger endring er blå. Representative betydelige mirnas er merket. Hver prøve hadde en separat generert sekvense bibliotek og ble kjørt i en individuell sekvense kjørefelt.
A) Liste over 4 kjente kreftdempere og 8 oncomirs med vesentlige uttrykk endringer etter uttømming av ATM. B) Expression nivåer, tags per million (TPM), av fire eksempler på deregulerte miRNAs. Mørkegrå søylene representerer villtype uttrykk og lys grå stolper representerer uttrykk i ATM-manglende celler. Feilfelt er standard feil fra uttrykket av 3 uavhengige replikater av hver genotype.
uttrykket av gener spådd til å bli miRNA Targets
Bruke Agilent menneskelig hele genomet microarray, samlet vi genet uttrykk data fra de samme WT og ATM-mangel HME-CC prøver. Med en kombinasjon av
p
-verdi (≤0.05) og fold endring (≥1.5) avskjær, identifiserte vi 1086 vesentlig endret sonder som representerer 988 gener eller genetiske områder (tabell S4). For å identifisere gener muligens målrettet av endringer i miRNA uttrykket, vi utnyttet TargetScan 5,2 forutsi mRNA mål på 259 betydelig regulert miRNAs. Vi begrenset den anslåtte mRNA mål, først basert på gener betydelig regulert i vår analyse av genuttrykk og andre på mål enten eksperimentelt påvist eller sterkt spådd av TargetScan. I tillegg basert på den kunnskapen som mirnas hovedsakelig regulerer genuttrykk gjennom en hemming av uttrykk, vi bare beholdt miRNA-mRNA kombinasjoner som er omvendt korrelerte, erkjenner vi kan unntatt funksjonelt viktige regulatoriske interaksjoner av mRNA. Fra og med våre 81 betydelig regulert mirnas identifiserte vi 40 som hadde svært spådd mRNA mål med betydelige endringer i forbindelse genuttrykk. Vi identifiserte 202 betydelig regulerte mRNA mål som ble omvendt korrelerte med mirnas spådd å målrette dem (tabell S5). Mange av miRNAs er spådd til å målrette flere betydelig regulert mRNA og mange av mRNA er potensielt målrettet med mer enn en ATM-avhengige miRNA. Disse fenomenene kan foreslå funksjonell redundans i miRNA regulering av målgener.
Ved hjelp av Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [41], fant vi ut at genet familier representert ved gener spådd å bli målrettet av mirnas i en minibank -avhengig måte (figur 4A). Denne tilnærmingen gir en funksjonell oversikt over genene i vår liste ved hjelp av molekylær Signaturer Database [41]. Gene familier har felles funksjoner som biokjemisk aktivitet og homologi. Interessant, mange av de forutsagte målgener av vesentlig regulert mirnas er transkripsjonsfaktorer (som vist i tabell S6), hvilket antyder at mange av de ATM-avhengige mirnas kan styre et stort fenotypiske respons basert på regulering av transkripsjonsfaktor uttrykk. Involvering av miRNA regulering av transkripsjonsfaktorer er blitt forutsagt og modellert i flere forskjellige typer av kreft [42], [43], [44]. Våre funn viser endringer i mirnas samt endring av transkripsjonsfaktor uttrykk som er oppstått etter tapet av ATM. I tillegg våre funn tyder dette endring av transkripsjonsfaktorer som kan ha oppstått før cellene blir ondartet (tabell S6). For eksempel økt uttrykk av onkogene transkripsjonsfaktorer som MAF og CEBPA indikere mirnas kan regulere store nettverk av gener involvert i kreftdannelse. Videre 6 onkogener og en kjent tumor suppressor, SOCS1, er spådd til å bli miRNA mål. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter som antyder mirnas kan spille en viktig rolle i dannelsen og utviklingen i kreft. Forstå de tidlige effekter av mirnas i reguleringen av transkripsjonsfaktorer og kreft dannelse kan føre til innsikt i prognostiske og forebyggende behandlinger.
A) Gene familier som representerer 202 betydelig regulerte gener retningslinjer GSEA å gi en funksjonell oversikt over typer gener som påvirkes av endringer i miRNA uttrykk. B) Top Funksjoner analyse av ATM-avhengige korrelerte mirnas og mulige mRNA mål av IPA. Bare utvalgte viktige funksjonelle grupper er avbildet. Den stiplede linjen viser en
p
-verdi på 0,01.
Pathway /funksjonell analyse av forventet Targets
For å få større innsikt i biologiske funksjoner og nettverk blir påvirket av ATM-avhengige endringer i miRNA uttrykk, benyttet vi Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) [45]. Funksjonsanalyse og nettverks generasjon analyse gjennom IPA tillater oss å undersøke alle mulige roller betydelig endret mirnas og deres spådd genet mål ved gruvedrift IPA Knowledge Base for å identifisere tilkobling og relasjoner mellom våre gener og mirnas av interesse. Fem nettverk ble betydelig påvirket etter uttømming av ATM, inkludert cellulære funksjoner av morfologi, cellesyklus, cellevekst og spredning. Minst 76 store funksjoner gruppene var signifikant (p 0,01) påvirket etter uttømming av ATM, med flere kreft og svulst spesifikke funksjoner blir sterkt påvirket (figur 4B). Den mest signifikant påvirket biologisk funksjon var kreft (
p
mindre enn 1 x 1010), med andre signifikant påvirket funksjoner inkludert tumor morfologi, DNA-skade og reparasjon, og celledød. (Tabell S7 viser representative gener i flere av disse funksjonelle grupper). Dereguleringen av disse biologiske funksjoner i ikke-kreftceller tyder på at tapet av ATM, med tilhørende endring i miRNA ekspresjonsnivåer, kan disponere eller drive de tidlige stadier av kreft formasjonen.
Diskusjoner
Gjennom genome-wide dypt sekvense vi har fått informasjon om i hovedsak alle de små RNA finnes i både villtype og ATM-mangel normale menneskelige mammary epitelceller, ikke bare de som er svært uttrykte. Vi identifiserte 259 robust uttrykt mirnas stede i både villtype og ATM-mangel normale menneskelige mammary epitelceller. Mens ATM har vært innblandet i den biogenese av mirnas etter DNA-skade [46], en fullstendig undersøkelse av effekten av ATM uttømming i HME-CCs viser at uttømming av ATM i seg selv har både den forventede nedregulering av mirnas samt en betydelig antall oppregulert miRNAs. Bare en tredjedel av de betydelig regulert mirnas har redusert uttrykk etter uttømming av ATM. Basert på tilstedeværelsen av oppregulert mirnas følgende ATM utarming, spekulerer vi at minibanker rolle i utføring miRNA uttrykket ikke er begrenset til miRNA biogenesis og ha oppstått via flere mekanismer. I tillegg er tap av ATM er blitt assosiert med et økt nivå av oksidativt stress [47], [48]. Vi spekulere høyere nivå av oksidativt stress utløst av den konstitutive tap av ATM kan ha en effekt på ekspresjonsnivåene til mange mirnas. Uttømming eller tap, ATM kan kjøre endringer i miRNA uttrykk gjennom økning i oksidativt stress. Flere mirnas sett å ha endret ekspresjon etter uttømming av ATM har også vist seg å være regulert ved forhøyet oksidativt stress, slik som HSA-MIR-200c [49]. Ytterligere studier er nødvendig for å fastslå om reaktive oksygenforbindelser åtseldyr kan redusere miRNA endringer eller fenotype endringer sett med uttømming eller tap av ATM.
Når vi sammenlignet miRNA uttrykket mellom villtype og ATM-mangel HME- CCs vi oppdaget at mirnas dis-regulert etter uttømming av ATM viser en uvanlig høy korrelasjon med mirnas involvert i kreft. Av de 81 betydelig regulert mirnas, uttømming av ATM kjørte undertrykkelsen av 4 kjente miRNA tumor dempere og over-uttrykk for 7 kjente oncomirs. Denne første observasjonen antyder et middel som tap av ATM kan disponere celler til kreft eller øke kreft mottakelighet.
For å undersøke hvilken rolle de miRNAs i ATM-manglende celler videre, kombinert vi betydelig regulert miRNA og genuttrykk data til å forutsi og evaluere mulige miRNA-mRNA-target kombinasjoner. Omtrent halvparten av de i betydelig grad regulert mirnas hadde spådd mål som ble også ulikt regulert, som sett i vår analyse av genuttrykk. Når vi videre undersøkt disse miRNA og mulige mål vi fremhevet ytterligere bevis for en kreft-mottakelighet profil i ATM-mangelfulle menneskelige mammary epitelceller. Dette inkluderer den økte regulering av onkogener MAF og CEPBA samt redusert regulering av tumor suppressor SOCS1.
Forstå genom miRNA profiler av normale og ATM-manglende ikke-kreft mammary epitelceller kan hjelpe oss få en bedre forståelse av rollene til ATM og mirnas i tumorigenesis av brystkreft og overgangen fra ikke-kreft til ondartet brystvev.
av spesiell interesse er det mulighet for å utnytte miRNA uttrykk nivåer å forutsi kreft mottakelighet eller formasjon før det kan bli detektert ved konvensjonelle diagnostiske fremgangsmåter. Cellene i vår studie er normale menneskelige mammary epitelceller som ikke er avledet fra kreftceller. Derfor er den økte ekspresjon av oncomirs og undertrykkelse av noen tumor suppressor mirnas i ATM-manglende celler tyder på at det kan være mulig å utvikle biomarkører for brystkreft predisposisjon. Utnytte miRNA biomarkør profiler konsistente med brystkreft predisposisjon ville tillate tidlig identifisering av pasienter som er i faresonen, og kanskje føre til tidligere overvåking, deteksjon og behandling.
Konklusjon
I konklusjonen, 81 mirnas med ATM-avhengig ekspresjon har blitt identifisert. Disse mirnas, sammen med deres antatte mRNA mål, foreslår de kan spille en rolle i den tidlige fasen av overgangen fra normal til kreft mammary epitelceller. Denne studien gir de foreløpige data som tyder på at å kombinere mikroRNA og mRNA uttrykk kan være av verdi for å utvikle en biomarkør for å forutsi predisposisjon for brystkreft. Ved å identifisere celler og pasienter med økt potensial for brystkreft formasjon, kan anbefalingene gjøres involverer overvåking og tidlig intervensjon.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Sequence teller for alle 939 kommenterte miRNAs. Tags per million (TPM) sekvens teller for alle 939 microRNAs kommenterte i hg19 WgRNA orden på UCSC Genome leseren
doi:. 10,1371 /journal.pone.0064779.s001 product: (PDF)
Tabell S2.
Sequence teller 259 nåværende miRNAs. Sekvens teller for 259 mirnas anses stede (over 10 TPM) i begge to ut av tre villtype replikerer eller 2 av 3 ATM-mangel gjentak
doi:. 10,1371 /journal.pone.0064779.s002 product: ( PDF)
tabell S3.
81 ATM-avhengige miRNAs. 81 microRNAs fast bestemt på å ha en betydelig endring i uttrykket i ATM-manglende celler sammenlignet med villtype kontroller. T-test
p
≤0.05; Brett Endre +/- 1,5 eller høyere
doi:. 10,1371 /journal.pone.0064779.s003 product: (PDF)
Tabell S4.
1086 ATM-avhengige mRNA. 1086 mRNA sonder fast bestemt på å ha betydelige uttrykk endringer i ATM-manglende celler sammenlignet med vill-type kontrollceller. T-test
p
≤0.05; Brett Endre +/- 1,5 eller høyere
doi:. 10,1371 /journal.pone.0064779.s004 product: (PDF)
Tabell S5.
40 miRNA og 202 mRNA mål. Liste over 40 betydelig regulert mirnas med negativt korrelert spådd mRNA mål og 202 mRNA spådd mål med vesentlige endringer i genuttrykk. Retning av endring (økning eller reduksjon) av ATM-manglende celler sammenlignet med WT celler er indisert for både mirnas (kolonne 2) og genet (mRNA) mål (kolonne 4)
doi:. 10,1371 /journal .pone.0064779.s005 product: (PDF)
Tabell S6.
potensielt mål transkripsjonsfaktorer. Transkripsjonsfaktorer identifisert som mulige mål for betydelig regulert mirnas bruker Molecular Signaturer Database of GSEA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0064779.s006 product: (PDF)
Tabell S7.
Representative gener i spesifikke funksjonelle kategorier. Eksempler på mål gener involvert i kreft, cellesyklusregulering og DNA replikasjon, rekombinasjon og reparasjon basert på oppfinnsomhet Pathway Analysis
doi:. 10,1371 /journal.pone.0064779.s007 product: (PDF)
Takk til
forfatterne ønsker å takke NIEHS Microarray Core og NIH utført Sekvensekjerne for sitt arbeid med dette manuskriptet. I tillegg vil forfatterne takke legene. Paul Wade og Douglas Bell for sine nyttige forslag og kritisk vurdering av manuskriptet.
