Abstract
Til- protein-2 (UCP2) er kjent for å undertrykke mitokondrielle reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon og er ansatt av multiresistent kreftceller til å redusere oksidativt stress. Ved hjelp av de legemiddelsensitive HL-60-celler og medikamentresistente MX2 sublinje som modellsystemer, viser vi at genipin, en UCP2 inhibitor, sensitizes legemiddelresistente celler til cytotoksiske midler. Økt MX2 celledød ble observert ved samtidig behandling med genipin og forskjellige doser av menadion, doksorubicin og epirubicin. DCFH-DA fluorimetri viste at økningen i MX2 celledød ble ledsaget av forbedrede cellulære ROS nivåer. Den legemiddelindusert økning i ROS var knyttet til genipin hemming av mitokondrie proton lekkasje. Tilstand 4 og hviler cellulære respiratoriske var høyere i de MX2 cellene i forhold til HL-60-celler, og den økte respirasjon lett ble undertrykt ved genipin i MX2 cellene. UCP2 utgjorde en bemerkelsesverdig 37% av den hvilende cellulær oksygenforbruk som indikerer at MX2 cellene er funksjonelt avhengig av dette proteinet. Høyere mengder UCP2 protein ble påvist i MX2
versus
de HL-60 mitokondriene. De observerte effekter av genipin var fraværende i det HL-60-celler som peker til selektiviteten av dette naturprodukt for medikamentresistente celler. Spesifisiteten til genipin for UCP2 ble bekreftet ved hjelp av CHO-celler som stabilt uttrykker UCP2 der genipin induserte en ~22% reduksjon i tilstand 4 åndedrett. Disse effektene var fraværende i tomt vektor CHO celler som uttrykker ingen UCP2. Dermed blir kjemisk hemming av UCP2 med genipin sensitizes multiresistente kreftceller til å cytostatika
Citation. Mailloux RJ, Adjeitey CN-K, Harper ME (2010) Genipin-indusert hemming av Utkoblings Protein-2 sensitizes resistent kreftceller til å cytostatika. PLoS ONE 5 (10): e13289. doi: 10,1371 /journal.pone.0013289
Redaktør: Maria Moran, Hospital 12 Octubre Madrid, Spania
mottatt: May 27, 2010; Godkjent: 14 september 2010; Publisert: 13 oktober 2010
Copyright: © 2010 Mailloux et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var gitt av den kanadiske Institutes of Health Research: Institute of Nutrition, Metabolism og Diabetes for Mary-Ellen Harper, og Dr. Ryan Mailloux er mottaker av et postdoktorstipend fra et hjerte og Stroke Foundation of Canada Program Grant, tildelt av Molecular Function og Imaging gruppe ved University of Ottawa Heart Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Intrinsic eller ervervet resistens mot kjemoterapeutiske midler representerer en stor hindring mot vellykket utrydding av kreft [1]. Evnen til kreftceller å unngå legemiddeltoksisitet skyldes induksjon av forseggjorte avgiftningsmekanismer. Faktisk kan den kronisk eksponering av kreftceller overfor kjemoterapeutiske midler utløse pro-overlevelse responser som er kjennetegnet ved forbedret evne til å gjengi kjemoterapeutika uskadelige [2], [3]. Selv om kreftceller påberope mange strategier for å oppheve giftstoffer, representerer stram kontroll over ROS-nivåer en stor adaptiv respons [4]. Å sikre at ROS nivået forblir i den ikke-toksisk nivå er en kontinuerlig utfordring for kreftceller Faktisk er kreftceller kontinuerlig utsatt for høye nivåer av ROS fremstilt ved nedsatt aerob metabolisme, kjemoterapeutika, næringsmangel, og vertsimmunresponser [5], [ ,,,0],6], [7]. Hvis venstre ukontrollert disse singlet elektron bærere kan skade viktige cellulære makromolekyler som fører til celledød [8], [9]. Derfor er en pakke med anti-oksidative forsvarsstrategier påberopes av kreftceller til å opprettholde ROS-nivåer innenfor akseptable grenser.
Induksjon av UCP2 representerer en av de mange adaptive mekanismer påberoper resistente celler for å opprettholde ROS homeostase [10], [11]. UCP2 tilhører den mitokondrielle anion bæreren superfamilie og har høy homologi med det opprinnelige mitokondrielle uncoupling protein som er sterkt selektivt uttrykt i brunt fett, UCP1 [12]. Forskjellige studier har vist at UCP2 kan forhindre oksidativt stress ved å øke strømmen av protoner inn i matriksen derved gjøre elektron strømme gjennom de respiratoriske komplekser mer effektive [13], [14], [15]. Denne funksjonen av UCP2 kan være spesielt viktig i kreftceller siden deres mitokondrier er metabolsk unormal [16].
ROS er en iboende biprodukt av aerob respirasjon siden mitokondrielle respiratoriske komplekser I og III kan delta i singelektron reduksjon av diatomisk oksygen [17]. Omtrent 0,2-2% av den O
2 metaboliseres i mitokondriene omdannes til ROS [18]. Imidlertid kan ROS generasjon bli betydelig forbedret ved forhold som overforsyning redusere ekvivalenter til åndedretts komplekser og dermed øke mitokondriemembranen potensial (
Δψ
m). Faktisk er det blitt rapportert i flere studier som ROS dannelsen av den respiratoriske kjeden er sterkt avhengig av
Δψ
m [19], [20]. Dermed kan det også liten depolarisering av
Δψ
m kan forbedre elektronstrømmen gjennom komplekser og minske mitokondrie ROS produksjon. UCP2 kan oppfylle dette frakopling rolle i kreftceller; andre rapporter beskriver uttrykket av andre uncoupling proteiner, inkludert UCP3 og UCP5 i adenokarsinom og tykktarm kreft celler [21], [22]. Faktisk, ulike
in vivo Hotell og
in vitro
studier har vist at UCP2 er en
bona fide
uncoupler av oksidativ fosforylering og begrenser oksidativ skade på vev mens tap av UCP2 funksjon øker mitokondrielle ROS produksjon [13], [23], [24], [25], [26]. Videre er frakopling aktiviteten av UCP2 antatt å tilveiebringe en negativ tilbakekoplingssløyfe for den akutte kontroll av ROS dannelse ved mitokondriene [27]. Dermed kan UCP2 spille en vesentlig rolle i den adaptive responsen av kreftceller til kjemoterapeutika.
Hemme legemiddelresistensmekanismer representerer en metode for sensibiliserende kreftceller til kjemoterapeutika [21], [22]. UCP2 overekspresjon er blitt beskrevet i forskjellige typer kreft, inkludert leukemi-celler, humane tarmkreftceller, skjoldbrusk svulster, og hepatomas [28], [29], [30], [31]. Ganske nylig, UCP2 knock-down har også vist seg å forbedre de toksiske effektene av det kjemoterapeutiske cisplatin [32]. Mer intriguingly har UCP2 overekspresjon blitt foreslått å være en del av den adaptive mekanisme som kreves for overlevelse av kreftceller i ugunstige omgivelser [11]. For eksempel er overekspresjon av UCP2 i HCT116 humane tarmkreftceller avtar de pro-apoptotiske virkninger av kjemoterapeutika, etoposid og doksorubicin [33]. Dette ble også observert med medikament-resistente L1210 /DDP leukemi-celler som bruker UCP2 å slukke kjemoterapi-indusert ROS gjennom et proton lekkasje mekanisme [10]. Dermed kan UCP2 representere et unikt mål for sensibilisering av resistente celler til kjemoterapeutika. Målet med denne studien var å teste hypotesen om at genipin, en ekstrakt fra
Ritz jasminoides
som har vist seg å hemme UCP2 og forbedre insulinsekresjon, kan hemme UCP2 de legemiddelresistente MX2 kreftcellene for å øke oksidativ stress og mottakelighet for cytostatika. Genipin har vist seg å være en meget selektiv inhibitor av UCP2. Faktisk har flere studier gitt bevis for at genipin spesifikt hemmer UCP2 mediert proton lekkasje i bukspyttkjertelen beta-celler, nyre mitokondrier, og i hjernevev [34], [35]. Av notatet er også det faktum at genipin er en tradisjonell kinesisk middel for behandling av type 2 diabetes mellitus [35].
Diskusjon
Genipin sensitizes resistente leukemiceller til ROS toksisitet
Resultater og
Fremveksten veksten~~POS=HEADCOMP av medikamentresistente kreft fenotyper er ledsaget av oppkjøpet av effektiv kontroll over ROS homeostase. UCP2 er en viktig modulator av ROS produksjon i medikamentresistente cancerceller [10], [11]. Denne mitokondrielle indre membranprotein blir uttrykt ved høye nivåer i medikamentresistente celler, og har vist seg å spille en nøkkelrolle i å begrense oksidativt stress [10], [36]. Derfor søkte vi å finne ut om kjemisk hemming av UCP2 kunne gjengi resistente cellene mer følsomme for cytostatika. De resistente MX2 celler vises økt motstand mot den superoksid-produserende menaquinone, menadione (figur 1A). Menadione produserer ROS ved raskt å sykle mellom kinon og semiquinone stat og brukes ofte for å etterligne oksidativt stress [37]. Faktisk, redusert HL-60 levedyktighet i hovedsaken etter behandling med 10 uM menadion. Videre eksponering av HL-60-celler til 100 uM menadion resulterte i en reduksjon i celleviabilitet 90%. Imidlertid MX2 cellene beholdt cellenes levedyktighet med konsentrasjoner av menadion opp til 100 pM (figur 1A). Immunoblot-analyser avslørte at den mitokondrier fra MX2 cellene inneholdt høyere mengder UCP2 protein (figur 1B). I motsetning til andre studier, fant vi at anti-N19 antistoff ga en veldig klar kjemiluminescerende signal [38]. Den elektromobilitet UCP2 ble bekreftet ved hjelp av milt lysat. Den anti-C20-antistoff har ikke tilveiebringe et signal til og med milten lysatet (data ikke vist). Immunoblot analyser viste kun små økninger i andre anti-oksidative forsvars enzymer i MX2 celler (Figur 1b). Derfor, selv om de legemiddelresistente celler MX2 øke flere anti-oksidative forsvars enzymer for å øke ROS håndtering, viser UCP2 den største økningen i ekspresjon sammenlignet med medikamentfølsomme HL-60 motstykke. Spesifisiteten til genipin for UCP2 ble bekreftet ved hjelp av CHO-celler stabilt transfektert med enten UCP2 eller tom vektor kontroll. Immunoblotting bekreftet at UCP2 uttrykkes bare i CHO-UCP2 celler (figur 1C). Den enkelt bånd i hver kolonne av immunoblot også justert ved ~32 KDa som indikerer spesifisiteten av antistoffet for UCP2 protein.
In situ
bioenergetisk bestemmelser om CHO-celler stabilt transfektert med UCP2 eller tom vektor ble brukt til å teste spesifisitet genipin. Måling av basal OCR før genipin behandling viste at CHO-UCP2 celler viste en signifikant høyere oksygenforbruk rate som var ~18% mer opphøyet enn CHO-EV celler (852,523 ± 45,838 OCR /mg protein CHO-UCP3 vs 721,352 ± 15,050 OCR /mg protein CHO-EV, s 0,05, n = 3). Imidlertid genipin behandling (20 og 50 uM) føre til at et 12 og 22% reduksjon i OCR av CHO-celler UCP2 i forhold til de CHO-EV-celler (figur 1C). Derfor er disse data illustrerer klart den spesifikke inhiberende virkning av genipin på UCP2. Det er verd å merke seg at genipin behandling ikke hadde noen effekt på den OCR av CHO-EV-celler som illustrerer spesifisiteten av genipin for UCP2.
A) Levedyktigheten av HL-60 (fylte ruter) og MX2 (fylte square) etter eksponering for menadione. Celler ble eksponert i 24 timer for forskjellige konsentrasjoner av menadion (0-100 umol /L) etterfulgt av vurdering av antall levende celler. Levedyktighet ble uttrykt som en prosent av kontrollverdien. Kruskall-Wallis med en post-hoc Mann-Whitney test, n = 3, p 0,05. * Angir statistisk signifikans for HL-60-celler sammenlignet med kontroll og # indikerer statistisk signifikans for MX2 sammenlignet med kontrollen. B) immunoblotanalyse av antioksidant forsvar enzymer og UCP2. Mitokondrier fra MX2 (M) og HL-60 (H) celler ble isolert og analysert for UCP2, MnSOD, og GPx4. Cytosol ble brukt for G6PDH bestemmelser. NADP-ICDH tjente som lasting kontroll for cytosol og mitokondrielle fraksjoner. Milt lysat (100 pg) ble anvendt som en kontroll UCP2 lasting. Molekylvekten av UCP2 ble bekreftet ved hjelp av molekylmassemarkører. C)
In situ
analyse av spesifisiteten av genipin for UCP2. Etter fastsettelse av basale oksygen forbruk priser, ble virkningen av genipin på OCR i CHO-UCP2 (hvite søyler) celler vurderes. Celler ble utsatt for (0-50 uM) genipin i 15 minutter og deretter OCR ble testet. Data ble uttrykt som en% av CHO-EV OCR.
INNFELT
: immunoblot analyse av UCP2 i CHO-UCP2 og CHO-EV celler. SDH tjente som lasting kontroll. Kruskall-Wallis med en post-hoc Mann-Whitney test, n = 3, p 0,05. * Angir statistisk signifikans sammenlignet med kontrollen. D) Vurdering av genipin toksisitet og responsen av legemiddelfølsomme HL-60 og resistent MX2 celler til samtidig behandling med menadione og genipin. Celler ble utsatt for genipin (0-500 umol /l) i nærvær eller fravær av 20 pM menadion i 24 timer. Etter eksponeringen ble cellelevedyktigheten bestemt. ♦ og ▪ representerer eksponering for enten genipin eller genipin + menadione. Levedyktighet ble uttrykt som en prosent av kontrollen. Kruskall-Wallis med en post-hoc Mann-Whitney test, n = 3, p 0,05. * Tilsvarer statistisk signifikans når cellene utsettes for både menadion og genipin ble sammenlignet med kontrollen. # Tilsvarer statistisk signifikans når genipin-eksponerte celler ble sammenlignet med kontrollceller. E) Behandling med genipin og menadione øker MX2 celledød. MX2 celler ble eksponert for 20 umol /L menadion og genipin (0-500 umol /l) i 24 timer. Mengden av celledød ble bestemt ved anvendelse av PI-analysen. En-veis ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, p 0,05. * Representerer betydning sammenlignet med 0 mikrometer.
Det er klart fra de ovennevnte data som MX2 celler uttrykker høye mengder UCP2 og genipin spesifikt hemmer UCP2. Neste vi vurdert om genipin kunne bevisstgjøre de MX2 cellene til menadione toksisitet. Så vel som dens anvendelse ved behandling av type 2-diabetes, har genipin blitt anvendt for å behandle gliom, hepatomer, og har anti-inflammatoriske egenskaper [35], [39], [40], [41]. Det finnes imidlertid en mangel på informasjon om genipin toksisitet. Våre resultater viser at genipin konsentrasjoner høyere enn 50 uM resulterte i tap av cellelevedyktighet i begge HL-60 og MX2 kulturer (figur 1D). Dette er mest sannsynlig på grunn av sin protein kryssbinding evner. Genipin tverrbindings resulterer i dannelse av et blått pigment. Men ingen blått pigment ble observert ved konsentrasjoner på genipin 100 uM (data ikke vist). Konsentrasjoner under 50 mikrometer hadde ingen signifikant effekt på levedyktigheten til enten MX2 eller HL-60-celler. Enda viktigere, eksponering av MX2 celler til en kombinasjon av 20 mikrometer menadione og genipin (konsentrasjon så lav som 10 mm) resulterte i en kraftig nedgang i celle levedyktighet (figur 1D). Det var en økning i MX2 levedyktighet ved eksponering til 100 uM genipin i kombinasjon med menadion men det var fremdeles en betydelig reduksjon i levedyktighet når sammenlignet med kontrollen. Den sensibiliserende virkning av genipin å menadione ble bekreftet ved hjelp av PI analysen. Eksponering av MX2-celler i 24 timer til 20 uM menadion i nærvær av 10 eller 20 uM genipin resulterte i en to-gangers og 8-gangers økning i celle-død, respektivt (figur 1E). I motsetning til dette, ble konsentrasjonene av menadion ≥50 uM nødvendig for å indusere død MX2 når genipin var fraværende (figur S1). I tillegg til økningen i celledøden var flere ganger høyere når genipin ble inkludert. Propidiumjodid opptak kan oppstå i både nekrotiske og apoptotiske celler. Dermed har vi målt flere apoptose markører. Ingen aktiv caspase-3 ble funnet og cytokrom C var fraværende fra cytosol i samsvar med induksjon av nekrose (data ikke vist). Selv om disse to apoptose biomarkører ikke ble oppdaget, er nødvendig for en mer dyptgående analyse av mekanismen av celledød. Vi har også vurdert konsekvensene av ulike mengder av genipin på ikke-kreft C2C12 myoblast cellelinje. C2C12 myoblasts vises en økning i celledød ved behandling med ≥50 mikrometer genipin (figur S1). Disse observasjonene indikerer at genipin ikke induserer et betydelig tap i celle levedyktighet ved konsentrasjoner under 50 mikrometer og effektene av genipin på MX2 cellene er på grunn av sin interaksjon med UCP2. Til tross for disse observasjonene, mer
in vivo
analyser på giftigheten av genipin og dens anvendelse til behandling av kreft i et klinisk miljø er nødvendig. Dermed sensitizes genipin legemiddelresistente celler som uttrykker UCP2 til ROS-produserende agenter.
Genipin sensitizes MX2 celler til anthracyclin toksisitet
menadione har vist seg å ha en anti-kreft effekt og har vært ansatt med mitomycin C i fase II-studier for å behandle avansert lungekreft [42]. Imidlertid er menadione ikke for tiden ansatt som en kreft kjemoterapeutisk. Dermed fant vi ut hvis genipin kunne bevisst MX2 cellene brukte kjemoterapeutika, spesielt kinon-baserte anthracyclins, doksorubicin og epirubicin. MX2 celler er vel kjent for å være resistente mot denne klassen av kjemoterapeutiske [43]. Som vist i figur 2A, MX2 cellene var mer resistente overfor økte epirubicin konsentrasjoner (0,5 uM) i motsetning til deres medikament-sensitive motstykke. Imidlertid var skarpe økninger i celledød observert i genipin-behandlede MX2 celler eksponert for økende mengder av epirubicin (figur 2A). Merkelig, genipin og epirubicin (0,05-0,1 mm) co-behandling økt celledød i HL-60 celler, men dette svaret ble opphevet ved høyere doser epirubicin (0,5 mikrometer, MX2 celler vises en 4-dobling mens HL-60-celler vises en to-fold økning). MX2-celler ble også resistent mot doksorubicin behandling (figur 2B). Forbløffende nok de HL-60-celler vises bare en trend mot økt celledød, men statistisk signifikans ble ikke nådd (0,05-0,5 mikrometer doxorubicin, bare en 20-40% økning; p 0,05). Den store observasjon i figur 2B er den betydelige økningen i MX2 celledød ved behandling med genipin og doxorubicin (0,05-0,5 mikrometer, ~50-110%, p 0,05). Den sensibiliserende virkning av genipin ble ikke observert i HL-60-celler som ble behandlet med doxorubicin som er konsistent med den inhiberende virkning av genipin på UCP2. Bruk av epirubicin og doksorubicin konsentrasjoner over 1 uM i kombinasjon med genipin resultert i drastiske økninger i celledød av HL-60 og MX2-celler (data ikke vist). Derfor frakobler genipin kjemoterapeutisk resistens i medikamentresistente celler som overuttrykker UCP2.
HL-60 og MX2-celler ble dyrket til 70% konfluens og deretter utsettes for enten epirubicin (0-0,5 mm) eller doksorubicin (0-0,5 uM) i fravær eller nærvær av 20 pM genipin. Mengden av celledød ble bestemt ved PI assay. Resultatene ble uttrykt som en prosent av kontrollen. A) ♦ epirubicin bare, ▪ epirubicin + genipin. En-veis ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, * p 0,05. * Tilsvarer statistisk signifikans når epirubicin og genipin behandlede celler ble sammenlignet med kontrollen. # Tilsvarer statistisk signifikans når epirubicin-behandlede celler ble sammenlignet med kontrollceller. B) ♦ doxorubicin bare, ▪ doxorubicin + genipin. En-veis ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, p 0,05. * Tilsvarer statistisk signifikans når epirubicin og genipin behandlede celler ble sammenlignet med kontrollceller.
Genipin behandling perturbs aerob respirasjon i narkotika-resistente celler
Til tross for glycolytic fenotype av kreftceller, den enzymatiske maskiner som kreves for aerob respirasjon forblir ofte intakt [44]. Vedlikehold av funksjonell mitokondrier er avgjørende for kreftcelle,
f.eks.
, Krebs syklus enzymer gi anabole forløpere for raskt dele celler [6]. Vår gruppe har vist tidligere at mitokondriene i narkotika-resistente leukemiceller er frakoblet og at dette er assosiert med redusert cellulære ROS-nivåer [10]. Dermed har vi en hypotese om at sensibiliserende virkning av genipin var på grunn av sin evne til å forhindre UCP2-mediert frakopling av
Δψ
m. Som vist i figur 3A, er basal av oksygenforbruk var høyere i MX2 i forhold til HL-60-celler (~54% større, p 0,05). Dette indikerer at mitokondriene i MX2 cellene er mer metabolsk aktiv enn HL-60-mitochondria. Behandling av HL-60 og MX2 celler med oligomycin redusert respirasjon med henholdsvis -60% og ~38% (figur 3A). Dette indikerer at ~62% av hvilemobil O
2 forbruket i MX2 cellene skyldes frikoblet respirasjon (
f.eks.
Ikke-ATP produserende aktiviteter). Skarpe avvik i mitokondrienes stoffskifte ofte følger oppkjøpet av aggressive kreft fenotyper [6]. Faktisk har målrettet avbrytelse av mitokondriell metabolisme blitt beskrevet som en potensiell kreftbehandling [2]. Forbehandling med genipin betydelig redusert basal respirasjon i MX2-celler (figur 3A). Disse effektene ble ikke sett i HL-60-celler. Genipin induserte en ~37% reduksjon i lufthastighet avslørende at UCP2 er kvantitativt viktig å opprettholde en frikoblet mitokondrie fenotype selv under standard inkubasjonsforhold. Til sammenligning CHO-UCP2 celler opplevd en ~22% nedgang i OCR etter behandling med 50 mikrometer genipin (figur 1C). Avviket mellom CHO og MX2-celler er mest sannsynlig på grunn av forskjeller i dosering og eksponeringstiden mellom de to separate cellelinjer. Denne observasjonen viser samlet at UCP2 er en stor bidragsyter til MX2 cellulære bioenergi. Dessuten, etter tilsetning av genipin til oligomycin-behandlede celler MX2, respirasjon var identisk med den i det HL-60-celler (figur 3A). Dette indikerer at UCP2 var fullt ut ansvarlig for økt respirasjon av MX2 celler. Flere studier har vist at genipin spesifikt hemmer UCP2-mediert frakopling [34], [45]. For eksempel, Zhang
et al
illustrert som proton lekkasjen ikke er berørt av genipin i UCP2
– /- celler og i vev som ikke uttrykker UCP2 [35]. Vi observerte lignende trender i CHO celler eksponert for genipin (figur 1C). Derfor genipin fullstendig inhiberer den økte cellulær respirasjon i cellene MX2, mens det har ingen effekt på HL-60-foreldrecellene.
A) oksygenforbruk målinger i celler eksponert for 20 uM genipin 24 timers eksponering. Oksygenforbruk målinger ble utført ved å følge en 30 minutters inkubasjon i reaksjonsmediet i fravær (hvite stolper) eller nærvær (grå søyler) av oligomycin. En-veis ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 6, ** p 0,01. Behandlet MX2 eller HL-60-celler ble bare sammenlignet med deres tilsvarende kontroll middelverdier. B) oksygenforbruk målinger i celler eksponert for genipin (20 uM) og /eller menadion (20 uM) i 24 timer. En-veis ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 4, * p 0,05; Eksporter
UCP2 er kjent for å være en negativ regulator av mitokondrie ROS produksjon, en eiendom tilskrives sitt milde frakopling aktivitet. I to elegante studier, Echtay
et al
gitt overbevisende bevis for at UCP2-mediert protonledningsevnen er maksimalt aktivert av oksidativt stress i mitokondriene [27], [46]. Denne type «induserbar» proton lekkasjen har blitt beskrevet som en viktig sikkerhetsforanstaltning for å hindre økning av mitokondrienes ROS utslipp. Derfor testet vi om ROS behandling kan øke proton lekkasje i MX2 celler. Menadione behandling endret ikke oksygenforbruk i MX2 celler (Figur 3B). Disse data indikerer at ROS ikke føre til ytterligere økninger i proton lekkasje avhengig åndedrett. Men i HL-60-celler, menadion behandling signifikant redusert oksygenforbruk, kanskje på grunn av den reduserte evnen som disse cellene til å kontrollere cellulære ROS-nivåer (figur 3B). Mitokondrie metabolisme (
f.eks.
, Sitronsyresyklusen enzymer og elektrontransportkjeden proteiner) er et viktig mål for ROS toksisitet. Således er reduksjonen i oksygenforbruk observert i HL-60-celler eksponert for menadion viser at disse cellene har en lavere kapasitet for å opprettholde akseptable nivåer av celle ROS i nærvær av cytotoksiske midler. De ovennevnte data fastslå at UCP2 hindrer ROS-indusert svekkelser i mitokondrie metabolisme. Med andre ord, kan den lave overflod av UCP2 i HL-60-celler bety at de er ute av stand til å avgifte ROS. I MX2 cellene våre resultater støtter konklusjonen om at UCP2 allerede maksimalt aktivert. Faktisk, i to separate forsøk (figur 3A og 3B) genipin redusert oksygenforbruk ~37% i celler under standard inkuberingsbetingelser. Videre utgjorde nonphosphorylating åndedrett for ~62% i O
2 forbruk i MX2-celler og inhiberte genipin over halvparten av denne respirasjon, noe som resulterer i normalisering av ikke-fosforylering respirasjon (
ie
, til HL -60 verdier). Derfor UCP2 står for en stor del av nonphosphorylating åndedrett i MX2 celler. Dermed ser det unike metabolske profil av resistente kreftceller til å omfatte økt UCP2-mediert mitokondrie frakopling å unngå cytotoksiske effektene av narkotika og mitokondrie-borne ROS.
Behandling med genipin forbedrer legemiddelindusert ROS produksjons
de ovenfor angitte data indikerer at inhibering av UCP2 ved genipin resulterer i induksjon av medikament-indusert celledød i multilegemiddelresistente MX2 celler. Siden UCP2 hemming sensitizes celler til ROS-produserende agenter, vi så testet hvis genipin behandling forbedret legemiddelindusert ROS formasjon. HL-60-celler som ble behandlet med menadion alene produserte mye mer ROS enn deres resistent motstykke (figur 4A). Denne observasjonen er i overensstemmelse med den forbedrede ROS håndteringskapasitet av legemiddelresistente celler. Men samtidig behandling av MX2 celler med genipin og menadione økt ROS nivåer. Faktisk eksponering av genipin behandlet MX2 celler til ulike mengder menadione gitt økte ROS nivåer (Figur 4B). Ved 50 mikrometer menadione, var det en sterk økning i ROS-nivåer i genipin utsatte MX2 celler. Kun moderate økninger i ROS-produksjonen ble observert i det HL-60-celler som ble behandlet med menadion og genipin (figur 4B). Behandling med genipin alene MX2-celler økte ikke ROS-nivåer (figur 4B). Dermed gjør genipin MX2 cellene mer følsomme for behandling med ROS produsere midler ved å forstyrre proton lekkasje.
ROS-nivåer ble vurdert i intakte HL-60 og MX2 celler ved hjelp DCFH-DA. A) ROS-nivåer i celler eksponert for utelukkende menadion (0-50 uM) i 24 timer. En-veis ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, * p 0,05. B) ROS-nivåer i celler eksponert for 0 eller 20 uM genipin og menadion (0-50 uM) i 24 timer. En-veis ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, * p 0,05, ** p. 0,01
Lignende observasjoner ble gjort med doxorubicin. Doxorubicin er klassisk referert til som en topoisomerase II-inhibitor [47]. Imidlertid kan andre mekanismer for toksisitet, for eksempel ROS-produksjon, har blitt foreslått [48]. Behandling med doxorubicin alene resulterte i en doseavhengig økning i ROS-nivåer i HL-60-celler (figur 5A). I motsetning til dette ble ingen økning i ROS observert i MX2 cellene til og med 1 uM. Men når genipin fulgte med doxorubicin, økning i ROS-nivåer ble observert i MX2 celler (figur 5B). Faktisk eksponering av genipin belastede celler til konsentrasjoner av doxorubicin så lavt som 0,1 mikrometer resulterte i en kraftig økning i ROS nivåer. Selv doxorubicin er mye brukt som en anticancer agent, er virkningsmekanismen ikke fullt ut forstått. I denne studien, viser vi at doxorubicin kan øke ROS-nivåer i MX2 cellene ved samtidig behandling med genipin. Det er fullt mulig at doxorubicin toksisitet rettet mitokondriene. De anthracyclins er kinon molekyler, som menadion, som er i stand til å katalysere singelektron reduksjon av diatomisk oksygen til peroksyd. Superoksid, ved høye nok konsentrasjoner, forstyrrer riktig funksjon av mitokondriene. Men i denne studien produksjonen av ROS av doxorubicin og menadione i MX2 celler kreves genipin behandling. Det er fullt mulig at de medikamentresistente celler takle de inhiberende virkningene av doxorubicin og kinoner ved å opprettholde mitokondrier i en ukoplet tilstand begrensende ROS formasjon.
ROS-nivåer ble vurdert i intakte HL-60-celler ved hjelp av og MX2 DCFH -DA. A) ROS-nivåer i HL-60-celler og MX2 celler eksponert for doksorubicin (0-1 uM) i 24 timer. En-veis ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, * p 0,05, ** p 0,01. B) ROS-nivåer i HL-60-celler og MX2-celler eksponert for 20 uM genipin og doksorubicin (0-1 uM) i 24 timer. En-veis ANOVA med en post-hoc Tukey test, n = 5, * p 0,05, ** p. 0,01
Våre funn tyder på at naturlig produkt genipin kan gjengi resistent cancer cellene mer følsomme for ROS-produserende midler. Den kliniske anvendelsen av genipin som en potensiell narkotika-allergifremkallende middel krever videre undersøkelser. Faktisk ble de legemiddel sensibiliserende effekter av genipin undersøkt her med vanlig studert linjer av kreftceller. Derfor, for å gi mer klarhet om potensielle rolle genipin i kreftbehandling, omfattende
in vivo
analyser er nå pålagt (
f.eks.
, Dyrestudier). Men denne studien gir noen viktige foreløpige innsikt i den potensielle bruken av genipin i kreftbehandling. I denne studien ble det sensibiliserende virkning av genipin tilskrives dets interaksjon med UCP2, et protein rikelig uttrykt i MX2 celle mitokondriene. Spesifisiteten til genipin for UCP2 ble bekreftet med CHO-celler som stabilt uttrykker UCP2. HL-60-celler var ikke svarer til genipin behandling som er mest sannsynlig tilskrives den lave mengder av UCP2 uttrykt i disse cellene. Den spesifikke hemmende virkning av genipin ble bekreftet ved hjelp av CHO-celler enten uttrykker eller ikke uttrykke UCP2. Dermed våre funn er i samsvar med en spesifikk effekt av genipin på UCP2. UCP2 er uttrykt i et antall normale somatiske celler (splenocytter, pankreatiske p-celler, thymusceller, og diverse andre immun-type celler) [26]. Beløpet uttrykt i resistente kreftceller i stor grad overgår protein nivåer i ikke-kreftceller og narkotika-sensitive kreftceller. Lav UCP2 protein nivåer blir vedlikeholdt av stram translasjonsforskning kontroll og rask nedbrytning [49]. Merkelig nok, glutamin har vært implisert i induksjon av mRNA UCP2 oversettelse [50] og medikamentresistente kreftceller har forbedret glutamin opptak og metabolisme, en prosess mediert av Myc [51]. Dermed er det mulig at glutamin avhengighet spiller en rolle i å forbedre UCP2 protein uttrykk i narkotika-resistente celler. Det ville være interessant å finne ut om UCP2 kan være forårsaket av Myc. I denne studien mekanismen for den UCP2-formidlet reduksjon i ROS stammer fra sin frakopling aktivitet.
