Abstract
Tilberedning av tumorutvikling i immunodeficient mus fra disaggregert primære humane tumor celler er alltid utfordrende. Hovedmålet med denne studien er å etablere en pålitelig analyse system som ville tillate oss å reproduserbart rekonstituere menneskelige prostata svulst regenerering hos mus ved hjelp av pasient tumor-avledet enkeltceller. Ved hjelp av mange av de 114 ubehandlet primære humane prostatakreft (HPCA) prøvene vi har jobbet med, her viser vi at: 1) subcutaneum representerer den mest følsomme område som tillater poding av de implanterte HPCA brikker; 2) primære HPCA celler i seg selv ikke klarer å regenerere svulster i immunsvikt verter; 3) når coinjected i Matrigel med rUGM (rotte urogenitale sinus mesenchyme), CAF (carcinoma-assosiert fibroblaster), eller HS5 (udødeliggjort benmarg avledet stromal) celler, primære HPCA cellene ikke klarer å starte serietrans svulster i NOD /SCID-mus; og 4) men HPCA celler coinjected med HS5 cellene inn mer immunodeficient NOD /SCID-IL2Rγ
– /- (NSG) mus lett regenerere serielt trans svulster. Den HPCA /HS5 rekonstituert «prostata» svulster presentere en samlet epitelial morfologi, er av human opprinnelse, og inneholder celler positive for AR, CK8, og racemase. Cytogenetisk analyse gir ytterligere bevis for tilstedeværelse av karyotypically unormale HPCA celler i HPCA /HS5 svulster. Av betydning, HPCA /HS5 xenografttumorer inneholde EpCAM
+ celler som er både klonogene og tumorigen. Overraskende, alle HPCA /HS5 utblandede svulster er udifferensiert, selv for HPCA celler avledet fra Gleason 7 svulster. Våre resultater indikerer at primær HPCA celler coinjected med udødeliggjort HS5 stromale celler generere udifferensierte svulster i NSG mus og vi gir bevis for at udifferensiert HPCA celler kan være
de
celler som besatt karsinogent potensial og regenererte HPCA /HS5 xenografttumorer.
Citation: Chen X, Liu B, Li Q, Honorio S, Liu X, Liu C, et al. (2013) Spaltet Primær menneskelige prostata kreft celler Coinjected med udødelig HS5 stromale benmargsceller generere Undifferentiated Svulster i NOD /SCID-γ Mus. PLoS ONE 8 (2): e56903. doi: 10,1371 /journal.pone.0056903
Redaktør: Amit Singh, University of Dayton, USA
mottatt: Oktober 30, 2012; Godkjent: 15 januar 2013; Publisert: 22 februar 2013
Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra NIH (R01-CA155693-01A), Department of Defense (W81XWH-11-1-0331), CPRIT finansiering (RP120380), og MD Anderson Cancer Center Center for Cancer epigenetikk og Laura og John Arnold Foundation RNA Senter pilot stipend (til DGT) og av to senter Grants (CCSG-fem P30 CA016672-34 og ES007784). XC ble støttet av Cockrell fellesskap fra Institutt for molekylær Karsinogenese, M.D. Anderson Cancer Center. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Tilsvarende forfatter, Dr. Dean Tang, er i dag en akademisk redaktør for PLoS ONE og at medforfatter Dr. Dean Tang er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den ledende malignitet med estimerte ~241,740 nye tilfeller og ~ 28,170 dødsfall i USA i 2012 [1]. Årsaken til PCa forblir gåtefull og cellene-of-opprinnelse for kastrering-resistente PCa (dvs. CRPC), den dødelige sykdommen som dreper de fleste pasienter forblir dårlig definert. Kreft hos mennesker havn en befolkning på stilk-lignende kreftceller operasjonelt betegnes kreft stamceller (cscs), som antas å være ansvarlig for startfasen, forfremmelse, progresjon, metastaser, og behandlingsresistens [2]. Arbeid fra vår lab og mange andres tyder på at menneskelig PCa inneholder også stilk-lignende kreftceller [3] – [32]. Som cscs i andre svulster [33], prostata cscs er heterogen som inneholder mange undergrupper med distinkt tumor-regenererende kapasitet. Av notatet, prostata cscs rapportert av flere grupper er mindre differensiert uttrykker lite /ingen AR (androgen reseptor) og PSA (prostataspesifikt antigen). Nylig, ved hjelp av en PSA promoter-drevet GFP lentiviral reporter, har vi renset ut differensiert (PSA
+) og udifferensierte (PSA
– /lo) PCA celler for genuttrykk profilering og funksjonelle studier og fant at PSA
– /lo cellepopulasjonen havner langsiktig kreftfremmende celler som motstår til kastrering [25]. Vår studie tyder på at den udifferensierte PSA
– /lo PCa cellepopulasjon sannsynlig representerer en pre-eksisterende celle-of-utstedt CRPC [25]
En KEY ubesvart spørsmål er om lignende stilk-lignende PCa. celler med forbedrede kreftfremmende egenskaper finnes også i primære humane PCa (HPCA) prøver. Grunnen til at dette viktige spørsmålet har slapp unna et endelig svar ligger i det faktum at vi har ennå til å etablere en pålitelig analysesystem som kan reproduserbart og trofast rekonstituere svulst regenerering fra dissosierte HPCA enkeltceller [14]. De fleste som i dag brukes PCA modeller er avledet fra enten genmodifiserte mus der bestemte gener blir overuttrykt eller slått ut eller fra transplantater ved hjelp av humane kreftcellelinjer eller svulst stykker inokulert orthotopically eller ectopically inn i immunsvikt mus [34]. Av mange grunner, musemodeller av PCa besitter histopatologiske egenskaper som ikke er helt representativ for human PCa, som kjennetegnes ofte av flere genetiske endringer som er utenfor evnen til enhver genetisk konstruerte modeller kan rekapitulere. Videre kan en spesifikk genetisk mutasjon resulterer i forskjellige biologiske og histologiske fenotyper hos dyr versus i human [35]. I kontrast er xenograft-modeller mye studert for lettere bruk. De er av menneskets opprinnelse og derfor antas å bedre rekapitulere humane svulster i form av histopatologiske og molekylære egenskaper [34]
Flere mye brukt PCA xenografter, som LAPC og LuCaP serie [36] -. [ ,,,0],38], er blitt etablert ved å implantere humane prostata tumorstykker i mus. PCA xenografter kan også opprettes ved å injisere etablerte PCA cellelinjer som PC3, Du145, og LNCaP [39]. På grunn av det velkjente faktum at lokaliserte PCA eller PCA-celler sjelden danne tumorer i immunodefekte mus [39], de ovennevnte eksempler på transplantater eller cellelinjer ble alle etablert fra metastaser, og at de bare utgjør en mindre del av kirurgisk fjernet human PCa og ikke fullstendig reflekterer heterogeniteten av sykdommen [40]. Nylig innsats har blitt gjort for å generere PCA xenografter ved poding lokaliserte PCA stykker [41], [42] eller primære PCA celler rekombinert med neonatal mus mesenchyme [43] i nyrekapselen. Den regenererte xenografter ser ut til å ligne, histopathologically, donor pasientsvulster, men om de kan serielt passeres er ukjent.
Hovedmålet med vår nåværende prosjektet er å etablere en pålitelig analyse system som ville tillate oss å reproduserbart og trofast rekonstituere menneskelige prostata svulst regenerering hos mus ved hjelp av pasient tumor-avledet HPCA enkeltceller. Vi har tidligere gjort noen innsats mot dette målet, men de fleste av våre omdannings protokoller helt klarte å regenerere svulster [14]. Her har vi benyttet mange av de 114 ubehandlede prostatektomi prøver, som strekker seg fra Gleason score (GS) 6 til 10, for å fremstille enkelt epiteliale kreftceller, som deretter ble rekombinert med forskjellige stromale celler, inkludert rUGM, karsinom-assosiert fibroblaster (kafeer), eller foreviget benmarg-deriverte stromale celler (HS5) og implantert på ulike anatomiske områder i enten NOD /SCID eller NOD /SCID-IL2Rγ
– /- (NSG) mus. Nedenfor presenterer vi resultatene av våre omfattende studier.
Materialer og metoder
Alle dyrerelaterte studier på dette prosjektet har blitt godkjent av MD Anderson Cancer Center IACUC (Institutional Animal Care og bruk komité ; ACUF # 08-05-08132). Den nåværende forskning innebærer ikke mennesker (dvs. levende individer eller identifiserbare privat informasjon) selv om det innebærer primær HPCA eksempler hentet fra våre samarbeidende leger under dekningen av IRB (Institutional Review Board) Protokoll nummer LAB04-0498. Alle andre studier presentert her var de etterforsker initierte og ikke krever godkjenning fra andre kontrollorganer.
Cells, reagenser og dyr
PC3, DU145, LNCaP og Swiss 3T3 celler ble oppnådd fra ATCC. Den HS5 cellelinje, som ble generert fra menneskelig benmarg og udødeliggjort av transduksjon med humant papilloma virus E6 /7 gener [44], ble velvillig gitt av Dr. M. Andreeff (M.D Anderson Cancer Center). Karsinom assosiert fibroblaster (kafeer) ble fremstilt som tidligere rapportert [45]. Alle celler ble dyrket i anbefales medium inneholdende 7% varme-inaktivert FBS, 100 ug /ml streptomycin, og 200 U /ml penicillin (Gibco). Testosteron ble kjøpt fra Sigma. Den TRPC xenograft linjen ble gitt av Dr. Palapattu [46]. Immunsvikt mus (NOD /SCID, NSG, Rag2, jf. Ref 14 om egenskapene til disse dyrestammer) ble opprinnelig kjøpt fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) og hekkekoloniene ble etablert i vår dyre anlegget og vedlikeholdt i standard vilkår i henhold til institusjonelle retningslinjer. Antistoffer anvendt i denne studien er presentert i tabell S1.
Histologisk og Immunhistokjemisk (IHC) Analyser
tumorvev høstet fra pasientens tumor og rekonstituerte xenografter ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin i 24 timer etterfulgt av 70% etanol og innstøping i parafin. Seksjoner (4 mm) ble kuttet og farget med hematoxylin og eosin (HE). For IHC ble snittene deparaffinized og hydrert og endogen peroksidase-aktivitet ble blokkert med 3% H
2o
2 i vann i 10 min. Antigen gjenfinning ble utført med 10 mM citratbuffer (pH 6,0) i 10 minutter i en mikrobølgeovn, etterfulgt av en 20-min avkjøles og grundig vask. Glassene ble inkubert med Biocare Blokkering Reagens (# BS966M med kasein i buffer) i 10 min for å blokkere ikke-spesifikk binding. Glassene ble inkubert med forskjellige primære antistoffer i 30 minutter ved romtemperatur, og vasket i fosfatbuffer to ganger og deretter inkubert i biotinylert geite-anti-kanin eller mus IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ved en 1:500 fortynning i 30 min ved romtemperatur. Etter grundig vasking ble de inkubert med SA-HRP (BioGenex, San Ramon, CA) i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av vasking. Til slutt ble disse lysbildene inkubert med BioGenex DAB substrat (fargeutvikling overvåkes nøye under et mikroskop) og lett kontra med hematoksylin. Bilder ble tatt med en MagnaFire kamera, og hele montere lysbildene ble skannet med en Aperio ImageScope system.
Aperio-assistert Morfometrisk Analyse
HE eller IHC farget glassplater som inneholder pasient eller xenografttumorer var skannet ved hjelp av Aperio ScanScope bildeplattform (Aperios Technologies, Vista, CA, USA) med en 20 × objektiv på et romlig sampling periode på 0,47
μ
m per piksel. Hele lysbilder bilder ble sett og analysert ved hjelp av stasjonære personlige datamaskiner som er utstyrt med gratis ScanScope programvare.
Rensing av tumorceller fra primærpasientprøver og xenografttumorer
Grunnleggende prosedyrer har nylig blitt beskrevet [14 ]. Primære PCA prøver ble oppnådd ved radikal prostatektomi med pasientenes samtykke i henhold til de MDACC Institutional Review Board retningslinjer (IRB LAB04-0498). Ingen av pasientene fikk noen behandling før operasjonen.
For pasientprøver
, tumorvev ferskt oppnådd fra prostatektomi ble hakket til ~ 1 mm
3 deler og vev er utsatt for enzymatisk nedbrytning (type I-kollagenase pluss DNase ved 50 U /ml) i 8-10 h ved 37 ° C. Ved fordøyelse, blir epiteliale organoids anrikes ved en kort sentrifugering, fulgt av trypsin fordøyelse (0,05%, Gibco) på en vippe ved 37 ° C i 15-30 min for å frigjøre epitelceller.
For xenotransplantater
, ble tumorvev inkubert med 1 x Accumax (1200-2000 U /ml proteolytisk aktivitet som inneholder kollagenase og DNase; Innovative Cell Technologies, Inc.) ved 10 ml pr gram vev i 30 minutter ved romtemperatur under roterende forhold. Enkeltcellesuspensjon ble oppnådd ved filtrering av supernatanten gjennom en pre-fuktet 40-mikrometer celle sil og cellesuspensjonen ble deretter forsiktig applisert på et lag av Histopaque-1077 (Sigma) gradient rensetrinn for å fjerne mesteparten av røde blodceller, død celler og rusk. Til slutt ble den resulterende celleblandingen underkastet en MACS avstamning celleutarming kit (Miltenyi Biotec) og cocktail (anti-CD3, 14, 16, 19, 20, 45, 56, og 140b for pasientens tumor; H2K
d for xenografter) for å fjerne Lin
+ celler inkludert blodkreft, endotelceller, og andre stromale celler (glatt muskulatur, korg, fibroblast, etc) for pasientprøver, eller mus stromale celler for xenografttumorer hhv.
Tumor Transplantasjon Eksperimenter
Renset PCA celler (over), enten alene eller i kombinasjon med hjelpeceller inkludert rUGM, kafeer, eller HS5 celler, blir implantert enten subkutant (sc) eller under nyrekapslen (KC) av immuno-manglende mus. Alternativt, ble stykker eller fragmenter av HPCA podet subkutant, under KC, eller i mus fremre prostata (AP). Grunnleggende prosedyrer for disse transplantasjoner har tidligere blitt beskrevet [14]. Kort,
for s.c implantasjoner
, tumorceller ble injisert i 40 ul medium som inneholder 50% Matrigel, subkutant i 6-8 uker gamle hannmus supplert med eksogene testosteron.
For KC transplantasjoner
ble PCA celler blandet med 250.000 rUGM celler og vev rekombinanter ble gjort i rotte-hale kollagen og inkubert over natten. Vevet rekombinanter ble transplantert neste morgen under nyrekapselen på mottaker hannmus supplert med testosteron pellets.
For AP pode
, små biter av HPCA vev ble direkte implantert. I noen tilfeller ble HPCA celler ved forskjellige tall først blandet med rotte kollagen og inkubert i en vevskultur-plate ved 37 ° C i 10-15 min. Da størknede cellepelletene ble forsiktig dekket i medium og dyrket i 4 timer til natten over før implantering. En tverrgående snitt ble gjort i nedre del av magen for å eksponere AP ved delvis å trekke i blæren, sædblærene og prostata ut av bukhulen. En 2-3 mm snitt ble gjort i AP gjennom tubule mellom de to hovedkanalene ved hjelp av en 22-gauge nål. Ved hjelp av en brann avrundet glass pipette, ble kollagen prikkene satt inn i en lomme dannes under prostata tubuli. Da organene ble byttet ut og kroppsveggen og huden lukket.
I alle forsøkene ovenfor, tumorutvikling ble overvåket med start fra den andre uken. Tumorgenisitet ble målt hovedsakelig av tumor insidens (dvs. antall tumorer /antall injeksjoner), latens (dvs. tiden fra injeksjon til deteksjon av palpable tumorer), tumorvolum, og endepunkt tumorvekt.
Western blotting
hele cellelysatene ble fremstilt i fullstendig RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,5% Triton X-100, 10 mM EDTA) som inneholder proteasehemmer blanding. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved MicroBCA kit (Pierce). Forskjellige mengder av proteiner ble applisert på en 15% SDS-PAGE. Western blotting ble utført som standard med ECL Plus (PerkinElmer).
Reverse Transcription (RT) -PCR Analyse
Total RNA ble ekstrahert fra tumor stykker eller kulturperler kreftceller ved hjelp Trizol (Invitrogen), og anvendt i RT-PCR-analyse. PCR-primere er inkludert humant AR (sense: 5′-GCTAAAGACTCGGAGGAAGCAAG-3 «, antisense: 5′-TGGGGGAAAACAGAGGGTTC-3′); PSA (sense: 5»-TGGGAGTGCGAGAAGCATTC-3 «, antisense: 5′-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3′); β-aktin (fornuft: 5»-CTGGCACCACACCTTCTACAATG-3 «; anti: 5’AATGTCACGCACGATTTCCCGC-3»)
karyotypering og Genomisk ustabilitet
Celler ble utsatt for Colcemid (0,04
μ
g /ml) i 25 minutter ved 37 ° C og deretter til en hypoton løsning (0,075 M KCl) i 20 minutter ved romtemperatur. Celler ble fiksert i metanol og eddiksyre (03:01 i volum) blanding i 15 minutter, og vasket tre ganger i fiksativ. Objektglassene ble lufttørket, optimalt alderen, og G-bundet ved hjelp av trypsin-løsning og farget i Giemsa følge rutineprosedyre. Bilder ble tatt med et Nikon 80i mikroskop utstyrt med karyotypering programvare fra Applied Spectral Imaging (ASI) Inc. (Vista, CA). og minimum 15 G-banded meta ble karyotyped.
fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) og rensing av EpCAM
+ Cells
HPCA /HS5 xenografttumorer celler ble behandlet med FcR-blokkerende middel (Miltenyi Biotec) i 10-15 minutter ved 4 ° C og farget med PerCP-eFluor 710 konjugert anti-EpCAM-antistoff og biotinylert mus H-2K
d-antistoff i 30 minutter ved 4 ° C. Cellene ble deretter vasket med PBS og merket med Alexa Fluor 405-konjugert streptavidin (Invitrogen, S-32351) i 10 minutter ved 4 ° C. EpCAM
+ og EpCAM
– celler ble ytterligere renset ved anvendelse av FACS [21], [25]. Post-analyser viste renhet i begge populasjoner blir . 98%
Sphere Dannelse Analyser
Grunnleggende prosedyrer for sfære formasjons analysene ble tidligere beskrevet [21], [25]. Vi renset EpCAM
+ -celler fra HPCA /HS5 xenografttumorer via MACS, og dyrket dem opp i serumfritt prostata epitelial basalmedium (PrEBM) inneholdende B27 (Invitrogen), 20 ng /ml EGF og bFGF i Purecol (Advanced BioMatrix, # 5005-B) belagt T-25 kolber. Når disse celler ble sammenflytende, høstet vi cellene via 0,05% trypsin /EDTA, og sådd ut i enkeltceller i 6-brønners ULA plater med en tetthet på 5000-10000 celler /brønn. Spheres ble scoret i ~ 2 uker. For serie sfære-dannelse analyser, ble første generasjon kuler høstet med 0,025% trypsin /EDTA, gnidd med en 27-G kanyle, filtrert gjennom en 40-mikrometer sil, og replated som ovenfor. Denne prosessen ble gjentatt i opptil 3-4 generasjoner.
Statistisk Analyse
Tumor-initiere celle frekvensene ble sammenliknet med likelihood ratio tester. Forskjeller i tumor-take hastighet ble bestemt av Andel test. Statistisk signifikans ble definert som
P
. 0,05
Resultater
HPCA Piece Xenotransplants Vis Høyere Tumor Tar på Subkutan Side enn på andre nettsteder
lab har så langt jobbet på 114 pasientprøver ferske hentet fra prostatektomi. Noen av disse prøvene har blitt brukt i vår tidligere studier [13], [14], [21], [22], [25], [31], og de fleste av dem ble anvendt i det aktuelle prosjekt (tabell S2). Av de 114 HPCA prøvene, hadde 15,8% kombinert Gleason Score (GS) 6, 52,6% GS7, 11,4% GS8, og 20,2% GS9. Generelt ble de HPCA prøvene anvendt i 2 typer forsøk:., Enten transplantert, som små stykker, i hann immunodefekte mus for å generere xenografter eller brukt nylig isolerte enkeltceller for in vitro og in vivo studier (Fig. 1)
For xenograft studier, implantert vi svulst stykker (~2-3 mm
3) på tre ulike anatomiske områder [14], dvs. huden (SC), nyrekapsel (KC), eller anterior prostata (AP) i en av de tre immunsvikt musestammer, dvs. NOD /SCID, Rag2
– /- eller NOD /SCID-IL2Rγ
– /- (NSG) mus. NOD /SCID-mus mangler både T- og B-celler, og har funksjonell underskudd (men ikke fullstendig mangel) på NK-celler og Rag2
– /- mus mangler også T og B-celler mens NSG mus er den mest immunodeficient mangler T, B og NK-celler [14], [47]. Som oppsummert i tabell 1 og beskrevet i tabell S3, i hver stamme av mus og med hver klasse av HPCA, de s.c implantater viste den høyeste svulst ta i forhold til KC og AP xenotransplants. Videre i NOD /SCID mus, som ble brukt oftest, observerte vi økende svulst tar med økende svulst klasse på s.c og KC områder (Tabell 1, Tabell S3). Interessant nok ble det ikke observert tumoren karakter-assosiert økning i tumor ta i Rag2 og NSG mus, og HPCA prøvene xenotransplanted i NSG mus viste ikke en økning i tumor tar i forhold til de implanteres i NOD /SCID-mus (tabell 1; Tabell S3 )
HPCA Cells, i motsetning HPCA Pieces, Klarte ikke å sette i gang Svulster i NOD /SCID mus. ingen signifikante effekter med rUGM, kafeer, og udødeliggjort menneske (benmarg) stromal (HS5) Cells
Deretter, spurte vi om ferskt isolerte HPCA celler, snarere enn tumor stykker, kan også regenerere svulster i en hvilken som helst av de immundefekte mus. I begynnelsen, saman vi HPCA celler med rUGM for KC transplantasjoner [48] – [50] eller blandet HPCA cellene i 50% Matrigel for s.c injeksjoner i mannlig NOD /SCID-mus [14]. I 3 GS6 HPCA (HPCa9, 10 og 16) prøver, når 10.000 til 100.000 celler HPCA rekombinerte med rUGM ble implantert under KC, observerte vi 0/30 utvekst (se Tabell 4 i ref. 14). Tilsvarende, i to GS7 HPCA (HPCa11 og 14) prøver, når 10.000 til 200.000 HPCA celler rekombinert med rUGM ble implantert under KC, observerte vi 0/17 utvekst (tabell 4 i ref. 14). Til slutt, når 1 million av HPCa18 (GS7) celler ble injisert s.c i 50% Matrigel, var det ingen enkelt svulst med 4 injeksjoner (Tabell 4, ref. 14). Vi deretter renset CD44
+, CD133
+ eller CD44
+ CD133
+ (og tilsvarende markør-negative) HPCA celler fra 4 GS6 tumorer (HPCA 9, 10, 13 og 16), 4 GS7 tumorer (HPCa4, 6, 8 og 12), og en GS9 tumor (HPCa42) og implanteres økende antall celler (fra 1 000 til 2 millioner) subkutant (for GS9 HPCA celler) eller i det KC eller AP (for resten) av de mannlige NOD /SCID mus og vi observerte 0/225 utvekster (tabell 6 i ref. 14). Vi har også renset CD44
+ /CD44
– HPCA celler fra 3 GS8 (HPCa25, 32 og 33) og en GS9 (HPCa24) primær (1 °) xenografter og implantert 1.000 til 500.000 celler i 50% Matrigel på det mest følsomme området, dvs. huden av mannlige NOD /SCID-mus. Igjen, vi ikke observere noen svulst regenerering av 52 implantasjoner (tabell 6 i ref. 14). Til slutt, når usorterte HPCA celler renset fra 3 GS6 tumorer (HPCa2, 10 og 16), 4 GS7 tumorer (HPCa3, 11, 14 og 18), 2 GS8 tumorer (HPCa15 og 37), og 2 GS9 tumorer (HPCa5 og 21), enten injisert subkutant alene Matrigel eller saman med rUGM og deretter transplantert under KC, ga opphav til 0/92 svulster (tabell 7 i ref. 14). I alle disse transplantasjonsforsøk, ble de mannlige NOD /SCID-mus supplert med eksogene testosteron pellets.
Neste, vi co-injisert usorterte eller markør sortert-HPCA celler med kafeer, som har blitt rapportert å fremme svulst utvikling i noen eksperimentelle systemer [51], enten subkutant eller under KC av testosteron-supplert mannlig NOD /SCID-mus. Vi observerte 3 utvekster av totalt 56 injeksjoner (tabell S4). Likevel, 3 utvekster var ikke serielt transplant (tabell S4).
Nylig har human benmarg avledet mesenchymale stromal (eller stamme) celler (MSC) er vist å integrere inn i tumorassosiert stroma og fremme bryst kreftcelle metastase [52]. Vi lurte på om MSC kan legge til rette for svulst tilberedning av primær HPCA celler. Den HS5 cellelinje, generert fra human benmarg, ble udødeliggjort ved transduksjon med human papilloma virus E6 /7-gener [44], og er blitt vist å understøtte proliferasjonen av PCA-celler i kulturer [53], [54]. Vi dermed subkutant coinjected usorterte eller markør sortert-(dvs. CD44) HPCA celler (fra 2 GS6, 3 GS7, 4 GS8, og 1 GS9 svulster) med 100.000 HS5 celler i NOD /SCID-mus. Vi observerte 4 svulster i totalt 54 injeksjoner (tabell S5). Igjen, 4 regenererte svulster kunne ikke bli serielt transplantert (ikke vist). HS5 celler alene ikke generere svulster i NOD /SCID mus ved ≤ 100 000 celler (data ikke vist).
Til sammen vår tidligere (ref. 14, Bord 4, 6 og 7) og strøm (Tabell S4 og S5) studier indikerer at
NOD /SCID mus er ikke ettergivende for å rekonstituere trans svulster fra primær HPCA celler, selv i nærvær av rUGM, kafeer, eller MSC som HS5
.
HS5 Cells Fremkall HPCA Cells å Initiere transplant Svulster i NSG mus
Hva om vi bruker flere immunsvikt NSG mus? Vi først injisert fersk renset primære HPCA celler fra 5 pasient svulster (2 GS7, en GS8, 2 GS9) subkutant i NSG mus. I totalt 37 injeksjoner, kan vi ikke observere noen tumorvekst etter 8 måneder (tabell 2). Siden HS5 celler litt økt svulst regenerering av HPCA celler i NOD /SCID-mus (tabell S5), subkutant vi coinjected usorterte HPCA celler fra 9 pasientprøver med HS5 celler i NSG mus og bemerkelsesverdig, dette endret «rekombinasjon protokoll» indusert tumordannelse i 41/59 (dvs. ~70%) injeksjoner (Tabell 3). HPCA celler avledet fra tre GS9, en GS8, og 4 GS7 svulster alle regenereres svulster når coinjected med HS5 celler (Tabell 3). Vi har også etablert 1 ° transplantater i Rag2 mus fra stykker av 3 andre HPCA prøver (dvs. HPCa57, 58 og 70). Når 1 ° xenograft celler ble renset ut og coinjected med HS5 celler i mannlig Rag2 eller NSG mus, vi lett fått de 2 ° xenografter [21, 25; data ikke vist]. Totalt har vi etablert 11 HPCA /HS5 xenografter fra 7 GS7 (HPCa57, 58, 70, 83, 84, 85 og 92), en GS8 (HPCa91), og tre GS9 (HPCa80, 87, og 96) svulster. Disse resultatene kan tyde på at HS5 cellene svært effektivt fremme svulst regenerering i NSG mus fra friske HPCA celler.
rekonstituert
svulster var svært tumorigent og kan bli passert på ubestemt tid (Tabell S6; data ikke vist). Også de regenererte tumorene var i stand til å gi opphav til transplanterbare tumorer uavhengig av HS5 celler (Tabell S6). Videre usortert eller CD44-sortert (både CD44
+ og CD44
-) HPCA celler var i stand til å re-initiere tumorer både subkutant og i dorsal prostata (DP) og, i betydelig grad, HPCA celler renset fra xenotransplantater opprinnelig etablert i NSG mus kunne regenerere svulster i NOD /SCID-mus (Tabell S6, data ikke vist)
Rekonstituerte «Prostata» svulster er av human opprinnelse og presentere en udifferensiert og epithelial morfologi. IHC, biokjemiske, og molekylær karakterisering
Vi først gjennomført histologiske og IHC karakterisering av de rekonstituerte svulster. Som forventet, HPCa57 pasienten svulst utstilt typisk GS7 histologi med overfylt svulst kjertler, hvor de fleste celler farget positivt for prostata luminal epitelcelledifferensiering markører PSA, kjernekraft AR, og cytokeratin 8 (CK8) (Fig. 2A). Også tumor kjertler viste positiv farging for racemase (alfa-methylacyl-CoA-racemase, også kjent som AMACR eller P504S, kodet for av
AMACR
genet), negative (eller svakt positiv) farging for CK5 (en prostata basal epitel markør), og negativ farging for p63 (en annen basal cell markør) (fig. 2A). De HPCa57 /HS5 rekonstituerte svulster i NSG mus dukket opp helt udifferensiert og manglet kjertelstrukturer og PSA uttrykk (Fig. 2B). Cellene så samlet epitelial, som støttes av nærvær av noe CK8
+ og sporadisk CK5
+ celler (fig. 2B). Interessant, spredt AR
+ og p63
+ celler kunne observeres (Fig. 2B). Farging med human-spesifikke antistoffer mot mitokondrier og Ki-67, som begge har ikke flekke musevev (fig. S1), bekreftet at human opprinnelse av den regenererte HPCa57 tumor (fig. 2B). ble observert lignende mønstre av morfologi og markør ekspresjon i HS5-rekonstituert HPCa58 (fig. 3) og 9 andre HPCA prøver, dvs. HPCa70, 80, 83, 84, 85, 87, 91, 92, 96 (data ikke vist).
(A) Farging av HE, AR, Ptil, CK8, CK5, p63 og Racamase i HPCa57 pasientprøve. (B) HPCa57P1 xenograft tumor, avledet fra coinjection med 100.000 HS5 celler, ble brukt til å lage seriesnitt som ble farget for HE, Hu-mito, Hu-Ki67, AR, Ptil, CK8, CK5 og p63. Både lav (dvs. 100x) og høy effekt (dvs. 400x) forstørrelser ble vist. Pil viser CK5
+ celler.
(A) Farging av HE, AR, Ptil, CK8, CK5, p63 og Racamase i HPCa58 pasientprøve. (B) HPCa58P1 xenograft tumor, avledet fra coinjection med 100.000 HS5 celler, ble brukt til å lage seriesnitt ble farget for HE, Hu-mito, Hu-Ki67, AR, Ptil, CK8, CK5 og p63. Både lav (dvs. 100x) og høy effekt (dvs. 400x) forstørrelser ble vist. Pil viser CK5
+ celler.
I samsvar med IHC resultater, RT-PCR analyse ved hjelp av menneske-spesifikke primere avslørte at ingen av de HPCA /HS5 xenografter uttrykt
PSA
men de fleste uttrykte ulike nivåer av menneskelig
AR
mRNA (fig. 4A). Spesielt dyrkede murine fibroblaster (Swiss 3T3) og HS5 celler var negative for begge
AR Hotell og
PSA
mRNA (fig. 4A). Western blotting eksperimenter for fire luminal cellemarkører, racemase, PSA, AR, og CK18 bekreftet mangel på PSA uttrykk og avdekket varierende grad av de andre 3 markører i forskjellige xenografter (Fig. 4B-D). Legg merke til at dyrkede celler og HS5 HS5 tumorer (se nedenfor) uttrykte ikke CK18 (fig. 4D, pil) selv om de uttrykte lave nivåer av racemase (Fig. 4B). Av og til ble HS5 svulster funnet å uttrykke lave nivåer av AR protein (fig. 4C) selv om de uttrykte knapt synlig
AR
mRNA (fig. 4A). De fleste HPCA /HS5 xenografter uttrykt høyere nivåer av racemase enn PC3 celler (Fig. 4B). Interessant, Western blotting for p63 viste meget høye nivåer i PC3 og LNCaP-celler, lett påvisbar ekspresjon i HPCa57 og HPCa96 xenotransplantater, og meget lave nivåer i flere andre HPCA xenotransplantater (HPCa58, 70, og 91) (fig. 4B). Disse resultatene samlet tyder på at
HPCA /HS5 xenografter inneholde menneskelige prostata epitelceller
. Som ytterligere støtte, Western blotting av AR og CK18 på en serie av HPCa57 /HS5 xenografttumorer, fra 1 ° generasjon (P1) til 4 ° generasjon (P4), avledet fra sc eller DP implantasjoner, viste at alle disse tumorer var positivt for AR og CK18 (figur 4E).
(A) RT-PCR resultatene av AR, PSA, og β-aktin ved hjelp av humane spesifikke primere. LNCaP, TRPC (behandlings ildfaste prostatakreft, 46) og Du145 celler ble brukt som kontroller. (B-D) Western blotting av racemase, PSA, p63, CK18 og AR på HPCA-HS5 xenografttumorer og tumorcelle-avledet kuler. GAPDH og β-actin ble brukt som laste kontroller.
