Abstract
Til tross for nylige forbedringer i pasientutfall ved hjelp av nyere androgen reseptor (AR) pathway hemmere, behandling motstand i kastrering resistent prostatakreft (CRPC) fortsetter å være et klinisk problem. Co-targeting alternative motstand banene er av betydelig interesse for å behandle CRPC og forsinke utbruddet av motstand. Både AKT og MEK signalveier bli aktivert som prostatakreft utvikler resistens mot AR-målrettet terapi. Denne pre-klinisk studie utforsker co-targeting disse banene i AR-positive prostatakreft modeller. Ved hjelp av ulike
in vitro
modeller av prostatakreft sykdomstilstander inkludert androgen avhengige (LNCaP), CRPC (V16D og 22RV1) og ENZ resistent prostatakreft (MR49C og MR49F), vurderer vi relevansen av målretting både AKT og MEK veier. Våre data viser at AKT hemming induserer apoptose og hemmer cellevekst i PTEN null cellelinjer uavhengig av deres følsomhet for hormonbehandling; imidlertid, AKT inhibering hadde ingen effekt på PTEN positive 22RV1 cellelinje. Interessant, fant vi at MEK hemming hadde større effekt på 22RV1 celler i forhold til LNCaP, V16D eller ENZ resistente celler MR49C og MR49F celler.
In vitro
, kombinasjon AKT og MEK blokade hadde bevis for synergi observert i enkelte cellelinjer og analyser, men dette var ikke konsekvent på tvers av alle resultatene.
In vivo
, kombinasjonen av AKT og MEK inhibering resulterte i mer konsistent tumorvekst inhibering av MR49F xenotransplantater og lengre sykdomsspesifikk overlevelse sammenlignet med AKT-inhibitor monoterapi. Som i vår
in vitro
studie, 22RV1 xenografter var mer motstandsdyktig mot AKT hemming mens de var mer følsomme for MEK hemming. Våre resultater tyder på at målretting AKT og MEK i kombinasjon kan være en verdifull strategi i prostata cancer når begge veier er aktivert og ytterligere støtte viktigheten av å karakterisere den dominerende onkogene banen i hver enkelt pasients tumor for å velge en optimal terapi.
Citation: Toren P, Kim S, Johnson F, Zoubeidi A (2016) Kombinert AKT og MEK Pathway Blockade i prekliniske modeller av Enzalutamide resistent prostatakreft. PLoS ONE 11 (4): e0152861. doi: 10,1371 /journal.pone.0152861
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 07.10.2015; Godkjent: 20 mars 2016; Publisert: 05.04.2016
Copyright: © 2016 Toren et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Finansieringen ble gitt av Discovery Grant, Prostate Cancer Canada og Astrazeneca til A. Zoubeidi. PT ble støttet av den kanadiske Urological Association Scholarship Foundation. Astrazeneca var involvert i diskusjoner om studiedesign og gjennomgang av manuskriptet, men datainnsamling og analyse og beslutning om å publisere ble gjort av forfatterne. De andre organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. AZ fremlegger mottar forskningsmidler fra Astrazeneca og Gilead Sciences. PT fremlegger mottar forskningsmidler fra Innocrin Pharma. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Medisinsk eller kirurgisk kastrasjon er fortsatt den første linjen av systemisk behandling for metastatisk prostatakreft (PCA) siden oppdagelsen over 70 år siden [1]. Dessverre forblir kur unnvikende følgende kastrering og pasienter uunngåelig gå videre for å utvikle kastrering resistent prostatakreft (CRPC). Potente androgen reseptor (AR) sti-hemmere som enzalutamide (ENZ) og abirateron blir nå vanligvis brukes i behandling av pasienter med CRPC. Mens overlevelse er forbedret, motstand likevel uvegerlig utvikler seg til disse midler [2]. Det er forventet at med økt klinisk bruk av disse mer potent AR pathway inhibitorer som er målrettet mot tilnærminger mot ikke-AR drevet motstandsveier vil få økende betydning [3]. Derfor, forståelse og målretting trasé innblandet i motstand har viktig klinisk relevans.
PI3K /AKT /mTOR og RAF /MEK /ERK signalveier spiller en viktig rolle i celleoverlevelse, behandling motstand, og samarbeide for å legge til rette for PCa progresjon til CRPC [4-8]. Begge AKT [9, 10] ERK og [11, 12] signalveiene blir oppregulert med CRPC og er assosiert med dårlig prognose [13, 14]. Det er utstrakt krysstale mellom de to banene så vel som med andre onkogene trasé [15, 16]. Vi har tidligere vist at både AKT og ERK, er aktivert etter behandling med ENZ i PCA-celler [17]. Targeting AKT alene er ikke tilstrekkelig til å indusere betinget dødelighet på grunn av tilbakemeldingene signaliserer fører til aktivering av AR og derfor målrette AKT alene er ikke en god strategi for å bekjempe ENZ motstand [18]. Interessant nok har dual hemming av PI3K /AKT og MEK /ERK trasé vist lovende i prekliniske modeller for andre kreftformer [19-22]. Resultater av kombinasjonen av en mTOR-hemmer med en MEK hemmer i den transgene
NKx3
.
1-PTEN
murine prostatakreft modellen støtter begrunnelsen for en kombinert tilnærming i prostata kreft [14] videre terapi.
Derfor satt vi å undersøke kombinasjon AKT pluss MEK-hemmere i menneskelige prostata kreft modeller, spesielt ENZ resistent prostatakreft modeller. Vi har valgt et panel av cellelinjer, inkludert ENZ-resistente LNCaP-avledede cellelinjer, så vel som den 22RV1 cellelinje. Den 22RV1 prostatakreft-cellelinje besitter aktivering av MEK /ERK-reaksjonsveien [23], mens Enz-resistente MR49C og MR49F er kjent for å være mer avhengig av AKT-reaksjonsveien [24]. Vi viser at kombinasjonen blokade av AKT og MEK blir bedre respons sammenlignet med monoterapi i noen av ourin
in vitro Hotell og
in vivo
prostatakreft eksperimenter. Spesielt resultatene varierer betydelig mellom modellsystemer med fravær av ekstra fordel i noen tilfeller, fremhever behovet for å riktig identifisere hvilke pasienter som vil dra mest nytte av en kombinasjon tilnærming.
Materialer og metoder
prostata kreft cellelinjer
Den menneskelige prostata kreft LNCaP og 22RV1 cellelinjer brukt i denne studien var vennlig levert av Dr. Leland WK Chung [25] (1992, MDACC, Houston Tx). V16D (kastrere resistente), ble MR49F og MR49C celler (enzalutamide resistente) avledet gjennom serie xenograft passering av LNCaP celler som tidligere beskrevet [26] (S1 fig). Kort sagt ble LNCaP-celler injisert til mus, og når serum PSA nådde 50 ng /ml mus ble kastrert. Når serum PSA igjen nådde 50 ng /ml 5-6 uker senere, ble svulster som kalles for kastrering motstandsdyktig. V16D celler ble avledet fra en LNCaP xenograft motstandsdyktig mot kastrering. Svulster ble skåret ut og cellelinjer ble generert i androgen-fritt medium. For MR49C og MR49F cellelinjer, når LNCaP xenografter nådd kastrering motstandsdyktig staten, ble de behandlet med 10 mg /kg ENZ med en påfølgende PSA nedgang til lave serumverdier. Når serum PSA tilbake til kastrere resistente nivåer eller høyere, ble svulster kalt ENZ bestandig. Disse tumorene ble deretter ført 3 ganger i kastrering mus behandlet med ENZ og cellelinjer ble generert. Celler ble opprettholdt i RPMI 1640-medium (Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i 5% CO2-atmosfære, med 10 uM ENZ tilsatt til alle medier for MR49C og MR49F celler.
Reagenser
AKT hemmer AZD5363 ble gitt av Astrazeneca (Macclesfield, UK). ENZ ble kjøpt fra Shanghai Haoyuan Chemexpress (Shanghai, Kina), PD0235901 fra Selleck Chem (Houston, Texas) og LY294002 og UO126 fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO). LY294002 er en reversibel PI3K inhibitor; AZD5363 er en konkurransedyktig pan-AKT hemmer [27]. PD0325901 er en konkurransedyktig MEK1 /2 inhibitor mens UO126 inhiberer MEK1 /2 i en ikke-konkurrerende, selektiv måte [28]. Stamløsninger av AZD5363, PD0235091, UO126 og LY294002 ble utarbeidet i dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma-Aldrich); ENZ ble fremstilt i H
2O.
assays celleproliferasjon
Cellenes levedyktighet ble undersøkt i 96-brønners kulturplater ved hjelp av WST-1 reagens og /eller krystallfiolett analyse, som beskrevet tidligere [26].
Cell syklus analyse
ble utført Cell syklus analyse med propidiumjodidfarging som tidligere beskrevet [29]. Relativ DNA innhold ble analysert ved FACS Canto II strømningscytometer bruker cyflogic v1.2.1 programvare (www.cyflogic.com) for analyse.
Caspase-3 aktivitetsanalyse
Caspase-3-aktivitet var vurdert ved bruk av Caspase 3 Assay kit, med acetyl Asp-Glu-Val-Asp 7-amido-4-metylkumarin (Ac-DEVD-AMC) fluorometrisk substratet (Enzo Scientific). Tretti mikrogram helt cellelysat ble inkubert med caspase-3 substrat AC-DEVD-AMC ved 37,5 ° C i 2,5 timer og caspase-3 aktivitet ble kvantifisert med et fluorometer med eksitasjon satt til 365 nm og emisjon 460nm. Brett endre forskjeller fra kontrollen ble beregnet følgende subtraksjon av målinger fra tomme brønner uten lysat.
Western blot analyse
Totalt proteiner ble hentet i RIPA buffer som tidligere beskrevet [29]. 30-50 ug av protein lysatet ble separert ved SDS-PAGE, og Western blot ble utført ved anvendelse av primære antistoffer PSA, AR (Santa Cruz Biotechnology), vinculin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), PARP, p-AKT Ser473 , AKT, p-ERK, total ERK, total S6 og p-S6 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Påvisning av sekundære antistoffer ble utført ved hjelp av ODYSSEY IR imaging system (Li-COR biovitenskap) eller ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).
Kvantitativ revers transkripsjon (RT) -PCR
RNA-ekstrahering og RT-PCR ble utført som tidligere beskrevet [30]. Sanntidsovervåking av PCR amplifikasjon av cDNA ble utført ved hjelp av følgende primerpar og sonder:
AR plakater (Hs00171172_m1),
PSA plakater (Hs00426859_g1), og
GAPDH plakater (Hs03929097_g1 ) (Applied Biosystems, Foster City, CA) på ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) med TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems). Target genekspresjon ble normalisert til
GAPDH
nivåer i respektive prøvene som en intern kontroll.
Animal behandling
Seks uker gamle kastrerte atymiske nakne mus (Harlan Sprague-Dawley, Inc.) ble injisert subkutant med 2×10
6 MR49F celler (suspendert i 0,1 ml Matrigel; BD Biosciences) på begge flanker. Ni mus per arm ble randomisert til kjøretøy (0,1% metylcellulose), AZD5363 100mg /kg to ganger daglig, PD0325901 5mg /kg OD eller kombinasjonen. ENZ 10 mg /kg ble administrert før inokulering og fortsatte til svulster nådde 200mm
3. Tumormålinger ble målt to ganger i uken og tumorvolum beregnes med formelen L x B x D x 0,5236. Legemidler ble administrert som et oralt inntak 5 dager på, 2 stk. PSA nivåer ble målt ukentlig ved hjelp av automatisert enzymatisk immunoassay (Cobas, Montreal, Quebec, Canada). Mus ble avlivet hvis den totale tumorbelastning var 2000mm
3 eller hadde ved 20% tap av kroppsvekt. For de 22RV1 xenografter, 2×10
6 celler ble podet inn på venstrekanten av nakne kastrat mus. Åtte mus per arm ble randomisert til kjøretøy, AZD5363 100mg /kg to ganger daglig, selumitinib (AZD6244, Arry-142886) 25mg /kg to ganger daglig, og kombinasjonen. De 22RV1 xenotransplantater ble ofret når tumorvolumet var 1500mm
3. Alle mus ble overvåket regelmessig for den kliniske tilstanden under tilsyn av en veterinær ved University of British Columbia. Ved ofring ble alle musene dypt bedøvet med isofluran før de ble avlivet med CO2. Svulster samlet ved ofring ble delt i deler og hurtigfrosset i flytende nitrogen eller fiksert i formalin. Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til kanadisk Rådet Animal Care retningslinjer og med godkjenning av Animal Care komité University of British Columbia (protokoll # A12-0210).
Immunohistochemistry
En vev microarray av alle xenografttumorer MR49F ble bygget ved hjelp av en manuell vev microarrayer (Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, WI). Immunhistokjemisk farging ble utført som tidligere rapportert [31]. Alle sammenligninger av fargeintensitet ble gjort på 20X forstørrelse på triplikate prøver av en patolog blindet for behandling oppdrag.
Statistisk analyse
Alle resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM, med enveis ANOVA benyttet for å detektere signifikante forskjeller mellom flere behandlinger. Når ANOVA viste signifikante forskjeller (p 0,05), ble Tukey HSD post-hoc test brukes til å sammenligne midler. Tumorveksthastigheten ble beregnet ved hjelp av lineær regresjon. Kaplan Meier overlevelsesanalyse sammenlignet kreftspesifikk overlevelse (CSS) og total overlevelse, med log-rank test som brukes til å sammenligne grupper. CSS ble definert som tiden fra behandlingsstart til total tumorvolumet overskredet 2000mm
3 og total overlevelse som tiden fra behandlingsstart til offer. Kombinasjonen indeks (CI) ble beregnet ved anvendelse av Calcusyn programvare (Biosoft, Cambridge, UK). En CI 1 indikerer synergi, en CI 1 indikerer antagonistiske interaksjoner
Resultater
Effekt av målretting MEK og AKT trasé på AR signalveien
For å undersøke. relevansen av AKT og MEK trasé i PCA målrettet vi respektive baner ved hjelp AZD5363 (AKT hemmer) og PD0325901 (MEK hemmer). Vi evaluerte deres effekter alene og i kombinasjon i modeller for ulike stadier av prostatakreft inkludert androgen sensitive celler (LNCaP), kastrere resistente (V16D, 22RV1) og ENZ-resistente celler (MR49C og MR49F) (fig 1). Blokkering AKT med AZD5363 ble evaluert av dens effekt på AKT nedstrøms effektor p6SK og ikke på AKT fosforylering seg selv på grunn av innholdet av AZD5363. I utgangspunktet, AZD5363 induserer økt AKT-fosforylering som er inaktiv, oppstår et fenomen med mange ATP-konkurrerende, katalytiske inhibitorer av AKT, og er på grunn av det proteinet som blir holdt i en hyperfosforylert men katalytisk inaktiv form som en konsekvens av forbindelse binding som er etablert tidligere . AZD5363 ble funnet å indusere en reduksjon i S6K fosforylering i alle cellelinjer; denne effekten var mer uttalt i PTEN null-celler MR49C, MR49F, LNCaP og V16D celler sammenlignet med PTEN positive 22RV1 celler (fig 1). Lignende effekter ble observert ved anvendelse av andre MEK-inhibitor (UO126) og AKT-inhibitor (LY294006) eller i kombinasjon med Ay (fig 1, fig S2). I 22RV1 celler, PD325901 opphever fullstendig ERK-fosforylering mens AZD5363 hadde ingen effekt på AKT nedstrøms effektor S6K fosforylering som var bare med kombinasjon av AZD5363 og PD0325901 (figur 1). Imidlertid ble ingen ytterligere reduksjon i ekstra fordel nivåer observert med kombinasjonen sammenlignet med MEK-inhibitor monoterapi. Videre observerte vi at AKT hemming økt både AR og PSA på protein og RNA-nivå i LNCaP og dets derivater (fig 1). Selv om AZD5363 øket AR og PSA-nivåene i alle cellelinjer, er effekten av PD0325901 på AR og PSA-nivåene alene eller i kombinasjon med AZD5363 varierte mellom cellelinjer (Fig 1). I motsetning til LNCaP-baserte cellelinjer, ble PSA ytterligere øket ved kombinasjon av AZD5363 og PD0325901 i 22RV1 celler. Spesielt disse resultatene speiler tilsvarende data med tidligere testet vellykket kombinasjon av AZD5363 og ENZ hvor endringene i AR uttrykk også skilte mellom 22RV1 og LNCaP-baserte cellelinjer (S2 fig) [32]. Tatt sammen, konkluderer vi at AKT og MEK samarbeide for å regulere AR veien.
(A) Effekt av AKT og MEK hemming på nedstrøms signalveier. Androgenavhengige PCa cellelinje LNCaP, CRPC (V16D og 22RV) og ENZ resistente cellelinjer MR49C, MR49F cellelinjer ble behandlet med AZD5363 1 uM, 20 uM PD0325901 alene eller i kombinasjon i 48 timer. Totale proteiner ble hentet ut og vestlige blotter ble utført ved hjelp av AR, Ptil og PI3K /AKT vei signaliserer proteiner som angitt. Representative blot av duplikate eksperimenter er vist. (B-C) Virkning av AKT og MEK inhibering på AR pathway. MR49C, MR49F og 22RV cellelinjer ble behandlet med AZD5363 1 uM, 20 uM PD0325901 alene eller i kombinasjon i 48 timer. RNA ble ekstrahert fra forskjellige cellelinjer og kvantitativ sanntid ble utført ved anvendelse av TaqMan prober for AR (B) og AR målgenet PSA (C). Representative resultatene av biologiske duplikater med tekniske triplicates vises.
Effekt av kombinasjonen av MEK og AKT blokaden på celle apoptose og proliferasjon
For å bestemme den biologiske aktiviteten til målretting AKT og MEK signale trasé på celle apoptose, behandlet vi vårt panel av cellelinjer med AZD5363, PD0325901 eller kombinasjonen. Våre data viste at kombinasjonen av målretting AKT og MEK induserer apoptose som vist ved økt sub G0 /G1 cellesyklus befolkningen. Denne effekten var større enn AZD5363 monoterapi i CRPC celler V16D (17% vs 10%, P = 0,009) og ENZ bestandig MR49C (29% vs 12%, p = 0,005) og MR49F (12% mot 3%, p = 0,006 ) -celler. Ingen av behandlingene viste noen betydelige endringer i under G1 /G0 fraksjon i 22RV1 celler (fig 2). I motsetning til dette, i androgen-følsomme LNCaP-celler, kombinasjonsterapi behandling ikke viser ytterligere induksjon av sub G1 /G0 sammenlignet med AZD5363 monoterapi (17% vs 16%, p = 0,76). S-fasen og G2 /M-fraksjoner viste seg å redusere til et tilsvarende beløp i MR49C, MR49F og V16D celler med AZD5363 eller kombinasjonen, med betydelige forskjeller for begge behandlinger fra kontroll (P 0,001). Videre AZD5363 og PD325901 kombinasjonsbehandling indusert spaltet PARP i LNCaP-baserte cellelinjer i forhold til PTEN positive celler 22RV1 celler (figur 2). Selv om ikke statistisk forskjellig, ble tilsvarende trender observert med caspase 3 aktivitetsanalyser (fig 2).
(AE) propidiumjodid- flowcytometri cellesyklus analyse av angitte cellelinjer viser økt apoptotisk cellesyklusen fraksjonen (SubG1 /G0) (venstre panel). Midler for tredoble eksperimenter er plottet +/- SEM. Representative resultatene av alle cellesyklus populasjoner er vist i høyre panel. (F) Indikerte celler ble behandlet med AZD5363 1 uM, 20 uM PD0325901, eller en kombinasjon i 48 timer. Proteiner ble ekstrahert og western blot ble utført ved anvendelse av PARP-antistoff, vinculin ble anvendt som en kontroll lasting. Representative blot av to eller flere eksperimenter er vist. (G) Caspase-3-aktivitet i MR49C, MR49F, 22RV1, LnCap og V16D cellelinjer behandlet med AZD5363 og /eller PD0325901 i 24 timer. Gjennomsnittlig ganger endring +/- SEM av samlede verdier fra minst to biologiske duplikater vises.
Vi neste undersøkt om effekten observert i celle apoptose kan oversettes til celle levedyktighet. Våre data viser at targeting AKT hjelp AZD5363 påvirker celleviabilitet i alle cellelinjene som ble testet (fig 3), mens målretting MEK ved hjelp av enten PD0325901 (fig 3) eller UO126 (S3 figur) hadde økt aktivitet i 22RV1 celler sammenlignet med de andre cellelinjene ytterligere bekreftelse våre data på cellesyklus befolkning og PARP cleavage. Selv om vi observerte trender for redusert levedyktighet og synergi med kombinasjonen sammenlignet med monoterapi i LNCaP celler og V16D celler, i MR49C og MR49F celler kombinasjonen ikke vises synergistisk (fig 3). Dette ble ytterligere bekreftet ved hjelp av en kombinasjon av MEK hemmer U0126 med AKT inhibitor LY294006 i MR49C, MR49F celler (S3 Fig). Synergy ble observert i 22RV1 celler med en kombinasjon indeks. 1 (fig 3, S3 figur)
(AE) MR49C, MR49F, 22RV1, LNCaP og V16D cellelinjer ble behandlet med AZD5363 og /eller PD0325901 som indikert i 48 timer og cellelevedyktigheten ble bedømt ved bruk av WST-1-assay. Samlede resultater av biologiske triplicates med tekniske triplicates vises. Kombinasjon indeksene er vist innfelt, med verdier. 1 indikerer synergi
Målrette AKT og MEK trasé i kombinasjon hemme tumorvekst og bedret kreftspesifikk overlevelse
Siden aktiviteten av kombinasjonsbehandling viste forskjeller knyttet til PTEN uttrykk, vi undersøkte
in vivo
hvordan målretting AKT og MEK vil påvirke tumorvekst i to mulige kliniske settinger (PTEN positive og negative svulster). Vi brukte ENZ-resistente MR49F celler og CRPC 22RV1 celler for å vurdere
in vivo
effekten av kombinasjonen av målretting AKT og MEK trasé.
MR49F xenotransplantater ble følsom for AZD5363, noe som gjør vurderingen av ekstra fordel med MEK blokade utfordrende. Monoterapi med PD0325901 demonstrert tumorvekstinhibitering og demonstrert en ikke-signifikant tendens til lavere serum PSA i forhold til kjøretøy (Fig 4). Kombinasjonsbehandling med AZD5363 og PD0325901 i MR49F xenotransplantater ikke resultere i en større reduksjon i tumorvolumet i forhold til AZD5363 monoterapi, men kombinasjonen har vesentlig forbedret kreft spesifikk overlevelse (CSS) (P 0,001) sammenlignet med kjøretøy- og PD0325901- behandlings armer (Fig 4). Median CSS var 17 dager for bærer-behandlede mus, 25 dager for PD0325901-behandlede mus, og ble ikke oppnådd for noen av AZD5363 alene eller i kombinasjon med PD0325901. Ingen mus i kombinasjonsterapi ble avlivet på grunn av tumorstørrelsen etter 35 dagers behandling. Serum PSA ble betydelig redusert i både AZD5363 og kombinasjonsbehandlingsarmene i forhold til kjøretøy (Fig 4).
Etter etableringen av svulster (200mm3) fra subkutan injeksjon av ENZ resistente MR49F celler hos kastrerte mus under trykket av 10 mg /kg daglig av ENZ, ble musene behandlet med 100 mg /kg, AZD5363 100mg /kg to ganger daglig, PD0325901 5mg /kg QD eller AZD5363 100mg /kg to ganger daglig + PD0325901 5mg /kg QD. (A) Representative data for MR49F bety tumorvolum i løpet av 4 uker er vist. (B) Mean MR49F tumorveksthastigheten for hver behandlingsgruppe +/- SEM beregnet ved hjelp av lineær regresjon estimering av tumorveksthastigheten for hver mus. (C) Mean MR49F ukentlig Ptil plottet som fold endring fra baseline for hver behandlingsgruppe +/- SEM. (D) Waterfall tomt på enkelte PSA-måling etter 3 ukers behandling for alle MR49F xenografter i studien. (E-F) Kaplan-Meier kreft spesifikk overlevelse og total overlevelse kurver for behandlingsarmer av MR49F xenografter. (G) Mean 22RV1 xenograft volum etter behandling med kjøretøy, AZD5363 100mg /kg to ganger daglig, selumetinib 25mg /kg QD eller AZD5363 100mg /kg to ganger daglig + selumetinib 25mg /kg QD. Gjennomsnittlig ganger endring i tumorstørrelse er plottet +/- SEM. (H) Waterfall tomt på 22RV1 xenograft tumor volum etter 6 ukers behandling.
Vi vurderte neste kombinasjonen av AKT og MEK sti hemming hjelp 22RV1 transplantater i kastrerte mus. AZD5363 ble igjen brukt som AKT inhibitor mens Selumetinib ble valgt som en MEK hemmer som kan være mer klinisk relevant som det er nå i klinisk evaluering og ble nylig godkjent for behandling av melanom. I motsetning til den MR49F modellen, 22RV1 tumorene var forholdsvis ufølsom for AZD5363, men gjorde demonstrere tumorvekstinhibitering til både Selumetinib og kombinasjonen av Selumetinib pluss AZD5363. Med alle 22RV1 svulster vokser relativt robust til tross for behandling, ble ingen signifikante forskjeller funnet mellom behandlingsgruppene, men den største tumorvekstinhibitering ble sett med kombinasjonsbehandling (fig 4).
Analyse av de individuelle mus tumor volum i MR49F modellen antyder at kombinert blokade kan dra en undergruppe av mus (fig 5). I AZD5363 monoterapi arm, mens de fleste svulster svarte godt, i enkelte tilfeller, tumorvekstinhibitering var minimal. Men i kombinasjonsterapi-gruppen, ble det ikke uteliggere bemerket (fig 5). Spesielt, immunhistokjemi farging av MR49F svulster demonstrert ekstra fordel flekker i mus som viste motstand mot AZD5363 (fig 5). Ingen signifikant Perk farging ble sett i mus som svarte på behandlingen (fig 5) og heller ikke var forskjeller i PS6 flekker eller Ki67 flekker oppdaget mellom kombinasjonsbehandling og AZD5363 monoterapi arm (fig 5).
(A) individuelle svulstvekstkurver for alle mus i studien gruppert etter behandling. (B) Immunohistochemistry av Perk demonstrerer detekterbare nivåer i 3 mus med tidlig motstand mot AZD5363 behandling (øverst); 3 andre mus behandlet med AZD5363 er vist for sammenligning (nederst). (C) Farging av microarray prøvene viser at positiv ekstra fordel flekker var bare tydelig i disse musene. (D) Andelen av PS6 er redusert med AZD5363 og i større grad med kombinasjonen AZD5363 + PD0325901. (E) Ki67-farging som en markør for spredning. En vev microarray ble bygget ved hjelp av tumorprøver i hver gruppe (7-9 per gruppe). Mean score til fargeintensitet gradert av en blindet patolog vises +/- SEM.
Diskusjoner
Til tross for suksessen til kastrering og nyere potent AR pathway hemmere som enzalutamide, behandling motstand forekommer i alle tilfeller. Vedvarende AR signalering er vanligvis klinisk tydelig av en stigende PSA. Utholdenhet av AR-signalisering kan drives av flere mekanismer inkludert motstand AR spleisevarianter, intra-tumoral produksjonen av androgener og aktivering av alternative reaksjonsveier som støtter AR signalering, inklusive AKT og MEK-trasé [33]. Kombinasjonsbehandling ved PCA har potensial for å øke pasientens overlevelse ved å blokkere disse motstands veier.
Tidlig klinisk erfaring i PCA pasienter antyder at målretting AKT alene er ikke en effektiv strategi. Kliniske studier av AKT hemmer monoterapi i CRPC har vist begrenset suksess med denne tilnærmingen [34, 35]. Før
in vitro
arbeid antyder at PI3K /AKT-inhibering kan resultere i opp-regulering av Raf /MEK /ERK-reaksjonsveien [36], og våre resultater i MR49F xenograft modell antyder også dette kan forekomme i enkelte tilfeller . Den anerkjente crosstalk mellom disse banene gir en begrunnelse for å kombinere begge disse hemmere [19-22, 37-39]. Klinisk erfaring med dual målretting av MEK og AKT veier er begrenset; tidlige resultater i utbredt kreftsykdom som tyder på at dual målretting av begge veier forbedrer oncologic effekt på bekostning av større toksisitet [40].
Vår studie fremhever forskjellene som kan oppstå mellom AR positive PCA modeller og spesielt relevansen av PTEN status når målretting AKT og MEK veier. Interessant, rettet mot AKT pathway økt PSA transkripsjon i de overlevende celler og denne effekten, bemerket tidligere av andre [41], kan være viktig å vurdere i utformingen av fremtidige kliniske studier med disse målrettede midler siden PSA er ofte brukt som en markør for progresjon. I LNCaP-avledet ENZ-resistente modeller, MEK hemming lagt en beskjeden fordel i forhold til AKT hemming; interessant synergi dukket større
in vivo
enn
in vitro
. I 22RV1 celler, MEK hemming alene hadde betydelig innvirkning på celleproliferasjon og signalering, men kombinasjonen av MEK og AKT hemming viste minimal ekstra fordel
in vitro
. Således, mens forbedringer i anticancer-aktivitet ble observert ved noen beregninger med kombinasjonen i hver modell, hver modell først i forhold avhengige av henholdsvis AKT og MEK, og dermed begrenser nytten av kombinasjonsbehandlingen.
Kombinert målretting av MEK og AKT veien har blitt undersøkt i flere andre kreftformer i prekliniske modeller, med resultater som støtter bruk av kombinasjonen [19-22, 37-39]. I en pre-klinisk prostatakreft
in vivo
studium, PD0325901 ble vurdert i kombinasjon med den mTOR-inhibitor rapamycin [14]. Mens vi ikke observere noen betydelig reduksjon i Ki67 med kombinasjonen, kan dette være relatert til å samle inn alle våre tumorer ved slutten av studien ved hvilket punkt de xenograft tumorer var behandlingsresistente. Nylig Park et al, viste kombinasjonen av selumitinib og pan-PI3K inhibitor GSK2126458 forbedret tumorvekstinhibitering forhold til enten monoterapi i AR-negative DU145 og PC3 xenografter [42]. Samlet sett sine resultater i AR-negative modeller er sammenlignbare med våre resultater. Tatt sammen, våre data tyder på at effekten av målretting AKT og MEK er uavhengig av sykdomstilstanden av prostatakreft og at effekten korrelerer med aktiveringen av disse baner i tumoren.
Vårt studium er begrenset av flere aspekter av våre prostatakreft modeller. LNCaP-celler synes å være sterkt avhengig av AKT pathway. Likevel, som AR positive, PSA-produserende cellelinjer med en aktivert PI3K /AKT sti, de ligner en vanlig CpRC fenotype støtt [43]. Videre er våre ENZ-resistente modeller demonstrere flere fenotyper i overensstemmelse med klinisk ENZ-resistent sykdom, for eksempel vedvarende AR nukleære lokaliserings, AR F876L mutasjon, og oppregulering av steroiodogenic enzymer [26, 32, 44]. 22RV1 celler båtplass androgen spleisevarianter, som spår en dårligere respons på AR-pathway hemmere [45]. Nærværet av enzalutamide-agonistiske F876L mutasjon og tilstedeværelsen av dominerende AR spleisevarianter begrenset vår evne til å teste effekten av kombinert AKT og MEK-hemning sammen med AR-inhibering i prostatakreft modeller. Videre, mens våre in vitro-studier ikke ble utført i androgen mangelfulle media, er det uklart om dette vil resultere i betydelig forskjellige resultater, særlig når CRPC svulster kan produsere sine egne androgener gjennom
de novo
synteseveier [46] . Følgelig våre resultater i kastrat forhold
in vivo
var ikke vesentlig forskjellig.
I konklusjonen, våre resultater i ENZ-resistente CRPC cellemodeller tyder på at kombinasjonsbehandling med AKT og MEK hemming kan være en rasjonell kombinasjon i en undergruppe av resistent prostatakreft tilfeller som trenger videre undersøkelser. Våre resultater tyder også viktigheten av å målrette inhibitorer mot tumor veier som er kjent for å bli aktivert; i godt valgt pasienter monoterapi kan være like effektivt som kombinasjonsbehandling. Overall, understreker dette behovet for rasjonell, biomarkør-drevet utvalg av pasienter som målrettede behandlingsformer er vurdert i kliniske studier.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. MR49C celler som er resistente mot ENZ.
5×10
4cells ble sådd ut i 12-brønners plater, og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ENZ (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 uM). Etter 72 timers eksponering, kultur medium endret frisk media alene (Gjenopprett) eller med ENZ (fortsett). 48 timer senere ble celleviabilitet analysert med krystallfiolett analysen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152861.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. Effekten av kombinasjonen AKT pluss MEK-hemning med alternative hemmere på cellesignalisering. Product: (A) MR49C og MR49F cellelinjer ble behandlet med LY294006 20 uM, 10 uM UO126, eller en kombinasjon i 48 timer.
