Abstract
Bakgrunn
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er overuttrykt i 80% av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og er assosiert med dårlig overlevelse. I de senere årene har EGFR-målrettet hemmere blitt testet i klinikken for NSCLC. Til tross for fremveksten av nye behandlingsformer og deres anvendelse i kreftbehandling, den totale overlevelsen av lungekreftpasienter fortsatt 15%. For å utvikle mer effektive behandlinger for lungekreft vi har kombinert den anti-EGFR-antistoff (Klon 225) som en molekylær terapeutisk med hybrid Plasmonic magnetiske nanopartikler (NP) og testet på ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler.
metodikk /hovedfunnene
Celleviabilitet ble bestemt ved trypan-blå analysen. Cellulært protein-ekspresjon ble bestemt ved Western blotting. C225-NPs ble påvist ved elektronmikroskopi og konfokalmikroskopi, og EGFR uttrykk ved hjelp immunocytochemistry. C225-NP viste en sterk og selektiv antitumoreffekt på EGFR-uttrykkende NSCLC-celler ved inhibering av EGFR-mediert signaltransduksjon og indusert autophagy og apoptose i tumorceller. Optiske bilder viste spesifisitet av interaksjoner mellom C225-NP og EGFR-uttrykke NSCLC celler. Ingen binding av C225-NP ble observert for EGFR-null NSCLC-celler. C225-NP oppviste høyere effektivitet i induksjon av celledreping i sammenligning med den samme mengde fritt C225-antistoff i tumorceller med ulike nivåer av EGFR-ekspresjon. Videre, i motsetning til C225-NP, fri C225-antistoff induserte ikke autophagy i celler. Men den terapeutiske effekt av C225-NP gradvis nærmet seg nivået av frie antistoffer som mengden av C225-antistoff konjugert per nanopartikkel ble redusert. Til slutt fester C225 til NP var viktig for å produsere den forbedrede tumor celledreping som tillegg av blanding av gratis C225 og NP viste ikke samme grad av celledreping aktivitet.
Konklusjon /Betydning
Vi demonstrerte for første gang den molekylære mekanisme av C225-NP induserte cytotoksiske effekter hos lungekreftceller som ikke er karakteristisk for frie molekylære terapeutika og dermed øke effekt av terapi mot NSCLC
relasjon:. Yokoyama T, Tam J, Kuroda S, Scott AW, Aaron J, Larson T, et al. (2011) EGFR-målrettet Hybrid Plasmonic Magnetiske Nanopartikler synergi Frem Autophagy og apoptose i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 6 (11): e25507. doi: 10,1371 /journal.pone.0025507
Redaktør: Sujit Basu, Ohio State University, USA
mottatt: 09.08.2011; Godkjent: 05.09.2011; Publisert: 07.11.2011
Copyright: © 2011 Yokoyama et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av National Cancer Institute gir R01CA103830, RO3EB009182, P50CA070907 (SPORE i Lung Cancer), CA16672, og The Joans Legacy: United mot lungekreft. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er overuttrykt i 80% av NSCLC og er assosiert med dårlig overlevelse [1]. I de senere årene har EGFR-målrettet hemmere blitt testet i klinikken for NSCLC [2] – [6]. Imidlertid har de nye molekylære therapeutics produsert beskjedne økninger i pasientens overlevelse enn overlevelse av pasientene som fikk standard ikke-målrettede behandlinger. Som et resultat av den totale overlevelsen av lungekreftpasienter forblir mindre enn 16% [7]. Dermed er det fortsatt stimulans til å utvikle og teste nye behandlingsformer. Vår tilnærming til å overvinne begrensninger i dagens behandlingsformer har vært å kombinere molekylær legemiddelselskap med nye feltet av nanoteknologi og test mot lungekreft.
Det har vært overbevisende måte vist at nanoteknologi kan gi unike løsninger for å revolusjonere diagnostikk og behandling av mange ødeleggende sykdommer som kreft [1], [8] – [11]. Ett bestemt område av stor interesse er utviklingen av nanopartikler for molekylær bestemt avbildning, terapi og kombinert bildebehandling /terapi [12] – [13]. Multiplexing forskjellige typer nanopartikler (NPS) og målsøkende molekyler gir en felles plattform for flere bildebehandlingsprogrammer med en høy grad av fleksibilitet [14] – [15]. Selv om bildebehandling og fototermiske behandling med Plasmonic og hybrid Plasmonic NPs har blitt ganske grundig studert, er de molekylære mekanismene for NP interaksjoner med levende celler ikke fullt ut forstått. Nylig ble det demonstrert at NPS reagere med celler i et størrelse-avhengig måte med 40-50 nm NPS som oppviser den største cellulært opptak [16]. Men i denne studien de molekylære signal effekter etter NPs opptaket ble ikke undersøkt.
I denne studien vi kombinert anti-EGFR-antistoff (Klon 225) som en molekylær terapeutisk med hybrid Plasmonic magnetiske NPs og studerte molekylær interaksjoner mellom EGFR-målrettet NP (225-NP) i størrelsesområdet 40-50 nm og human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler. Den 225-NP består av et paramagnetisk jernkjerne som er omgitt av et gullag og er funksjonalisert med monoklonale anti-EGFR-antistoffer (Klon 225). Vi brukte humane lungekreftceller med forskjellige nivåer av EGFR-ekspresjon og forandret overflate sammensetningen av NP for å belyse mekanismer for disse interaksjonene. Vårt første mål var å bruke C225-NP som et avbildningsmiddel rettet mot EGFR overekspresjon lungekreftceller. Uventet, fant vi at C225-NP ble selektivt cytotoksisk for EGFR-overekspresjon lungekreft celler utover hva som forventes fra ukonjugert antistoff. Våre resultater gir en ny retning mot å øke styrken på molekylære spesifikke legemiddel gjennom deres tredimensjonale arrangement på nanoskala ved hjelp av NPs som maler.
Diskusjon
Resultater og
225-NP-behandling regulerer EFGR- signalveien og drepe lunge kreftceller mer effektivt enn normale celler
Først undersøkte vi EGFR (fosforylert og totalt) uttrykk i flere humane NSCLC-cellelinjer som er villtype (H1229), mutert og overuttrykt (HCC827, H1975 , H3255), forsterket (H1819), eller null (H520) for EGFR og sammenlignet med EGFR uttrykk i normale lunge fibroblaster (MRC-9 og WI38) og normale menneskelige bronkiale epitelceller (NHBE) ved Western blotting. Både total og fosforylert EGFR (pEGFR) ekspresjon ble påvist i alle cellelinjene som ble testet med unntak av H520-celler som er null for EGFR. Men varierte de pEGFR uttrykk nivåer blant cellelinjer med høy uttrykk påvist i HCC827, H1819 og H3255 celler (Figur 1a). H1299 cellene hadde en middels uttrykk nivå pEGFR. I motsetning til normale celler (NHBE, MRC-9, og WI38) og H1975-celler uttrykte lave nivåer av pEGFR. Behandling med C225-NP signifikant (P = 0,05) redusert levedyktighet av EGFR positiv HCC827, H1299 og H1819 kreftceller sammenlignet med behandling med kontroll IgG-NP (fig 1b.). De C225-NP-medierte hemmende effekter imidlertid varieres mellom kreft cellelinjer som er testet og var uavhengig av EGFR mutasjonsstatus. Det er ingen hemmende effekter ble observert i C225-NP-behandlede H520-celler sammenlignet med IgG-NP-behandlede celler. Blant de normale celler, MRC-9, men ikke NHBE celler viste noen hemmende effekt når de ble behandlet med C225-NP og sammenlignet med IgG-NP behandling (Figur 1b). Imidlertid inhiberende virkninger er observert i C225-NP-behandlede MRC-9 (9%) celler var mindre enn de inhiberende effektene som observeres i C225-NP-behandlede tumorceller (14-18%).
(a ) uttrykk for fosforylert og total EGFR i normale og NSCLC celler. (B) Cell drap i respons til EGFR-målrettede C225-NP på NSCLC og normale celler. Resultatene som vises er gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. * P-verdi. 0,05 vs IgG-NP på H1299, HCC827, og H1819 celler
Deretter vurderes vi protein uttrykk fosforylert EGFR og EGFR-assosiert signalmolekyler i tumor og normale celler etter behandling med IgG- eller C225-NP. Redusert ekspresjon av fosforylert-EGFR, -AKT, -p38MAPK, og P44 /42MAPK etter C225-NP behandling ble observert i HCC827 og H1299-celler sammenlignet med celler behandlet med kontroll IgG-NP (figur 2). I H520-celler forble uttrykk for alle disse proteinene uendret når de ble behandlet med 225-NP og sammenlignet med celler behandlet med IgG-NP (figur 2). Immunhistokjemisk analyse viste pEGFR ekspresjon ble betydelig redusert (35%;
P
0,05) i HCC827 cellene ved 30 og 60 minutter etter behandling med C225-NP sammenlignet med pEGFR ekspresjon i IgG-NP-behandlede celler (8 -12%, fig S1). I normale (MRC-9 og NHBE) celler, var det ingen markert reduksjon i pEGFR eller assosierte proteiner analysert fra IgG-NP- og C225-NP-behandling (figur 2).
Inhibitoriske effekter av C225- NP på fosforylert EGFR og nedstrømssignalmolekyler i human lungekreft og normale celler. C225-NP behandling reduserte ekspresjonen av fosforylerte (p) former av EGFR, AKT, p38 MAPK, og P44 /42 MAPK i EGFR-positive tumorceller, men ikke i normale celler. Det var ingen effekt på EGFR-null H520 tumorceller.
225-NP-behandling gir større antitumor aktivitet enn C225 og NP behandling alene
Deretter fant vi ut at bidraget fra enkeltkomponenter som utgjør C225-NP på de observerte veksthemmende virkninger i tumorceller. HCC827 tumorceller behandlet med AuFe alene, og gratis C225-antistoff alene redusert celle levedyktighet med 12-14% sammenlignet med ubehandlede kontrollceller mens kombinasjonsbehandling med gratis C225-antistoff pluss AuFe redusert antall celler med 22% (figur 3a). Forbløffende nok C225-NP sterkt redusert mobilnummeret (48%; P 0,05) som var markert høyere enn hemmende effekt produseres av enkelte ingrediens (225 antistoff, AuFe) indikerer konjugering av C225 antistoffer mot NP forbedrer anticancer aktivitet C225- NPs. For ytterligere å validere våre funn vi sammenlignet de hemmende effekter av C225 antistoff med Clone 29,1 antistoff. Begge Clone 225 og Clone 29,1 antistoffer bindes til EGFR. Imidlertid klone 29.1 motsetning Klon 225 binder seg til en karbohydrat-rester på den ytre delen av EGFR og hemmer ikke EGF-mediert EGFR-signalisering [17]. Behandling av HCC827 celler med C225-NP produserte den største hemmende effekt (~42%; P 0,05, figur 3b) som var signifikant høyere sammenlignet med den inhiberende effekt produsert av klon 29.1-NP (~14%) og andre kontrollbehandlinger (~ 7% -15%). Disse resultatene viser konjugering av Clone 225 antistoffer mot AuFe NP overfører en unik eiendom som forbedrer antitumor aktivitet mot EGFR positive kreftceller. I likhet med våre funn, konjugering av anti-ErbB2-antistoff til krum gull NP vist økte dreping av brystkreftceller, sammenlignet med anti-ErbB2-antistoff og NP alene [18]. I denne studien var cytotoksisiteten ble undersøkt som en funksjon av NP størrelse. Imidlertid gjorde studien ikke ta den molekylære mekanismen for økt tumorcelledreping. Betydningen av overflatetetthet av antistoffer som er knyttet til nanopartiklene ble ikke analysert.
(a) HCC827 celler behandlet med C225-NP viste signifikant tumordrepende effekt sammenlignet med behandling med AuFe, 225-antistoff og AuFe pluss C225-antistoff. * P-verdi er 0,05. (B) Sammenligning av de hemmende effekter produsert av 29,1-NP med C225-NP på HCC827 celler. C225-NP behandling produsert en større drepende effekt enn gjorde 29,1-NP behandling sammenlignet med andre behandlingsgruppene. * P-verdi er. 0,05
225-NP-behandling induserer autofagi og apoptose i EGFR-positive tumorceller, men ikke i EGFR-negative tumorceller
Her for å bestemme molekylære mekanismen av C225-NP-mediert tumorvekstinhibitering vi utførte flowcytometrisk analyse på C225-NP-behandlet HCC827 og -H520 celler. Som vist i figur 4a, sub-populasjon G1, som angir prosentandelen av apoptotiske celler, økte på en doseavhengig måte etter behandling med C225-NP (9% -20%) på HCC827 celler sammenlignet med kontroll IgG-NP- behandlede celler (4% -8%). C225-NP behandling markert øket antall celler i sub-G1 populasjonen enn gjorde behandling med klon 225-antistoff alene ved ekvimolar konsentrasjon (figur S2). Som forventet, var det ingen økning i antallet celler i sub-populasjon G1 i C225-NP-behandlede H520-celler sammenlignet med andre behandlinger (figur 4a). Dermed C225-NP effektivt indusert apoptose på EGFR-uttrykke HCC827 celler, men ikke i EGFR null H520 celler.
(a) Andel av NSCLC celler behandlet med ulike doser (0,6, 1,2 og 2,4 × 10
10 partikler) av IgG-NP eller C225-NP for 72 timer som var i sub-G
1 fasen av cellesyklusen. Denne prosentandel ble bestemt ved DNA-flow-cytometrisk analyse. Ubehandlede celler og celler behandlet med C225-antistoff alene tjente som kontroll. En doseavhengig økning i antallet av celler i HCC827 subG1 fase ble observert i både IgG-NP og C225-NP behandlinger. Men økningen i antallet celler i subG1 var signifikant høyere i C225-NP behandling enn i IgG-NP (
* P 0,05). Det var ingen merkbar økning i subG1 fase i H520-celler mellom IgG-NP- og C225-NP-behandlinger. (B) Påvisning av GFP-LC3 prikkene indikerer autofagi på NSCLC celler som ikke ble behandlet eller behandlet med C225 antistoff, IgG-NP eller C225-NP (3 × 10
9 partikler) i 72 timer på kammer lysbilder.
Skala bar = 50 um product: (C) Kvantifisering av antall celler med GFP-LC3 prikker på ubehandlede og behandlede NSCLC-celler. Antall celler med GFP-LC3 punkter var høyere i C225-NP-behandlede HCC827-celler sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper. I H520-celler var det ingen økning i antallet av GFP-LC3 prikker når de ble behandlet med C225-NP og sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper. Resultatene som vises er gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. * P-verdi. 0,05 vs ubehandlet kontroll, C225 antistoff, og IgG-NP på HCC827 celler
Nylig har det blitt vist at kvanteprikker indusere størrelse avhengig autofagi i menneskelig stamceller [19]. Vi undersøkte derfor om autofagi forekom hos NSCLC-celler etter behandling med C225-NP. Den grønt fluorescerende protein (GFP) -tagged ekspresjonsvektor fra LC3 er et nyttig verktøy for å detektere autofagi [20]. På fluoriserende mikroskopi, GFP-LC3-transfekterte HCC827 celler viste diffus fordeling av GFP-LC3 for ubehandlede celler og celler behandlet med klon 225-antistoff alene og sammen med IgG-NP, mens cellene som ble behandlet med C225-NP viste GFP-LC3 punctate prikker indikerer autophagic vakuoler (figur 4b). Prosentandelen av celler med GFP-LC3 punctate prikker øket etter behandling med C225-NP for HCC827 celler (figur 4c; P 0,05). Induksjon av autofagi bestemmes av GFP-LC-3 prikker ble også markert økt i C225-NP-behandlede H1299 celler sammenlignet med andre behandlingsgruppene (Figur S3). I motsetning til dette er mengden av GFP-LC3 punctate prikker var ikke forskjellig i C225-NP behandlede H520-celler og kontrollgrupper (Figur 4b, c).
ved siden undersøkte celler behandlet med C225-NP for nærvær og timing av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spalting og LC3 uttrykk, som er molekylære markører er indikative for celler som gjennomgår apoptose og autophagy respektivt. PARP cleavage var tydelig i 24 timer etter behandling med IgG-NP og C225-NP av HCC827, men ikke H520 celler; men PARP cleavage var høyere med C225-NP enn med kontroll-NP i HCC827 celler (figur 5a). Den LC3 protein eksisterer i to celledelte former, LC3-I og LC3-II. LC3-I omdannes til LC3-II ved konjugering til fosfatidyletanolamin, og mengden av LC3-II er nært korrelert med antallet autophagosomes [21]. I HCC827 celler, behandling med C225-NP sterkt øket mengden av LC3-II på en tidsavhengig måte (figur 5a). Dessuten tyder nyere bevis at oppbyggingen av LC3-II er mer nøyaktig representert i autophagic fluks i nærvær av lysosomale inhibitorer [22]. I nærvær av proteaseinhibitorer E-64-D og pepstatin A, øket endogen LC3-II etter behandling med IgG-NP og C225-NP i HCC827 celler (figur 5b). Men økningen i LC3-II var større i celler behandlet med C225-NP enn IgG-NP. Økning i LC3-II i nærvær av proteaseinhibitorer ble også observert i C225-NP-behandlede H1299-celler (data ikke vist). I motsetning til dette, ble mengden av LC3-II ikke økt i H520-celler i løpet av 72 timer behandling med C225-NP sammenlignet med behandling med IgG-NP (figur 5a). Disse resultatene indikerte at C225-NP forårsaket både apoptose og autofagi samtidig i EGFR-uttrykt NSCLC-celler. Overraskende nok autophagy ble også observert i IgG-NP-behandlede celler riktignok mindre enn den som ble observert i C225-NP-behandlede celler og hadde mindre effekt på tumorcelledreping. Vi hypotese at den autophagy terskelen i C225-NP-behandlede celler er sterkere på grunn av tilstedeværelsen av anti-EGFR-antistoffer og fungerer som en død aktivator som fører til aktivering av kaspase kaskade og apoptotisk celledød. I motsetning til dette autophagy i IgG-NP-behandlede celler tjener sannsynligvis som et signal overlevelse og beskyttelse mot celledød. Andre forskjeller kan eksistere, og vi undersøker mekanismen i laboratoriet.
(a) Cellular proteiner ble lysert ved den angitte tiden etter behandling med IgG-NP partikler eller C225-NP (0,6 × 10
10 partikler) og underkastet Western blotting. I HCC827 men ikke i H520-celler, økt PARP-spaltning og LC3-II ble observert ved 48 timer og 72 timer etter behandling med C225-NP, og når sammenlignet med IgG-NP behandling og ubehandlet kontroll. Styrken på mengden av LC3-II bånd ble semi-kvantifisert ved ImageJ programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD) (b) HCC827 celler ble behandlet med IgG-NP eller C225-NP for 68 timer ble cellene videre dyrket med eller uten proteasehemmere [10 mikrogram /ml E-64-d og 10 mikrogram /ml pepstatin A (BIOMOL International LP, Plymouth Meeting, PA)] for 4 timer. Cellulære proteiner ble lysert og immunoblottet med anti-LC3 antistoff. LC3-II-proteinnivåer ble økt i nærvær av proteaseinhibitorer i alle gruppene som indikerer forekomsten av autophagy. Styrken på mengden av LC3-II bånd ble semi-kvantifisert ved ImageJ programvare (National Institutes of Health).
For å analysere sammenhengen mellom C225-NP og autofagi, vi bestemt lokalisering av C225 np og autophagic vakuoler, ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM). HCC827 celler behandlet med Clone 225 antistoff eller IgG-NP utstilt svært få autophagic funksjoner, mens mange autophagic vakuoler ble observert etter behandling med C225-NP (Figur 6;
P
0,05). Interessant, mens det meste av C225-NPs ble observert inne autophagic og tomme vakuoler, noen NPs ble også observert inne i kjerner. I likhet med TEM analyse, konfokalmikroskopi også avdekket noen NPs inne kjerner i C225-NP-behandlede celler (figur 7). Selv om vi kunne påvise nærvær av NPS i kjernen av cellene om vi ikke kvantifisere antallet av NPS er tilstede inne i kjernen av cellen. Dette er på grunn av noen av de begrensningene som finnes med TEM og konfokalmikroskopi teknikker. For eksempel vil kvantifisering av prosentandelen av nukleære lokaliserings krever analyser av flere celler gjennom totalt cellulært volum som er upraktisk å bruke en slik høy oppløsning teknikk som TEM. Tredimensjonal lokalisering av NPS med konfokal mikroskopi er komplisert ved det faktum at etter cellulært opptak NPS akkumuleres i perinukleære plass. Derfor er optisk oppløsning ikke er tilstrekkelig til å skille NPS som er plassert i umiddelbar nærhet av den nukleære membran på den cytoplasmiske og på de nukleære sidene. I tillegg kan konfokal mikroskopi fra meget skarpe gjenstander som for eksempel NPS resultere i en sterkt ute av fokus signal som kan føre til feiltolkning av tredimensjonale fordeling av nanopartikler. Begrensningene for tredimensjonal lokalisering av NPs bruker konfokal optisk mikroskopi har nylig blitt demonstrert i [23] hvor konfokalmikroskopi grovt overvurdert cytosolic opptak av kvanteprikker.
Electron photomicrographs viser ultrastructure av en celle, inkludert kjerne (N), av HCC827 celler behandlet med C225-antistoff (0,065 ug /ml), IgG-NP eller C225-NP (0,6 x 10
10 partikler) i 72 timer. (I) Ubehandlede celler (ii) C225 antistoff-behandlede celler (iii) IgG-NP-behandlede celler (iv) C225-NP-behandlede celler (v) En forstørret bilde av området eske i (iv). Pilen viser NP, og pilen indikerer autophagosomes som inkluderer restmateriale og NP i cytoplasma (vi) C225-NP oppdaget inne i kjernen. Pilen angir NP i kjernen.
Scale bar = 1 mikrometer. Product: (vii) autophagosomes ble kvantifisert som beskrevet i materialer og metoder. * P-verdi. 0,05 vs kontroll, C225 antistoff og IgG-NP for 48 og 72 timer
(Top rad) Confocal bildene viser DAPI farget kjerner (blå) og C225-NP (rød ). Piler i «midten» -kolonnen punkt til C225-NP lokalisert i en kjerne. Piler i kolonnene merket «topp» og «bunn» peker til det samme område i xy-planet til kjernen men på steder over og under midten av kjernen, henholdsvis. I både «topp» og «bunn» bilder, pilene er ikke lenger peker mot røde flekker som tyder på at de røde flekker i «midten» image er faktisk i kjernen. (Nederste linje) tegneserie indikerer z-posisjonen til hvert bilde i kjernen, hvor den røde horisontale linje representerer den relative dybdeposisjon i kjernen at tverrsnittsbilder (øverste rad) ble tatt på.
Scale bar = 10 mikrometer
.
I fremtidige studier vi har tenkt å kvantifisere andelen av NPs stede i kjernen av tredimensjonale røntgen tomographic avbildning av hele celler med tilstrekkelig prøvetaking størrelse og oppløsning [24] og bestemme bidraget av atom NPs i cellesignale hendelser.
C225-NP er spesifikk for EGFR-uttrykke tumorceller og forbehandling med C225 antistoff opphever C225-NP-mediert tumorcelledreping
Vi brukte mørk-feltet refleksjon mikroskopi for å karakter spesifisitet av C225-NP interaksjoner og gjennomførbarheten av optisk deteksjon av lungekreft celler. Mørke-felt refleksjonsbilder viste høy konsentrasjon og internalisering av C225-NP i HCC827 celler etter 24 timers behandling (figur 8). I motsetning til dette, lite til ingen opptak ble observert i HCC827 celler behandlet med IgG-NP. I H520-celler, ingen forskjell i NP-binding og opptak ble observert mellom celler behandlet med C225-NP og IgG-NP (figur 8).
HCC827 og H520-celler sådd på kammers objektglass ble behandlet med IgG-NP eller C225- NP (0,2 × 10
10 partikler). Ubehandlede celler tjente som kontroll. Ved 24 timer etter behandling ble cellene vasket, fiksert og bilder ble tatt under mørke-felt mikroskopi. Scale bar er 50 mikron. Selektiv binding og opptak av C225-NP, men ikke IgG-NP ble observert i HCC827 celler. I H520 celler var det ingen binding og opptak av C225-NP sammenlignet med IgG-NP.
For å bestemme spesifisiteten av C225-NP binding og opptak, ble blokkerer eksperimenter utført. HCC827 celler ble forbehandlet med et overskudd av fritt 225 Klone antistoff før behandlingen med IgG-NP eller C225-NP. Mørke-felt refleksjonsbilder viste at binding og internalisering av C225-NP ble spesifikt blokkert i nærvær av fri klon 225-antistoff, sammenlignet med celler som ikke var forbehandlet med antistoffet (figur 9a). Vi videre stilling til om blokkering av EGF reseptor påvirker C225-NP-indusert cytotoksisitet. Demping av cytotoksisitet mediert av C225-NP ble observert i nærvær av fri Klon 225 antistoff som ble ledsaget av markert reduksjon i C225-NP-mediert apoptose og autofagi (figur 9b, 9c). Lignende resultater ble også oppnådd når H1299-celler ble behandlet med C225-NP i nærvær av klon 225-antistoff (figur S4 a-c). Samlet utgjør disse resultatene viste at C225-NP samhandler selektivt med EGFR-uttrykke NSCLC celler, og produserer molekylær spesifikk økt terapeutisk effekt på EGFR-uttrykke NSCLC celler.
(a) Den høyre kolonnen viser bilder av HCC827 celler forbehandlet med C225-antistoff (2 ug /ml) i 15 minutter før inkubasjon med enten IgG-NP (midterste rad) eller C225-NP (nederste rad). Celler som er vist i den venstre kolonnen ble ikke behandlet med gratis C225 antistoffer. Platene ble vasket, fikset og avbildes med mørke felt mikroskopi. Binding og opptak av C225-NP ble fullstendig inhibert i nærvær av C225-antistoff. I IgG-NP-behandlede celler C225-antistoff hadde ingen effekt. Scale bar er 50 mikron. (B) Inhibering effekt på cytotoksisiteten til C225-NP ved forbehandling med fri C225-antistoff. Etter behandling med /uten C225-antistoff (0,065 ug /ml) i 6 timer ble cellene behandlet med enten ikke-konjugert NP (gull-jern: AuFe), IgG-NP eller C225-NP for ytterligere 66 timer. Antall levedyktige celler ble tellet som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene som vises er gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. * P-verdi 0,05 vs AuFe alene, C225 antistoff alene, IgG-NP eller C225 antistoff pluss C225-NP. (C) Inhibering virkninger på C225-NP-indusert apoptose og autofagi etter forbehandling med C225-antistoff. Cellulære proteiner ble lysert etter behandling med C225-NP (0,6 x 10
10 partikler) i 66 timer i nærvær eller fravær av fritt C225-antistoff (0,065 ug /ml). Proteiner ble separert ved 7,5% eller 15% SDS-PAGE, og immunoblottet med anti-PARP og anti-LC3 antistoffer. Den anti-β-aktin-antistoff ble anvendt som en kontroll for protein lasting og transport. Styrken på mengden av LC3-II bånd ble kvantifisert ved ImageJ programvare (National Institutes of Health). C225-NP-mediert aktivering av apoptose og autophagy som angitt ved spalting av Capase-3, PARP og LC3-II henholdsvis ble markert opphevet i nærvær av fri C225-antistoff. Alle mørk-feltet bilder ble anskaffet ved hjelp Leica, DM6000 mikroskop utstyrt med 20 × mørke-feltet objektiv og Xe-lampe hvitt lys belysning.
Tetthet av 225 antistoff festet til NP er viktig for 225-NP -mediert tumor celledrepende
for å undersøke avhengighet av terapeutisk effekt av NPs på tettheten av Clone 225 antistoffer på NP overflaten vi co-konjugert Clone 225 og ikke-spesifikt IgG antistoff i forhold på 01:00, 01:01, 01:03, 01:10, 01:40 og 00:01. Den gjennomsnittlige totale mengde av antistoff pr NP ble holdt det samme, og derfor tettheten av klon 225-antistoffer gradvis reduseres etter hvert som den relative mengde av det ikke-spesifikke IgG økt. For eksempel er forholdet 1:00 tilsvarte de opprinnelige C225-NP konjugater som hadde den høyeste tettheten av klon 225-antistoffer mens forholdet 00:01 tilsvarte NPS med bare ikke-spesifikke IgG-antistoffer. Den relative tettheten av antistoffer på overflaten av NPs ble bekreftet ved hjelp av et fluorescerende analyse (se materialer og metoder).
Behandling med C225-NPs (1:00 ratio) signifikant (
P
. 1 :1, 01:03, 01:10, 01:40, 00:01) av C225 og IgG co-konjugert til NP overflaten. Celler (HCC827, H1299 og H520) ble behandlet med NPs (0,6 × 10
10 partikler) i 72 timer. Antall levedyktige celler ble tellet som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene som vises er gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. * P-verdi 0,05 for C225-NP (01:00) vs NP med 1:01 til 01:40 og 00:01 NP på HCC827 og H1299 celler. H520 celler viste ingen hemmende effekt ved behandling med NP er av forskjellige forhold. (B) Antallet av GFP-LC3 prikker indusert av C225-NP (01:00) -rensing på HCC827 og H1299-celler ble redusert med endringer i C225:IgG antistoff-forhold. Resultatene som vises er gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. * P-verdi 0,05 for C225-NP (01:00) vs 01:01 til 01:40 og 00:01 NP på HCC827 og H1299 celler. (C) C225-NP (01:00) -mediert reduksjon i fosforylert EGFR og P44 /42MAPK uttrykk ble opphevet i HCC827 og H1299 celler ved behandling med NP er av 1:01 og 1:40 ratio.
Disse resultater viser at NPS produserte den største terapeutiske virkning når de ble belagt bare med C225-antistoff. Skifte antall C225-antistoff med ikke-spesifikt kontrollantistoff på overflaten av NP resulterte i redusert anticancer aktivitet. I tillegg viser denne studien også spesifisiteten av 225-NP-mediert tumorcelledreping.
I konklusjonen, vi demonstrert at EGFR-målrettet C225-NPs selektivt tas opp av EGFR-uttrykke NSCLC celler og produsert forbedret antitumor aktivitet ved å indusere både apoptose og autofagi. Den forbedrede tumor celledreping aktivitet produsert av C225-NP er knyttet til unike egenskaper er tillagt ved konjugering av Clone 225 antistoff med AuFe NP. Så vidt vi vet har vi demonstrert for første gang at konjugering av Plasmonic nanomaterialer med biologiske som Clone 225 resulterer i synergisantitumor egenskaper ledsaget av induksjon av autofagi og apoptose.
