Abstract
Vi har tidligere rapportert et anti teknologi, «snoMEN vektorer», for målrettet knock-down av proteinkodende mRNA med humane snoRNAs manipulert til å inneholde korte regioner i sekvensen komplementaritet med mRNA målet. Her karakteriserer vi bruk av snoMEN vektorer å målrette knock-down av mikro RNA primære transkripsjoner. Vi dokumenterer den spesifikke knock-down av miR21 i HeLa celler ved hjelp av plasmid vektorer som uttrykker miR21 målrettede snoMEN RNA og vis denne induserer apoptose. Knock-down er avhengig av tilstedeværelsen av komplementære sekvenser i snoMEN vektoren og induksjon av apoptose kan undertrykkes ved over-ekspresjon av miR21. Videre har vi også utviklet lentiviral vektorer for levering av snoMEN RNA og vis denne øker effektiviteten av vektor transduksjon i mange humane cellelinjer som er vanskelige å transfektere med plasmidvektorer. Transduksjon av lentivirale vektorer som uttrykker snoMEN rettet til PRI-miR21 induserer apoptose i humane lunge adenokarsinom-celler, som uttrykker høye nivåer av miR21, men ikke i humane primære celler. Vi viser at snoMEN-mediert undertrykkelse av miRNA ekspresjon forhindres ved siRNA knock-down av Ago2, men ikke ved knock-down av Ago1 eller Upf1. snoMEN RNA colocalise med Ago2 i cellekjerner og nucleoli og kan være co-immunopresipitert fra atom ekstrakter av antistoffer som er spesifikke for Ago2
Citation. Ono M, Yamada K, Avolio F, Afzal V, Bensaddek D, Lamond AI (2015) Målrettet Knock-Down av miR21 Primære transkripsjoner Bruke snoMEN vektorer induserer apoptose i human Cancer Cell Lines. PLoS ONE 10 (9): e0138668. doi: 10,1371 /journal.pone.0138668
Redaktør: Christophe Antoniewski, CNRS UMR7622 Universitetet Paris 6 Pierre-et-Marie-Curie, FRANCE
mottatt: 24 juni 2015; Godkjent: 02.09.2015; Publisert: 25.09.2015
Copyright: © 2015 Ono et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Midler til denne forskningen ble levert av en Wellcome Trust Programme Grant til AIL (Ref: 073980 /Z /03 /Z) (https://www.wellcome.ac.uk/) og av en MRC Milstein Award til A.I.L. (Ref: G0801738) (https://www.mrc.ac.uk/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
snoMEN (snoRNA modulator av genekspresjon) vektorer gir en form for antisense-teknologi for å modulere uttrykket av målgener basert på komplementær baseparring interaksjoner, analogt til de mer kjente siRNA /shRNA vektorsystemer [1]. Den snoMEN vektor teknologien er skapt av manipulering av menneskelige boks C /D liten nukleolært RNA (snoRNA) HBII-180C. Denne klassen av snoRNAs inneholde en intern sekvens (M boks) som kan endres for å gjøre den komplementære med RNA-mål. snoRNAs er en familie av konserverte nukleære RNA konsentrert i nucleoli hvor de enten funksjon i modifiseringen av ribosomalt RNA (rRNA), eller deltar i behandling av rRNA under ribosom-underenheten syntese [2-5]. Box C /D snoRNAs er oppkalt etter en felles RNA motiv i denne underfamilien som fungerer som et bindingssete for en gruppe på boks C /D-proteiner, inkludert NOP56, NOP58, 15.5K og svært konservert protein fibrillarin, som har bestemt 2 «-O-metylase aktivitet. De fleste snoRNAs er kodet innen intronsekvenser, enten plassert i primær transkripsjoner av proteinkodende gener, eller i egne transkripsjoner inneholder tandem matriser av flere snoRNAs. Endogene snoRNAs er svært rikelig kjernefysiske RNA som er effektivt behandlet fra primær transkripsjoner. Dermed er behandling og levering av snoMEN RNA tilsvarende effektiv og ikke utsatt for metning av vertscellen behandling maskineri når snoMEN uttrykkes fra eksogene vektorer.
I tidligere studier ble det vist at snoMEN vektorer kan redusere protein uttrykk nivåer ved å slå ned ekspresjonen av atom pre-mRNA, slik målretting av komplementære sekvenser i intron og /eller ikke-kodende 5 «og 3» flankerende sekvenser i mRNA-forløpere (pre-mRNA) [6]. Dette øker effektivt omfanget av sekvenser i mål RNA som kan utforskes for å oppnå genspesifikke hemmende effekter. I likhet med endogene snoRNAs, blir snoMEN RNA effektivt transkribert fra RNA-polymerase II-promotorer, snarere enn fra det RNA-polymerase III-promotorer som brukes for shRNA plasmider [7]. Som snoMEN RNA kodes innenfor introner, er det forholdsvis lett å lage vektorer som kan uttrykke flere snoMEN innenfor forskjellige introner fra et enkelt transkript, som også koder for et protein reporter. Dette letter etableringen av enten forbigående eller stabile, genet knock-ins, oppnådd ved hjelp av en enkel avskrift, drevet fra en enkelt promoter. Denne tilnærming ved hjelp av snoMEN vektorer har således vært anvendt til å etablere menneskelig «proteinerstatnings «stabile cellelinjer, hvor ekspresjon av en målrettet protein er redusert ved snoMEN RNA og effektivt erstattet av ekspresjon av et rekombinant protein som kodes for av det samme transkriptet som brukes til å levere snoMEN [6].
kreft og andre proliferative sykdommer (slik som auto-immune sykdommer og inflammasjon) er ofte forbundet med unormal apoptose eller celledød. I kreftceller, for eksempel, de mekanismer som vanligvis er avbrutt som induserer programmert celledød etter enten alvorlig DNA-skade og /eller defekter i normal cellesyklusprogresjon, og dermed slik at kreftcellene for å unngå apoptose. En mulig tilnærming til cancerterapi er således å utløse apoptose ved å finne en måte for å overvinne de mekanismer som blokkerer endogene signalveier som ellers ville føre til død av kreftceller. Det er nå antatt at en av de bidragende mekanismer slik at mange former for kreftceller til å undertrykke aktivering av celledødsveier er formidlet ved overekspresjon av spesifikke microRNAs, slik som miR21 [8].
miR21 var en av de første mirnas detektert i det humane genom, og viser sterk evolusjonær konservering over et bredt spekter av arter virveldyr, inkludert pattedyr, fugler og fisk subtypene [9]. RNA ekspresjonsprofiler, detektert ved hjelp av high-throughput transkriptomet profileringsfremgangsmåter, som sammenligner mirnas i tumorer og andre cellelinjer som er forbundet med kreft med de til normale celler /vev, påfallende antyder at miR21 er over til uttrykk i det store flertall av krefttyper analysert [8 ]. Mer nylig, antisense-studier som målretter modne miR21 foreslått at blokkerings miR21 funksjon kan indusere apoptose ved å aktivere ekspresjon av programmert celledød 4 (PDCD4) protein i visse typer kreftceller, f.eks HeLa-celler og MCF-7-celler [10, 11]. Inhiberingen av miR21 ble rapportert ved bruk av syntetiske antisense-oligonukleotid-analoger, komplementære til miR21 [12, 13]. Men mens miR21 knock-down via antisense modifiserte oligonukleotider ble rapportert å arrestere tumor celleproliferasjon, både
in vitro Hotell og
in vivo
, spørsmål fortsatt i å bruke denne tilnærmingen for klinisk behandling, knyttet til den lave effektivitet av avgivelsessystemet, og til de potensielle bivirkninger av antisense oligonukleotider som fortsatt må tas opp. Bruken av siRNA /shRNA som et alternativ mekanisme for målretting inhibering av mirnas har vært foreslått som et terapeutisk, men omfatter også en potensiell risiko, slik som off-target-effekter og forstyrrelse av RNA-indusert stanse kompleks (RISC) i cellen [ ,,,0],14-17]. Likevel, flere studier har beskrevet hemme uttrykket av modne miR21 bruker siRNA /shRNA, spesielt påvirker bare 22 basen behandlet miRNA men ikke forårsaker knock-down av miR21 primære transkripsjon [18].
Micro RNA (miRNAs) omfatter en familie av korte, regulatoriske RNA, typisk 22 nukleotider i lengde, som kan poste-transcriptionally regulere genuttrykket
in vivo
. Hos pattedyr har mirnas blitt rapportert å regulere genekspresjon i hovedsak av mekanismer som hemmer translasjon av protein-kodende transkripter, sannsynligvis gjennom baseparing til spesifikke målsekvenser i mRNA 3 «ikke-translaterte regioner (UTR) [19]. I noen tilfeller mirnas blir transkribert som en uavhengig transkripsjonsenhet som ikke kode for protein. Imidlertid er mange mirnas ligger innenfor intronsekvensene protein-kodende gener. Disse intron-kodet mirnas er altså co-uttrykkes med verts proteinkodende gener [20-25]. Moden mirnas behandles av lengre pre-miRNA transkripsjoner, som vanligvis ~ 70 nukleotid lange, hårnål strukturer. Disse pre-mirnas i sin tur blir behandlet fra de opprinnelige primære gentranskriptene, ofte referert til som pri-mirnas [26].
I denne studien viser vi at snoMEN vektorer kan brukes til å knock-down miR21 etter rettet mot spesifikke sekvenser innenfor pri-miRNA transkripsjoner, noe som resulterer i apoptose av humane kreftcellelinjer. Vi undersøker faktorer som kreves for snoMEN mediert hemming av miRNA uttrykk og viser at snoMEN kan leveres i celler fra både plasmid og lentiviral vektorer.
Resultater
snoMEN målretting pri-miR21 indusere apoptose i transformerte celler
Vår hypotese er at hvis snoMEN kan være målrettet for å føre til en reduksjon i nivåene av miR21 primære transkripsjon dette kan indusere apoptose i tumorceller som overlevelse er avhengig av høye nivåer av miR21 uttrykk. Derfor, for å teste om snoMEN kan brukes til å modifisere ekspresjonen av miR21, en plasmid-vektor som uttrykker M boks modifisert snoRNAs rettet mot endogene pri-miR21 ble konstruert (figur 1 A), basert på den tidligere snoMEN utformingen [1]. Dette snoMEN vektor (mCherry-pri-miR21 snoMEN) kodet tre snoMEN, som hver målrettede ulike regioner av pri-miR21 sekvens. Disse tre snoMEN RNA hver er kodet innenfor separate introner av samme RNA pol II-transkript, som også koder for det mCherry protein som virker som en fluorescerende protein (FP) markør i transfekterte celler. Etter transfeksjon av mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmid vektor i HeLa-celler, fisk (fluorescens
in situ
hybridisering) eksperimenter, ved hjelp snoMEN-spesifikke prober, viste en steady state lokalisering mønster for snoMEN RNA som var overveiende kjernekraft, med akkumulering i nucleoli (figur 1B og andre data ikke vist). Dette mønsteret er i samsvar med tidligere snoMEN uttrykk studier [1, 6].
(a) Struktur for målrettet endogen miR21 primære transkripsjon (mCherry-pri-miR21 snoMEN) og koblingsskjema for miR21 modning veien. Denne konstruksjonen har tre snoMEN RNA (blå femkanter) som tidligere beskrevet [1], bortsett fra at her M boks sekvensene er komplementære til spesifikke sekvenser innenfor den endogene miR21 primære transkript. (B) Validering av snoMEN uttrykk ved fluorescens In Situ Hybridisering (FISH) analyse. Hver snoMEN RNA ble detektert ved anvendelse av en M boks spesifikk RNA-probe merket med Cy3 (Cy3). DNA er farget av DAPI (DAPI). Scale bar er 10 mikrometer. (C) RNA analyse. Total RNA fra HeLa-celler ble høstet 24 timer etter transfeksjon og QRT-PCR ble utført for å identifisere miR21 forløper molekyler ved hjelp miR21 forløper spesifikke primere (pre-miR21). Etter cDNA syntese, ble qPCR utført ved hjelp modnet miR21 spesifikk primer og universell primer levert av Perfecta SYBR Grønn qPCR kit (Quanta biovitenskap, se også metoder) (Forfalt-miR21). U3 ble anvendt som en kontroll lasting. Graf viser gjennomsnitt og standardavvik fra minimum 5 uavhengige eksperimenter. (D) HeLa celler transfektert med pri-miR21-snoMEN /kontroll i 24 timer før total RNA ekstraksjon og nordlige blot analyse.
Ved 24 timer etter transient transfeksjon av snoMEN plasmid mCherry-pri- miR21 inn HeLa-celler, noe som sterkt uttrykte miR21 [27], observerte vi ~ 65% og ~ 45% knock-down for pre-miR21 og modnet miR21, sammenlignet med en negativ kontroll snoMEN (control) vektor, som dømmes av både QRT-PCR (fig 1 C) og Nord-blotting analyse (figur 1D). Videre celler transfektert med den mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmid viste høye nivåer av apoptose (figur 2A pil). I kontrast, celler som er transfektert med en kontroll snoMEN plasmid (Control), som ikke er rettet mot noen av endogene gener, ikke viste tegn på apoptose (figur 2A). Multiple markører for apoptose ble testet i hvert tilfelle, inkludert en Annexin V-assay ved å bruke FACS (fluorescens-aktivert cellesortering) (figur 2B), en immunofluorescensanalyse av spaltet Caspase-3 (figur 2C), Western blot-analyse for spaltede PARP1 og spaltes Caspase-3 (figur 2D). Alle disse analysene viste opp-regulering av apoptose spesielt i celler transfektert med den mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmid. Men co-transfeksjon av plasmider miR21 shRNA-pLVX (som uttrykker pre-miR21) og mCherry-pri-miR21 snoMEN, resulterte i lite eller ingen cytotoksisitet og apoptose, sammenlignet med co-transfeksjon av celler med mCherry-pri-miR21 snoMEN og den negative kontrollen EGFP-pLVX (uttrykker EGFP protein alene) ekspresjonsplasmider (fig 3A og 3B). Disse resultatene indikerer at den apoptose forårsaket av snoMEN-mediert miR21 uttømming kan reddes ved eksogene miR21 enn uttrykk.
(a) Mikrografer som viser eksempler på apoptose-induksjon i HeLa-celler transfektert med pri-miR21-snoMEN. Bilder ble tatt 72 timer etter transfeksjon. Pilene viser cellene viser en apoptose fenotype. Scale bar er 10 mikrometer. (B) Grafen viser et tidsforløp av endringer i befolkningen i Annexin-V (apoptose markør) positive celler etter transfeksjon med enten pri-miR21-snoMEN (grønn) eller Control (rød). Celletallet ble telt ved bruk av FACS. Annexin-V signal ble oppdaget ved hjelp av Guava nexin Reagens (Guava teknologier). (C) Bildene viser lokalisering mønster av DNA (DAPI, Blå), en transfeksjon FP-markør for enten pri-miR21-snoMEN /Control (mCherry, rød) og en apoptose markør (kløyvde caspase-3, grønn). Pilspisser viser apoptose markør positive celler. Scale bar er 10 mikrometer. (D) Western blot som viser Maskin proteiner i HeLa-celler transfektert med pri-miR21-snoMEN /kontroll i 24 timer forut for proteinekstraksjon. Hele cellelysater ble analysert ved hjelp av de angitte antistoffer.
(a) Mikrografer viser redning eksperiment av apoptose induksjon av co-trans med pri-miR21-snoMEN (mCherry) og pre-miR21 uttrykk plasmid (GFP + miR21) /kontroll plasmid som uttrykker GFP protein alene (GFP). Bilder ble tatt 72 timer fulgt etter transfeksjon. Scale bar er 10 mikrometer. (B) RNA analyse. Total RNA fra HeLa-celler ble høstet 24 timer etter ko-transfeksjon med pri-miR21-snoMEN (mCherry) og pre-miR21 uttrykk plasmid (miR21) /kontroll plasmid som uttrykker GFP protein alene (GFP) og QRT-PCR ble utført for å identifisere miR21 forløper molekyler ved hjelp miR21 forløper spesifikke primere (pre-miR21, rød). Etter cDNA syntese, ble qPCR utført ved hjelp modnet miR21 spesifikk primer og universell primer levert av Perfecta SYBR Grønn qPCR kit (Quanta biovitenskap, se også metoder) (Forfalt-miR21, grønn). U3 snoRNA ble anvendt som en kontroll. Graf viser gjennomsnitt og standardavvik fra minimum 3 uavhengige eksperimenter. (C) Mikrografer viser forebygging av ikke-apoptoseinduksjon ved trans med pri-miR21-snoMEN Mut, som har 3 grunn uoverensstemmelser i hver M boks komplementær sekvens til pri-miR21. Bilder ble tatt 72 timer fulgt etter transfeksjon. Scale bar er 10 mikrometer. (D) RNA analyse. Total RNA fra HeLa-celler ble høstet 24 timer etter transfeksjon med enten pri-miR21-snoMEN mut eller Control. Etter cDNA syntese, ble qPCR utført ved hjelp modnet miR21 spesifikk primer og universell primer levert av Perfecta SYBR Grønn qPCR kit (Quanta biovitenskap, se også metoder). U3 snoRNA ble anvendt som en kontroll. Graf viser middelverdi og standardavvik fra et minimum på 4 uavhengige eksperimenter.
For å undersøke forholdet mellom sekvensen i boksen M regionen av snoMEN og den pri-miR21 target-sekvensen, en mutant versjon av mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmid (pri-miR21 snoMEN Mut), som omfattet tre uoverensstemmelser i pri-miR21 komplementær sekvens, ble gjort og analysert for å måle både knock-down nivåer og eventuelle apoptose fenotype (fig 3C og 3D). Resultatene viser at de 3 basis mismatch mutasjoner i M boksen effektivt eliminerer både apoptose fenotype og knock-down-aktivitet, kan sammenlignes med det negative kontroll snoMEN vektor (figur 3C og 3D). Vi konkluderer med at miR21 knock-down og den resulterende apoptose fenotype sett med mCherry-pri-miR21 snoMEN vektor er avhengig sekvens komplementaritet mellom M boksen regionen og målrettet regionen pri-miR21.
Vi har også konstruert og testet en annen snoMEN vektor, mCherry-pre-miR21 snoMEN, som retter seg mot miR21 forløper sekvenser (figur A i S1-fil). Transient transfeksjon av mCherry-pre-miR21 snoMEN plasmid i HeLa-celler resulterte i miR21 knock-down og induksjon av apoptose, i likhet med de resultatene som er oppnådd over med mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmid. Resultatene for mCherry-pre-miR21 snoMEN og mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmider var like med hensyn til FISH analysen, Annexin-V-analyse ved hjelp av FACS og miR21 knock-down nivåer, som analysert ved QRT-PCR, (figurene BD i S1 File). Disse resultatene indikerer at snoMEN vektorer kan faktisk målrette miRNA primære transkripsjoner, som gir mer fleksibilitet i utformingen av knock-down vektorer enn målretting bare kort (~ 22 basis), modne miRNA sekvenser.
Neste, vi testet om snoMEN vektorer kan brukes til å målrette andre mirnas, forskjellig fra miR21. Dermed ble snoMEN vektorer utformet for å målrette fire tidligere godt karakteriserte miRNA primære transkripsjoner [27-30], dvs. pri-miR31, pri-la-7g, pri-miR132 og pri-miR210, og deres knock-down aktivitet målt ved hjelp QRT -PCR etter forbigående transfeksjon inn i HeLa-celler (figur 4A). Dette viste spesifikk og reproduserbar knock-down for alle fire målrettede mirnas, sammenlignet med de negative kontroll snoMEN, bedømt ved QRT-PCR. Videre, for hvert av den målrettede mirnas i denne studien undersøkte vi spesifisiteten av miRNA knock-down av snoMEN vektorer. For å gjøre dette brukte vi QRT-PCR for å måle og sammenligne nivåene av de respektive målrettet og ikke-målrettede mikro RNA ved ekspresjon av enten en miRNA målrettet snoMEN RNA, eller den negative kontrollen snoMEN RNA (figur 4B). Dette viste for eksempel, at ekspresjon av den mCherry-pri-miR21 snoMEN forårsaket en spesifikk reduksjon i miR21 nivåer med liten eller ingen off-target effekter på nivåene av de andre fire mikro RNA ble testet. Lignende resultater ble oppnådd for hver av de snoMEN vektorer rettet mot de fire andre mirnas testet ovenfor, dvs. pri-miR31, pri-la-7g, pri-miR132 og pri-miR210.
(a) snoMEN vektorer målrettet for å ytterligere miRNAs. Total RNA fra HeLa-celler ble høstet 24 timer etter transfeksjon og følge cDNA syntese, ble qPCR utført ved hjelp modnet mirnas målrettet spesifikke primere, dvs. miR31, la-7g, miR132, miR210, og universell primer levert av Perfecta SYBR Grønn qPCR kit (Quanta biovitenskap, se også metoder) (Forfalt-miRNA, grønn). U3 snoRNA ble anvendt som en kontroll. Graf viser gjennomsnitt og standardavvik fra minimum 3 uavhengige eksperimenter. (B) Analyse av spesifisitet for målretting miRNA knock-ned ved hjelp snoMEN vektorer. qPCR ble utført for 5 ulike mirnas (miR21, MIR-31, la 7g, miR132, MIR-210) for å sjekke mulige off target effekter av snoMEN vektorer rettet mot pri-mirnas, dvs. pri-miR21 snoMEN, pri-miR31 snoMEN, pri -La-7g snoMEN, pri-miR132 snoMEN, pri-miR210 snoMEN. Grafen viser gjennomsnittlig signal ratio for tre uavhengige forsøk som sammenligner spesifikke målrettede snoMEN med kontroll snoMEN transfeksjon (Control, rød). Hvert signal ble normalisert ved sammenligning med U3 snoRNA nivå.
Uttrykk for snoMEN fra en lentiviral vektor
For å forbedre fleksibiliteten til å levere snoMEN inn i celler, særlig sikte på å bedre leverings av snoMEN i cellelinjer som viser lave transfeksjonseffektiviteter for plasmid vektorer, forsøkte vi å konstruere lentiviral vektorer som kan uttrykke snoMEN (fig 5A). De fleste pattedyrceller er utsatt for lentivirus-infeksjon, inkludert både delende og ikke-delende celler, stamceller, og primære celler [31]. Vi sammenlignet lentiviral ekspresjon av pri-miR21 snoMEN i enten primære eller kreftceller, avledet fra humant vev. To separate lentiviral snoMEN vektorer ble konstruert, dvs. lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN og lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN, som målrette ulike regioner av miR21 primære transkripsjon (fig 5A og også se figur A i S1-fil). Både pri-miR21 snoMEN pre-miR21 snoMEN også kode mCherry cDNA som et uttrykk markør for transfekterte celler. Som vist av FISH analyse, hver av de lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN og negativ kontroll lenti-mCherry-Control snoMEN (EGFP målrettet), uttrykker snoMEN RNA som akkumuleres i nucleoli, ligner resultatene som ble oppnådd når snoMEN RNA uttrykkes fra transfekterte plasmidvektorer (fig E i S1 Fil og figur 1B) [1]. Uttrykket av snoMEN RNA fra de virale vektorer ble også bekreftet av det nordlige blot analyse (data ikke vist).
(a) Oppbygging av lentiviral vektor koding snoMEN rettet mot den endogene miR21 primære transkripsjon (Lenti-mCherry-pri -miR21 snoMEN). Denne konstruksjonen har tre snoMEN RNA (blå femkanter) og en mCherry FP-markør-cDNA som beskrevet i figur 1 A, bortsett fra at innskuddet ble sub-klonet inn i en vektor som ville produsere den lentivirus partikkel (pLVX-puro, Clontech). (B) Mikrografer viser apoptoseinduksjon av transducing med enten Lenti-mCherry-pri-miR21-snoMEN, eller Lenti-mCherry-Control-snoMEN viruspartikler. Bilder ble tatt 72 timer etter transduksjon. Scale bar er 10 mikrometer. (C) Total RNA fra human lunge primær (ATCC-CCL-75) og lungekreft (ATCC-CRL-5868) celler ble høstet 24 timer etter transduksjon. Etter cDNA syntese, ble qPCR utført ved hjelp av både en modnet miR21 spesifikk primer og en universell primer levert av Perfecta SYBR Grønn qPCR kit (Quanta biovitenskap, se også metoder). GAPDH ble anvendt som en kontroll. Graf viser gjennomsnitt og standardavvik fra minimum 4 uavhengige eksperimenter. (D) Grafen viser et tidsforløp av endringer i befolkningen i Annexin-V positive celler transduced med enten lenti-pri-miR21-snoMEN (grønn), lenti-pre-miR21-snoMEN (blå) eller Control (rød). Celletallet ble telt ved bruk av FACS. Den Annexin-V signal ble oppdaget ved hjelp av Guava nexin Reagens (Guava teknologier).
Deretter lenti-mCherry-pri-miR21 virus ble omformet enten i WI-38 (ATCC-CCL-75) menneske lunge fibroblast-celler (isolert fra et foster ved 3 måneder svangerskapet), som uttrykker lave nivåer av miR21, eller i humane lunge adenokarsinomceller, etablert fra en human pasient (alder 55, trinn 2), noe som sterkt uttrykte miR21 (fig F i S1 Fil). Dette miR21 uttrykk nivået endret seg ikke etter overføre et lenti-mCherry-Control snoMEN vektor (fig F i S1 File). Disse cellene er vanskelig å transfektere med DNA-plasmider ved hjelp av de generelle transfeksjonsmidler reagenser. Mer enn 90% av både primære og kreftceller viste mCherry uttrykk 24 timer etter lentivirus transduksjon. Primære celler transduced enten pri-miR21 snoMEN, eller pre-miR21 snoMEN, holdt vokser og fortsatte å uttrykke mCherry (Fig 5B og bilde G venstre paneler i S1 File). Men lentivirus transduced lunge adenokarcinomceller viste en sterk cytotoksisk fenotype innen 3 dager etter transduksjon (figur 5B midtre panelet og Fig G høyre panel i S1-fil). Selv om denne kreftcelle spesifikk cytotoksiske fenotype ble observert etter transduksjon med enten lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, eller lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN vektor, transduksjon med den negative kontrollen lentiviral vektor uttrykker snoMEN målretting EGFP (lenti-mCherry -kontroll snoMEN;. ingen endogen mål), viste ikke en cytotoksisk fenotype i enten primær eller lunge adenokarcinomceller (panel figur 5B høyre)
Transduksjon av enten lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, eller lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN, i lunge adenokarsinom celler, som sterkt uttrykte miR21, resulterte i hvert fall i ~ 25% reduksjon i nivåene av modne miR21 RNA, sammenlignet med celler transduced med den negative kontrollen, lenti-mCherry- kontroll snoMEN vektor, som bedømmes av QRT-PCR (fig 5C og bilde H i S1 File). Videre Annexin V-analyse, ved hjelp av FACS, viste opp-regulering av Annexin-V i lunge adenokarsinom celler etter transduksjon med enten lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, eller lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN, men ikke etter transduksjon med den negative kontrollen lentiviral snoMEN vektor (fig 5D).
Vi konkluderer med at lentiviral vektorer i stand til å uttrykke snoMEN RNA kan omformet til pattedyrceller med høy effektivitet. Levering av snoMEN rettet mot sekvenser i pri-miR21 induserer apoptose i humane lunge adenokarcinomceller men ikke i ikke-transformerte humane lunge primære celler.
Sammenligning av siRNA /shRNA og snoMEN pri-miRNA forstyrrelser
Å ha vist ovenfor at M box-modifisert snoRNAs kan redusere uttrykket av endogene miRNAs i humane celler når målrettet mot en sekvens innenfor primær transkripsjon av en miRNA som ikke er tilstede i den modne miRNA, vi neste sammen evne til siRNA oligonukleotider å banke ned uttrykk for miR21 når målrettet mot de samme primære transkripsjons sekvenser (figur 6a). For å utføre disse sammenligningene, tre siRNA oligonukleotider komplementære til de samme primære transkripsjons sekvenser i miR21 pri-miRNA som målrettet av M box-modifisert snoRNAs i mCherry-pri-MIR-21 snoMEN, ble transfektert inn i HeLa celler (Fig 6A og Fig jeg i S1 File). Alle tre pri-miRNA sirnas (si21M1-3), viste liten eller ingen knock-down av enten modne-miR21 eller pre-miR21 nivåer, som gjorde en ytterligere negativ kontroll siRNA (Scramble), bedømt ved QRT-PCR (fig 6B venstre panel) og ved Northern blotting (fig 6B panel til høyre). Som en positiv kontroll, en annen siRNA rettet til den modne sekvens miR21 (si21), resulterte i ~ 25% knock-down, spesielt for eldre miR21 men ikke for pre-miR21, i samsvar med tidligere rapporter [12, 13]. Videre ble de samme analysene utføres også ved hjelp av shRNA-teknologi (figur 6A og 6C, og figur I i S1-fil). Dermed tre shRNA uttrykk plasmider per genet, komplementære til de samme primære transkripsjons sekvenser i miR21 som målrettet av M box-modifisert snoRNAs i mCherry-pri-miR21 snoMEN, ble transfektert inn i HeLa celler (Fig 6A og figur jeg i S1-fil) . Alle tre pri-miR21 målrettet shRNAs (sh21M1-3), igjen viste liten eller ingen knock-down i nivåene av enten modne-miR21, eller pre-miR21, som gjorde en ytterligere negativ shRNA kontroll, som bedømmes av QRT-PCR ( fig 6C venstre panel) og ved Northern blotting (fig 6C panel til høyre). I motsetning til en positiv kontroll shRNA plasmid som uttrykker en shRNA rettet til den modne miR21 sekvens (sh21), resulterte i ~ 70% knock-down av modne miR21.
(a) Områdene på pri-miR21 RNA målrettet av snoMEN vektoren anvendt i denne studien er vist i et skjematisk diagram (sh /si21M1-M3). De samme pri-miR21 sekvenser som målskive for snoMEN vektoren ble angrepet av siRNA oligonukleotider og shRNA uttrykk plasmider. (B) Grafen viser resultatet av QRT-PCR /qPCR. Total RNA fra HeLa-celler ble høstet 24 timer etter transfeksjon og QRT-PCR ble utført for å identifisere miR21 forløper molekyler ved hjelp miR21 forløper spesifikke primere (pre-miR21, rød). Etter cDNA syntese, ble qPCR utført ved hjelp modnet miR21 spesifikk primer og universell primer levert av Perfecta SYBR Grønn qPCR kit (Quanta biovitenskap, se også metoder) (Forfalt-miR21, grønn). U3 ble anvendt som en kontroll. Graf viser gjennomsnitt og standardavvik fra minimum 4 uavhengige eksperimenter. Høyre panel viser resultatet av Northern blot analyse for siRNA eksperimenter. Påvisning av endogene miR21 RNA-nivåer etter transfeksjon av HeLa celler ved hjelp av enten kontroll siRNA (Scramble: lane1), miR21 siRNA (si21: lane2), miR21 M box siRNA-1 (si21M1: Lane3), miR21 M box siRNA-2 (si21M2: lane4), miR21 M box siRNA-3 (si21M3: lane5). En ekvivalent mengde av HeLa total-RNA ble påsatt i hvert kjørefelt og RNA separert ved PAGE, elektroblottet på membranen og probet begge med en miR21 sonde og med en tRNA-probe som en lasting kontroll. (C) Den samme serie eksperimenter med siRNA transfeksjon, som beskrevet i figur 6b, bortsett shRNA uttrykk plasmider ble transfektert i stedet for siRNAs.
Vi konkluderer med at snoMEN vektorer kan føre til en reduksjon i uttrykket spesifikke miRNAs ved å målrette atom forløper RNA-sekvenser som ikke synes å være mottakelig for knock-ned av enten siRNA oligonukleotider, eller shRNA vektorer. I kontrast, cytoplasmatiske RNA, inkludert modne miRNAs kan bli slått ned av shRNA vektorer som er rettet mot de samme sekvensene brukes i snoMEN vektorer.
Mekanisme snoMEN RNA interferens
Vi har tidligere demonstrert at mekanismen hvorved snoMEN kan modulere ekspresjonsnivået av et mål-mRNA krever argonaute-2 (Ago2), som i sin tur er involvert i hoved RNAi pathway [32]. Den snoMEN Mekanismen kan også omfatte opp-rammeskifte-1 (Upf1), som antas å være avgjørende for nonsense-mediert nedbrytning (SD) pathway [6, 33-35]. Det var imidlertid ikke klart hvorvidt snoMEN-mediert modulering av ekspresjonsnivået av en målrettet ikke-protein-kodende RNA, inkludert pri-mirnas, ville innebære nøyaktig den samme mekanisme. Derfor, undersøkte vi hvorvidt RNAi-mediert uttømming av en rekke proteiner, inkludert Ago2, kan påvirke evnen til snoMEN vektorer for å endre ekspresjon av mirnas (figur 7). Resultatene viser at den snoMEN avhengige knock-down av pri-miR21 nivåer ble forhindret spesielt i celler utarmet av Ago2 ved siRNA behandling, sammenlignet med celler behandlet med en egge siRNA negativ kontroll (figur 7A og 7B). Ytterligere kontroller viste at nivået av snoMEN RNA-ekspresjon ikke ble påvirket av siRNA transfeksjoner (fig J i S1-fil). Dette innebærer at Ago2 kan være involvert, enten direkte eller indirekte, i mekanismen for snoMEN-mediert undertrykkelse av primær miRNA transkripsjonsnivåer. Men vi fant her at verken siRNA-mediert uttømming av Upf1, som tidligere ble vist å påvirke evnen snoMEN å banke ned proteinkodende RNA [6], og heller ikke av Ago1, som i likhet med Ago2 [32], kan assosiere med snoRNAs, hindret hemming av miR21 uttrykk ved snoMEN.
