Abstract
Sikt
Forhøyede nivåer av sterol regulatorisk element-bindende protein-1 (SREBP-1) har blitt funnet i livmorkreft (EF), noe som tyder på at det er viktig for utvikling av EF. Fedme og diabetes har blitt etablert som kjente risikofaktorer for EC, mens SREBF-1-genet polymorfismer er også blitt funnet å være assosiert med fedme og type II diabetes. Derfor hypoteser vi at enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) i SREBF-1-genet kan være assosiert med øket risiko for EC.
Metode
Vi analyserte sekvensen av SREBF-1 i vevsprøver fra 30 EU-saker og 6 godartede kontroller med høy gjennomstrømning metode. Basert på primære resultater, valgte vi en SNP (rs2297508) som en genetisk markør for å gjennomføre en sykehusbasert case-control studie med 139 EC tilfeller og 129 godartede kontroller. Prøvene ble undersøkt i mikroskop for å fastslå histopatologi før SNP analyse ved hjelp av RT-PCR.
Resultater
Gjennom sekvensanalyse, fant vi 10 SNPs av SREBF-en i forbindelse med EF, inkludert 3 nye SNPs. Fjorten prosent av EF viste rs2297508 SNP med C-allelet, mens bare 7% hadde C-allelet var til stede i godartede kontroller (p = 0,027, OR = 1,983). I tillegg ble C-allelet assosiert med kreft differensiering (p 0,05) og dybden av myometrial invasjon (p 0,05).
Konklusjon
Vårt studium viser at SNP (rs2297508) av SREBF -1 kan tjene som en genetisk predisposisjon for utvikling av EF og screening av en slik genetisk markør kan være nyttig i en tidlig deteksjon
Citation. Qiu CP, Lv QT, Dongol S, Wang C, Jiang J (2014) enkeltnukleotidpolymorfi av SREBF-en Gene forbundet med økt risiko for livmorkreft i kinesiske kvinner. PLoS ONE 9 (3): e90491. doi: 10,1371 /journal.pone.0090491
Redaktør: Kwang-Hyun Baek, CHA University, Sør-Korea
mottatt: 24. august 2013, Godkjent: 31 januar 2014; Publisert: 10 mars 2014
Copyright: © 2014 Qiu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble oppnådd i det kardiovaskulære laboratoriet av Qi Lu Hospital of Shandong University og ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (81072121, 81372808 [JJ] og 81173614 [QTL]) samt Science and Technology Development planlegging av Shandong (2011GSF12122 [XZ] og 2012G0021823 [JJ]). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Endometriekreft (EF) er den vanligste gynekologiske kreftformen hos den vestlige verden og den fjerde vanligste kreftformen hos kvinner. Forekomsten av EF har økt med 21% siden 2008, og dødeligheten har økt betydelig i løpet av de siste to tiårene [1]. The American Cancer Society estimert 49.500 nye tilfeller og 8200 dødelighet i 2013 [2]. Årsakene til EC er multifaktoriell og innebærer økt eksponering for østrogen [3] og genetiske risikofaktorer. Så langt har det vist seg at flere SNPs er forbundet med en økt risiko for EC, slik som nukleosid difosfat kinase 1 (nm23-H1, rs16949649 og rs2302254), Serpin peptidase hemmer, klade E (PAI-1; rs1799889) og progesteron -reseptor (PGR; rs11224561) [4] – [6]. For å forstå de genetiske risikofaktorer omfattende og finne effektive mål, er det nødvendig å identifisere de relaterte SNP.
sterol regulerende element-bindende proteiner (SREBPs) er transkripsjonsfaktorer av spiralen-sløyfe-helix-leucin zipper ( HLH-LZ) familie. Tre isoformer av SREBP har blitt identifisert i pattedyrceller: SREBP-1a, SREBP-1c og SREBP-2 [7]. To gener (SREBF-1 og SREBF-2) er ansvarlig for å uttrykke disse proteinene som SREBF-1 genet ligger på kromosom 17 p11.2. Det er en overlapping i trasé og funksjoner blant de enkelte SREBPs, men de fleste studier tyder på at SREBP-1 regulerer hovedsakelig fettsyremetabolisme og SREBP-2 er den viktigste regulatoren av kolesterol stoffskiftet [8]. SREBP-1 regulerer lipid homeostase ved å kontrollere uttrykk for styringsrenten begrensende enzymer som kreves for kolesterol og fettsyrer [9]. Avvikende lipogenese er en viktig metabolsk funksjon som er involvert i hurtig proliferasjon av maligne tumorceller. Flere studier har vist at tumorcellene er i stand til å reaktivere de novo lipidsyntese og som uttrykker forhøyede nivåer av fettsyre syntase (FASN) [10], som er regulert av SREBP-1 [11]. I samsvar med disse funn har SREBP-1 er vist å ha en sammenheng med mange andre maligne tumorer så som brystkreft, prostatakreft og tykktarmskreft, så vel [12] – [15]
Gjennom mekanisme. lipidbiosyntese, SREBP-1 har blitt foreslått å være en forårsakende faktor for fedme [16]. Fedme på den annen side anses som ansvarlig for forskjellige mekanismer som utfelles i karsinogenese [7]. Gjennom mekanismen av insulinresistens, fedme induserer sekresjon av insulin fra bukspyttkjertelen celler. Insulin i sin tur har en stimulerende effekt på SREBP1 [17]. Nylig har høyere nivå av SREBP-1 blitt oppdaget i EC-celler sammenlignet med normale endometrium, og som var mer fremtredende i høyere grad EC. I tillegg knockdown av SREBP1 ble funnet effektivt å undertrykke den prolifererende kapasitet av EC-celler og tumorvekst in vitro, noe som indikerer at ytterligere SREBP-1 spiller en viktig rolle i progresjon av EC [18].
Så vidt vi vet , ingen studier hittil har rapportert potensialet sammenslutning av SREBF-en genetisk polymorfisme med risiko for EF. Vi hypotese at SNPs i SREBF-en kan være assosiert med økt risiko for EC, sammen med flere kliniske kriterier som patologisk karakter, klinisk stadium, patologisk type etc. Den SNPs av SREBF-en kan tjene som genetisk disposisjon faktorer for utvikling av EF og screening av slike genetiske markører kan være av stor verdi for en tidligere påvisning av denne sykdommen.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
De sluttet skriftlig informert samtykke ble kjøpt fra alle deltakerne og prøvene ble samlet inn med godkjenning av etikkomiteen ved Qilu Hospital of Shandong University.
i vår studie har vi gjennomført en case-control-analyse med totalt 139 tilfeller og 129 kontroller. Vi har for det første vist hele genet av SREBF-1 i 30 ubeslektede EF-pasienter og 6 kontroller for å identifisere den tilknyttede SNP’er. Basert på resultatene vi oppnådde, valgte vi en SNP (rs2297508) som ble funnet i åtte av de tretti pasienter og ingen av de seks kontrollene og gjennomført en case-control studie for å bekrefte sin tilknytning til EU.
forsøkspersonene
Det er totalt 268 objektive kandidater ble rekruttert stokastisk. Prøvene av 139 EU-prøven og 129 godartede kontroller ble samlet basert på deres patologiske rapporter. Endometrial prøver fra 139 kreftpasienter ble innhentet gjennom kirurgisk reseksjon etter hysterektomi utført ved Qilu sykehus Institutt for gynekologi. Vevsprøver for kontroller ble samlet inn fra pasienter uten fertilitetsproblemer og med godartede sykdommer som leiyomyomas, adenomyosis etc. De enkelte prøver ble undersøkt under mikroskop for patologisk diagnose for begge gruppene. EF Pasientene ble delt inn i to grupper, 91 uten diabetes og fedme og 48 med diabetes og /eller fedme, og denne informasjonen ble fikk fra sykehuset poster. Den normale kontroller med diabetes eller fedme (BMI ≧ 28 kg /m
2) ble ekskludert på grunn av en mulig sammenheng mellom SNP (rs2297508) med begge metabolske forstyrrelser som beskrevet i studien ved Liu JXet al. [20 ]. Også kontrollene hadde ingen kjent historie av diabetes, fedme eller andre maligniteter hos sin familie. Gjennomsnittsalderen på 48 pasienter med fedme og /eller diabetes var 53,09 ± 6,7 og at av de 91 pasienter uten diabetes eller fedme var 54,36 ± 9,7 (P = 0,196). Gjennomsnittsalderen for de vanlige kontrollene (52.46 ± 7,7) var sammenlignbar med de 91 pasientene (p = 0,215). EF-pasienter ble behandlet kirurgisk i Qilu Hospital fra 2008 til 2012. De ble kategorisert i endometrioid (type I) og ikke-endometrioid (type II) EF og svulstene ble iscenesatt i henhold til 2009 International Federation of gynekologi og fødselshjelp (FIGO ) klassifisering.
DNA forberedelse
Den ferske vevsprøve innsamlede ble lagret ved -80 ° C nedkjøling. Genomisk DNA ble ekstrahert fra vev ved hjelp av en QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, USA) etter produsentens protokoll. Det ekstraherte DNA ble oppløst i TE-buffer [10 mMTris (pH 7,8), 1 mM EDTA], og deretter konsentrasjonen ble målt med en henvisning til OD-verdien av 260 nm (BIO-RAD SmartSpec Plus). Sluttpreparatet ble lagret ved -20 ° C for PCR-amplifikasjon. Amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av en 5 min innledende denaturering ved 94 ° C, etterfulgt av 30 sykluser hver på 30 sek ved 94 ° C, 30 sek ved 60 ° C, 30 sek ved 72 ° C og en 10-min endelig forlengelse ved 72 ° C. Forover- og revers primere var 5 «GACCTGAGGCTCCTGTGCTAC 3» og 5 «AAGTCAGTCCATCCTCCCGT 3» hhv.
Valg av SREBF-1 polymorfi poeng
For å få tilgang til tilstrekkelig informasjon om den potensielle sammenslutning av SNPs i SREBF-en med livmorkreft, må vi først vist hele genet av SREBF-en i 30 urelaterte pasienter og 6 kontroller av høy gjennomstrømming sekvense teknikk som bruker PSTAR-II plus (IDN01-M-P2). De 36 forsøkspersoner ble tilfeldig valgt og matchet på grunnlag av deres alder. Vi var i stand til å identifisere 10 SNPs, inkludert tre nyoppdagede seg. Alle funnene ble analysert ved PSTAR-II 6.0.4 build3 programvare. For foreningen studien, valgte vi bare en SNP (rs2297508) basert på sin allel frekvens som viste en tydelig og signifikant sammenheng til EF.
SREBF-en genotyping
Sanntids polymerase chain reaction analyse ble brukt for å genotype SNP (rs2297508) i SREBF-en. Primersekvensene for SNP var som følger: GF 5 «CTCCCCCAGCACCTACGG 3», cF 5 «CTCCCCCAGCACCTACGC 3» som den forover primer og R 5 «CTCCCCACTCCTCCCACTAAC 3» som revers primer. Reaksjonssystemet (20 ul) for RT-PCR inkluderte 10 ul Alt-i-ett-qPCR Mix, 0,4 ul frem Primer F (2 mm), 0,4 ul reversere Primer R (2 mm), 2 ul genomisk DNA og 7,2 ul ddH2O . Reaksjonsfremgangsmåten ble utført på en sanntids-PCR instrument (trinn en Plus (ABI)) å dele inn i tre faser: holdetrinn ved 95 ° C i 20 s, sykling stadium av 40 sykluser hver inkludert 3 s ved 95 ° C og deretter 30 s ved 60 ° C, og som smelter kurve trinn ved 60 ° C i 60 s etterfulgt av 95 ° C i 15 s.
Statistical Analysis
Hardy-Weinberg likevekt-analyser ble utført for å sammenligne genotypefrekvensene bruker χ
2 test blant kontrollene (χ
2 = 1,24, p = 0,26). Sammenligning av genotypefrekvensene mellom EF-pasienter og kontroller ble utført ved hjelp av Pearson χ
2 test. Vi evaluerte også forholdet mellom genotypen fordeling av SREBF-1 SNP’er, og de kliniske kriterier for EC (fordelt på grunnlag av tilstedeværelse eller fravær av diabetes og fedme, alder, histologisk type patologisk gradering og kliniske faser). Analyser ble utført ved hjelp av datamaskinprogramvaren SPSS (versjon 17.0). P 0,05 ble ansett som statistisk sikkerhet
Resultater
SNP identifikasjon og genotyping
Vår screening identifisert 10 polymorfismer (SNP1 å SNP10) inkludert 3 nyoppdagede områder (. Figur 1). C-allel i SNP9 (rs2297508) ble påvist i åtte på tretti pasienter (26,7%), men ikke i noen av kontrollene. Andre oppdaget SNPs viste liten forskjell mellom pasienter og kontroller. (Tabell 1) Deretter valgte vi SNP9 (rs2297508) for videre studier og analysert alle eksperimentelle prøver og kontroller ved hjelp av real-time PCR. Resultatene (GG, GC eller CC) ble analysert ved Step One Software V2.1. Genotyping ble utført basert på de ulike forsterkningskurver observert for ulike genotyper (Fig. 2)
A:. SNPs i SREBF-1 genet. Hele SREBF-1gene inneholder 22 eksoner. Ti SNPs (SNP1 til SNP10) ble identifisert innen SREBF-en i vår studie. Fig. 1 B: SNP-ID. SNP1 til SNP10 er oppført fra 5′-3 «i SREBF-1. «CHR-ID» viser kromosom ID ti SNPs i SREBF-en. Oppført «RS ID» har blitt rapportert i UCSC eller NCBI nettside, «-» uttrykker nylig oppdaget SNP. «Function» -kolonnen oppført forandret genetisk kodet funksjon av SNPs. «Ref SNP» viser SNP form i originalreferansesekvens. I «mRNA plassering», blir tilsvarende mRNA stillinger viste i samsvar med hver SNP. (For mer informasjon: Sequence IDer inkludert i CCD 32583,1). NCBI db er tilgjengelig fra https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP.
Fig. 2 A, B og C viser GG, CC og GC genotype henholdsvis som vist med resultatene oppnådd med RT-PCR.
Association mellom SNP rs2297508 og risiko for EC
allelet distribusjon av SNP (rs2297508) på SREBF-1 genotyper i kontrollgruppene er i samsvar med Hardy-Weinberg likevekt som testet av χ
2 test (χ
2 = 2,27, P = 0,13). Variasjonen i fordelingen av C-allelet mellom EF-pasienter og friske kontrollpersoner ble tydelig vist (P = 0,027). Den χ
2 test avslørte at GC /CC genotyper eller C allel bærere hadde en økt risiko for EC (OR = 1,966 og OR = 1,983) sammenlignet med henholdsvis GG eller G bærere. Konfidensintervaller av sannsynlighetsforholdet (OR) ble anvendt for å beskrive de begrensninger skal være gyldig i hvilken de estimerte beregninger. Sammenligningen av genotypisk og allele frekvenser av SNP mellom EF-pasienter og friske kontrollpersoner er vist i tabell 2. Resultatene var i samsvar med vår foreløpige høy gjennomstrømming eksperiment.
Association mellom SNP rs2297508 og patologisk karakter og dybden av myometriets invasjon av EF
Vi har forsøkt å forklare hvilken rolle polymorfe locus rs2297508 på co-eksisterende forhold som diabetes, fedme, samt på ulike aldersgrupper, patologiske typer og patologiske graderinger av kreft kliniske stadier og myometriets invasjon i EF-pasienter (tabell 3). Siden diabetes og fedme er to store risikoer som er kjent for å være nært knyttet til EC, og SNP er en viktig markør av genetisk predisposisjon for EC, kan det bli antatt at det var en potensiell effekt av denne polymorfisme på tilstanden. Vi delte EF pasientene inn i to grupper (med diabetes eller fedme og uten). Imidlertid ingen signifikant forskjell i frekvens allel var tydelig mellom de to. Andre kriterier for å dele fagene i ulike grupper ble målt i henhold til tidligere rapporter samt klinisk betydning [4], [5]. Resultatene viste at SNP C variant bærere hadde høyere patologisk karakter og dypere myometriets invasjon (OR = 2,042 og OR = 2,233) sammenlignet med G bærere. Videre GC /CC genotype og C-allelet var signifikant assosiert med patologisk Karakter (χ
2 = 4,095, P = 0,043 og χ
2 = 3,893, p = 0,048 henholdsvis) og myometriets invasjon (χ
2 = 4,018, P = 0,045 og χ
2 = 4,170, p = 0,041 henholdsvis). Andre kriterier som alder, patologisk type og klinisk stadium viste ingen signifikant sammenheng med SNP.
Diskusjoner
Lipid biosyntese er viktig for vedlikehold av cellulær homeostase mens økt de novo lipid syntese er en vanlig metabolsk funksjon i kreftutvikling [19]. Den økte uttrykk for FASN og LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor) i tumorceller bevitne denne uttalelsen [20]. SREBPs kan regulere forskjellige enzymer som er involvert i fettsyrer og kolesterol biosyntese. Bortsett fra å påvirke flere enzymer involvert i lipogenese, SREBP deltar også i konvertering av androgen til østrogen gjennom aromatization reaksjon og dermed heve nivået av østrogen i sirkulasjon. Fedme er også blitt funnet ansvarlig for å senke nivåene av progesteron som har en sterk antagonist-virkning på kreftfremkallende funksjon av østrogen [21]. Videre er SREBP1 også assosiert med modulering av transkripsjon av enzymet 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 12 (17 β -HSD12) som er ansvarlig for omdanning av østron (E1) til en mer potent form, østradiol (E2) [22], [23]. Så kan vi utlede at SREBP aktivitet er nødvendig for tumorvekst, noe som tyder på at SREBP spiller en betydelig rolle i onkogenese. I tillegg har abnormt økt ekspresjon av SREBP-1 er funnet i en rekke kreftformer, inkludert EC [18].
I denne forskning vi postulert at SNP’er i SREBF-1gene har potensielle rolle i genetisk predisposisjon av EC. En tidligere studie har oppdaget 19 polymorfismer i SREBF-1 og viste sammenheng mellom SREBF-1 polymorfismer og fedme, så vel som type II diabetes [19]. Videre har epidemiologiske studier bekreftet at fedme er en av de viktigste risikofaktorene for EC mens SREBF-1 genet polymorfismer har assosiasjoner med metabolske sykdommer (type2 diabetes og fedme) [24]. En annen studie konkluderte med at SNPs rs2297508 og rs11868035 i SREBP-1c genet har relasjoner med økt risiko for diabetes mellitus type 2 og dyslipidemi i den kinesiske befolkningen. Den samme studien viste også at SNP (rs11868035) er signifikant assosiert med insulinresistens (IR) hos pasienter med diabetes [25]. Men studier, som viser forholdet mellom SREBF-1 genetisk polymorfisme og kreft, er sjeldne. Hittil har bare Daniele Campa og hans kolleger undersøkte sammenhengen mellom SNPs i SREBF-en og onkogenese av brystkreft, men ingen statistisk signifikante sammenhenger ble funnet mellom SNPs oppdaget og risiko for brystkreft [26]. Dermed har vi også vurderes nærmere vår hypotese om at de genetiske polymorfismer er knyttet til diabetes og fedme sammen med noen andre kliniske kriterier knyttet til EF.
Så vidt vi vet, er dette den første rapporten undersøker rollen SREBF-en genet polymorfismer i EF. I vår studie fant vi at fordelingen av SNP (rs2297508) hadde en distinkt skille mellom EF-pasienter og godartede kontroller. C-allelet i SNP var assosiert med høyere følsomhet overfor EF. Derfor spår vi den høye muligheten for C-allelet i SNP har en avgjørende forhold til risikoen for EF og vi tror at videre leting vil føre forskerne mot å utvikle et nytt terapeutisk mål for behandling av EF.
videre analysert foreningen av ulike kliniske egenskaper i EC pasienter med SNP. Først vurderte vi sammenhengen mellom diabetes og /eller fedme og genotypisk eller allel frekvens i EF-pasienter. Men ingen statistisk signifikans ble funnet mellom de to gruppene. Det vil si, den SNP har samme fordeling i EF pasienter uavhengig av nærvær eller fravær av risikofaktorer som diabetes og fedme. Det antydet at det var unormal lipidmetabolisme forbundet med SNP i EF som er uavhengig av diabetes og fedme. Deretter sammenlignet vi alder kriterier, patologiske typer og kliniske faser, men ingen signifikante assosiasjoner ble oppnådd, og dermed gi bevis for at det finnes noen sammenheng mellom SNP og de kliniske kjennetegn. Konsistens med rapporten presentert av Li W. et al. [21], den C-allel i SNP oppviste en signifikant sammenheng med høyere grad av tumor. Videre pasienter med C-allelet viste en høyere risiko for å utvikle en dypere myometriets invasjon i forhold til de med G-allelet i SNP locus. Dette funn kan resultere fra slutten av påvisning av sykdommen, men vi kan ikke utelukke muligheten for påvirkning av SNP. Det kan være en potensiell sammenheng mellom patologisk grad av tumor samt dybde på myometriets invasjon. Men videre forskning er nødvendig for å avklare dette konseptet. I sammendrag, synes C-allelet for å være en markør for en høyere grad av tumor og dypere myometrial invasjon i EC, og dermed kunne fungere som en uunnværlig markør som må tas i betraktning i klinisk evaluering og behandling av EC i nær fremtid.
i konklusjonen, vår studie undersøkte hovedsakelig sammenhengen mellom SNP (rs2297508) i SREBF-1, og risikoen for EF og funnet ut at C-allelet av SNP er potensielt en risikofaktor for EC. Samtidig, analyserte vi foreningen av SNP med ulike kliniske kriteriene for EC og resultatene viste at pasienter med høyere C allel frekvensen var mer utsatt for å utvikle høy klasse svulst og dyp myometriets invasjon. Resultatene indikerte at SREBF-en polymorfisme kan spille en viktig rolle i å øke genetisk disposisjon for EU. Derfor antar vi at dette kan hjelpe legen i klinisk diagnose av tilstanden og vil også lede til en målrettet klinisk behandling.
I vår studie benyttet vi høy gjennomstrømming sekvensering, en pålitelig teknikk med stor nøyaktighet og presisjon, å oppdage 10 SNPs assosiert med EF inkludert tre nye som kan være av betydning for andre studier i fremtiden. Videre bekrefter vi at SNP (rs2297508) i SREBF-en har en betydelig innflytelse på EC mottakelighet og kliniske kriterier. Imidlertid har studien noen begrensninger. Mot motivet nivå, har vi ikke livsstil data som inntak, fysisk aktivitet, bruk av hormonell prevensjon etc. som er egnet til å påvirke mottakelighet av SNPs til EC risiko. Videre er det ikke kjent hvorvidt den SNP arbeider i samordning med andre SNP i å øke risikoen for EC. Fremtidige studier av større utvalgsstørrelse vil være nødvendig å studere påvirkning av disse faktorene på sammenhengen mellom SNP og risikoen for EF.
Hjelpemiddel Informasjon
Informasjon S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0090491.s001 plakater (DOC)
Takk
Vi ønsker å takke Dr. Judith A. Sterk, Institutt for anestesiologi, Universitetet of Cincinnati College of Medicine for hennes kommentarer /forslag i utarbeidelsen av manuskriptet.
