Abstract
Motstand mot kjemoterapi fortsatt et stort hinder i kreftbehandling. Denne studien hadde som mål å evaluere den molekylære mekanismen og effekt av honokiol i indusere apoptose og styrke paclitaxel kjemoterapi i pre-kliniske multiresistent (MDR) kreft-modeller, inkludert avstamning-avledet humant MDR (KB-8-5, KB-C1, KB-V1) og deres foreldre narkotika sensitive KB-3-1 kreft cellelinjer.
In vitro
analyser viste at honokiol effektivt inhiberte proliferasjon i KB-3-1-celler og MDR-derivater (IC
50 som strekker seg 3,35 ± 0,13 ug /ml 2,77 ± 0,22 pg /ml), til tross for sin signifikante forskjeller i respons til paclitaxel (IC
50 som strekker seg 1,66 ± 0,09 ng /ml til 6560,9 ± 439,52 ng /ml). Honokiol indusert mitokondrier-avhengige og død reseptor-mediert apoptose i MDR KB-celler, som var forbundet med inhibering av EGFR-signalisering STAT3 og nedregulering av STAT3 målgener. Kombinert behandling med honokiol og paclitaxel synergistisk forsterket cytotoksisitet i MDR KB celler, sammenlignet med behandling med begge substansene alene
in vitro
. Viktigere, den kombinerte behandlingen betydelig hemmet
in vivo
vekst av KB-8-5 svulster i en subkutan modell. Tumorvev fra kombinasjonsgruppen viste en signifikant inhibering av Ki-67 ekspresjon og en økning i TUNEL-positive celler, sammenlignet med kontrollgruppen. Disse resultatene tyder på at målretting multiresistens ved hjelp honokiol i kombinasjon med cellegift kan gi nye terapeutiske muligheter
Citation. Wang X, Beitler JJ, Wang H, Lee MJ, Huang W, Koenig L, et al. (2014) Honokiol Forbedrer Paclitaxel Effekt hos multiresistent Menneskelig Cancer Modell gjennom induksjon av apoptose. PLoS ONE 9 (2): e86369. doi: 10,1371 /journal.pone.0086369
Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 02.10.2013; Godkjent: 08.12.2013; Publisert: 25 februar 2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av National Cancer Institute (NCI) gjennom et hode og nakke kreft SPORE award (P50CA128613), P30 CA138292, og AR47901. D.M.S., J.J.B., og Z.G.C. ønsker også å erkjenne Georgia Cancer Coalition for støtte. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. A.R.M. Ruhul Amin er i dag en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Hyung Ju C. Shin tiden er ansatt i et kommersielt selskap Quest Diagnostics, Atlanta. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kjemoterapi er fortsatt en av de store behandlingstilbud for mange typer kreft, men en betydelig prosent~~POS=TRUNC av pasienter som utvikler medikamentresistens i løpet av kjemoterapi, og uunngåelig videre uten herding [1], [2]. Til tross for den bemerkelsesverdige fremskritt i utvikling av legemidler, har paclitaxel med sitt brede kreft spekter størknet avbrudd av mikrotubulidynamikk som en av de mest effektive anticancer strategier i bruk i dag. Imidlertid har fremveksten av resistente kreftceller i stor grad begrenset sin kliniske effekten. Det er derfor nødvendig å utvikle nye strategier for å redusere eller overvinne chemoresistance i kreft. Ulike tilnærminger for å forbedre chemoresponse i kjemoresistent kreft modeller har blitt utforsket, inkludert de som kombinerer naturlige produkter eller forbindelser med paclitaxel eller andre standard kjemoterapi reagenser.
Honokiol er en naturlig komponent isolert fra barken av magnoliatre [2], [3], som har tradisjonelt blitt brukt til å behandle angstrelaterte lidelser og fordøyelsesproblemer [2], [4]. Interessant, honokiol også oppviste potent anticancer aktivitet [5], [6], [7] og ytterligere forbedrede konvensjonelle kjemoterapier i forskjellige prekliniske modeller av human cancer, inkludert kronisk lymfatisk leukemi [3], prostatakreft [8] og multippelt myelom [9]. Disse relativt vidtrekkende anticancer evner og gunstig sikkerhetsprofil gjør honokiol en attraktiv tilleggsbehandling for å forbedre konvensjonell kjemoterapi i kliniske settinger.
Overuttrykte av anti-apoptotiske proteiner er en underliggende mekanisme som bidrar til anskaffelse av terapeutisk motstand, tilbakefall og metastasering. En voksende mengde bevis tyder på at tre anti-apoptotiske proteiner, dvs. Survivin, Mcl-en, og BCL-2, kan være direkte relatert til resistens i kreft [10], [11]. Inhibering av disse viktige overlevelsesfaktorer er blitt vist å utløse apoptose og sensibilisere kreftceller for å medikamentbehandling [5] -. [11], og dermed denne tilnærming kan være lovende i å overvinne chemoresistance og forbedring av kjemoterapi ved kreft
Ved å bruke en rekke avstamning-avledet KB menneskelige plateepitel kreft cellelinjer som viser forskjellige følelser for paclitaxel behandling, viste vi at honokiol kunne effektivt indusere apoptose i multiresistent (MDR) kreftceller. Mekanistiske studier viste at honokiol hemmer EGFR-STAT3 signalveien, og undertrykker uttrykk for survivin og andre overlevelse faktorer. Vi viste videre
in vivo
effekt av honokiol i behandling av MDR kreft og styrke paclitaxel effekt.
Materialer og metoder
Cell Culture
KB- 3-1 og dens deriverte MDR-cellelinjer ble generøst gitt av Dr. Michael M. Gottesman (NCI, NIH, Bethesda, MD) og er blitt karakterisert tidligere [12]. KB-3-1-celler ble opprettholdt i DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum. KB-8-5 KB-C1 og cellene ble opprettholdt i DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 0,01 og 1 ug /ml colchicin respektivt. KB-V1-celler ble holdt i DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1 pg /ml vinblastin. For å eliminere virkningen av kolkisin eller vinblastin på eksperiment resultat av resistente celler ble dyrket i medikamentfritt medium i en uke før forsøket.
Cell Growth Assay
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
3-celler per brønn i 96-brønners plater i quadruplet. Tjuefire timer senere ble legemidler ble tilsatt i forskjellige konsentrasjonsområder som enkle midler, eller i to-legemiddelkombinasjoner og deretter inkubert i 72 timer. Området for honokiol var fra 0,625 til 20 pg /ml for alle fire cellelinjer. For paclitaxel, konsentrasjonsområdet var 0,19 til 97,5 ng /ml, 3,02 ng /ml til 3,12 ug /ml, 12,1 ng /ml til 25,0 ug /ml og 97,5 ng /ml til 100 ug /ml for KB-3-1 , KB-8-5, KB-C1, og KB-V1 celler, henholdsvis. Cellevekst-hemming ble målt ved å bestemme celletetthet med sulforhodamin B analysen. Den prosentvise inhibering ble bestemt ved sammenligning av celletetthet i de legemiddelbehandlede celler med den for ubehandlede kontrollceller. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger.
Apoptose Analyse
Apoptose ble analysert i alle fire cellelinjer. Cellene ble behandlet med honokiol, paclitaxel eller deres kombinasjon som vist i figuren legender, trypsinert og vasket i kaldt 1 × PBS. Cellene ble resuspendert i 1 x Annexin bindingsbuffer (BD PharMingen), og deretter farget med Annexin V-fykoerytrin (Annexin V-PE; BD PharMingen) og 7-AAD (BD PharMingen) i 15 min ved romtemperatur. De fargede prøver ble målt ved anvendelse av en fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) kaliber benk-topp-strømningscytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). FlowJo programvare (Tre Star, Ashland, OR) ble brukt for apoptose analyse. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger, uavhengig av hverandre.
Immunoblotting
Tretti mikrogram protein fra hel-celle-ekstrakter eller cytoplasmiske og mitokondrielle fraksjoner ble kvantifisert, separert på SDS-PAGE-geler og overført til nitrocellulosemembraner. Etter å ha blitt blokkert med 5% fettfri tørrmelk i TBS-T-buffer, ble membranene inkubert med spesifikke antistoffer over natten ved 4 ° C. Mus anti-β-aktin-antistoff (Trevigen, Gaithersburg, MD) ble anvendt som en prøve lastekontroll. Immunostained proteinbånd ble påvist med en forbedret kjemiluminescens kit (Amersham, Buckinghamshire, UK). Forsøkene ble gjentatt 3 ganger.
In vivo
Anti-tumor effekt analysen
dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Emory University. KB-8-5-celler (5 × 10
5) ble injisert subkutant i 4-5 uker gammelt nakne mus (atymiske
nu /nu
, Taconic NY). Når tumorene hadde utviklet seg til ca. 100 mm
3, ble musene inndelt i fire grupper (n = 7 eller 8) på en måte for å minimere vekt og tumorstørrelsesforskjeller mellom gruppene: kontrollgruppen som ble behandlet med 20% intralipid ( Baxter Healthcare), honokiol gruppe (1,0 mg /mus eller 50 mg /kg), paclitaxel gruppe (20 mg /kg), og honokiol (1,0 mg /mus eller 50 mg /kg) pluss paclitaxel (20 mg /kg) kombinasjonsgruppen . Honokiol ble oppløst i 100% etanol og blandes med 20% intralipid i en 01:14 (v /v) forhold. Honokiol ble administrert til musene 3 ganger per uke ved 1,0 mg /mus (eller 50 mg /kg) via intraperitoneal injeksjon. Paclitaxel ble administrert til musene en gang per uke ved 20 mg /kg via haleveneinjeksjon. Behandlingen ble fortsatt i 4 uker. Kroppsvekt og tumorstørrelse ble målt tre ganger per uke. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen:
V
=
//6 × større diameter x (mindre diameter) [13]. Musene ble avlivet 4 uker etter initiering av behandling. Tumor og orgel vev (lever, hjerte, lunge, milt og nyre) ble samlet for H . E farging og farging analyser
Immunohistochemistry og TUNEL analysen
Immunhistokjemisk analyse for Ki-67 farging på parafin-innleiret mus xenograft vev ble utført som tidligere beskrevet [13]. Celler farging positiv for Ki-67 ble tellet, og prosentandelen av positive celler ble beregnet. Et gjennomsnitt av de 8 målingene ble brukt for statistisk analyse.
TUNEL analysen ble utført ved immunfluorescens å bruke de samme prøvene som ovenfor, etter framgangsmåten fastsatt av produsenten (Promega, Madison, WI). For å analysere analyseresultatene, det totale celletallet og den positive celletallet i det samme område ble tellet for fem tilfeldige områder; resultatet ble presentert som en gjennomsnittlig forholdet mellom positiv celle nummer ut av det totale mobilnummer.
Statistical Analysis
statistisk signifikans for behandling av celler i
in vitro
cytotoksisitet analysen ble vurdert ved hjelp av Student
t
-test. For
in vivo
anti-tumor effekt assay, en log-lineær modell blandet med tilfeldig avskjære ble anvendt for å sammenligne betydningen av midlere tumorvolum hos hver gruppe. Den statistiske signifikans for behandling effekt på mikrotubuler, apoptose og celleformering i xenograft tumorvev ble vurdert ved hjelp av Kruskal-Wallis test (en-veis ANOVA).
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant i alle analysene
Resultater
Honokiol Reduserer Livskraftig og induserer apoptose i Human MDR kreftceller
MDR kreft cellelinjer KB-8-5, KB-C1 og KB-V1 ble hentet fra sine narkotika-sensitive motstykke KB-3-1 celler, og har vært mye brukt som en klinisk relevant modell for studiet av legemiddelresistens [14] [15]. Disse cellene utstilt forskjellige overfølsomhet for paclitaxel behandling. Som vist på fig. 1a, 1b, IC
50 verdier i MDR cellelinjer (KB-8-5:26.73 ± 1,01 ng /ml, KB-C1:195.0 ± 11,11 ng /ml, og KB-V1:6560.0 ± 439,52 ng /ml) ble økt med 16-, 117- og 4000-ganger, henholdsvis, sammenlignet med foreldre KB-3-1-cellelinjen (1,66 ± 0,09 ng /ml). I samsvar med deres motstandsdyktig fenotype, MDR cellelinjer vesentlig uttrykke den klassiske MDR markør P-glycoprotien (Fig. 1b). Interessant, en 72 h-behandling med honokiol effektivt redusert levedyktighet av MDR-celler (KB-8-5:3.22 ± 0,14 ug /ml, KB-C1:3.04 ± 0,30 ug /ml, KB-V1:2.77 ± 0,22 pg /ml), med IC
50-verdier tilsvarende de som i KB-3-1-celler (3,35 ± 0,13 ug /ml) (fig. 1c, 1d). Apoptose analyse viste videre at honokiol indusert apoptose i en tids- og doseavhengig måte (fig. 1E). 24 timer etter honokiol behandling, andelen av apoptotiske KB-3-1-celler var 11,9 ± 3,9% (5 ug /ml av honokiol), 32,9 ± 0,9% (10 ug /ml), og 47,1 ± 2,7% (15 ug /ml); andelen av apoptotiske celler øket til 18,4 ± 2,1%, 51,5 ± 0,6% og 65,3 ± 1,6%, henholdsvis, etter en 48 h-behandling, som ble ytterligere øket til 72 timer. Honokiol også induserte en lignende grad av apoptose i andre MDR celler, inkludert KB-8-5, KB-C1 og KB-V1 (fig. 1e). For eksempel, en 48-timers behandling med 10 ug /ml honokiol resulterte i apoptose i 51,5% av KB-3-1-celler, 52,7% av KB-8-5-celler, 52,9% av KB-C1-celler og 67,6% av KB-V1-celler, respektivt. Disse data er i overensstemmelse med den levedyktighet analyse (Fig. 1c, 1d), og antyder at honokiol er en potent cytotoksisk middel i KB-cellene, uavhengig av deres forskjellige paclitaxel-følsomhet.
(a, b) Vekst inhibering virkning av paclitaxel og p-gp uttrykk i KB-3-1, KB-8-5, KB-C1 og KB-V1 celler. IC
50 verdier av paclitaxel i resistent KB-8-5, ble KB-C1 og KB-V1 celler økt med 16-, 117-, og 4000 ganger henholdsvis i forhold til foreldre KB-3-1 celler . (C, d) Veksthemming effekten av honokiol i KB-3-1, KB-8-5, KB-C1 og KB-V1 celler. IC
50 verdier av honokiol i resistent KB-8-5, KB-C1 og KB-V1 celler var lik som i foreldre KB-3-1 celler. (E) Honokiol induserer apoptose i KB-celler. KB-3-1 og KB-8-5-celler ble behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol for 24, 48 og 72 timer. KB-C1 og KB-V1-celler ble behandlet med honokiol i 48 timer. Apoptose ble målt med annexin V-fykoerytrin farging. * Indikerer statistisk signifikante p-verdier (*, versus kontroll, p 0,05; **, kontra 5 mikrogram /ml, p 0,05).
Honokiol induserer Mitochondria- og død reseptor (DR) – avhengige apoptose i humane kreftceller
Vi undersøkte mekanismen for honokiol-indusert apoptose i KB-celler. Som vist på fig. 2a-c, honokiol behandling indusert spaltning av PARP og caspase-3 i en dose- og tidsavhengig måte i alle de testede KB-cellene, noe som indikerer aktivering av apoptotiske signaler. Western blot-analyser fant at honokiol ikke bare indusert frigjøring av cytokrom
c
i cytoplasma på en doseavhengig måte (fig. 2d), men også økt ekspresjon av DR5 (Fig. 2d), en flate reseptor for pro-apoptotiske ligander Apo2L /TRAIL. Samlet utgjør disse data tyder på at honokiol kunne samtidig aktivere mitochondria avhengig (intrinsic) apoptose og DR-avhengige (ytre) apoptose i KB-celler.
(a) KB-3-1 celler og (b) KB -8-5-celler ble behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol til 24, 48 timer. Full-lengde og spaltet PARP, kløyvde caspase-3 og β-actin som en lasting kontroll ble oppdaget av immunblot hjelp helcellelysater. (C) KB-C1 og KB-V1-celler ble behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol i 48 timer. Spaltes PARP ble påvist ved immunblotting ved bruk av helcellelysater. (D) Øvre panel, KB-8-5-celler ble behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol i 48 timer. Cytoplasmisk og mitokondrielle fraksjoner ble separert og immunoblottet med cytokrom c (Cyto C) antistoff. COX4 (en mitokondrie protein) ble anvendt for å vise effektiviteten av cellefraksjonering. Nedre panel, KB-8-5-celler ble behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol for 24 og 48 timer. DR5 ble påvist ved immunblotting ved bruk av helcellelysater. Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger, og representative data presenteres.
Honokiol Hemmer EGFR-STAT3 signalering i humane kreftceller
EGFR-STAT3 signalveien spiller en viktig rolle i regulering av vekst og overlevelse hos kreftceller. Vi undersøkte effekten av honokiol på flere viktige komponenter i EGFR-STAT3 signalveien. KB-3-1 og KB-8-5-celler ble behandlet med honokiol (5 ug /ml) i 0,5, 1 og 2 timer. Western blot-analyse ved bruk av de totale cellelysatene viste en markert redusert fosforylering av EGFR ved Try1173, en indikator på aktivert EGFR (fig. 3a). Vi videre undersøkt fosforylering status for STAT3 (Tyr705), Akt (Ser473), og ERK (Thr202 /Tyr204), tre kjent EGFR nedstrøms signale komponenter. Interessant, honokiol behandling hurtig hemmet phosphorlylation av STAT3 og AKT, men hadde ingen virkning på ERK-fosforylering (fig. 3ab). For ytterligere å undersøke hvorvidt ekspresjon nivå av EGFR og dens nedstrøms målproteiner blir også hemmet av honokiol behandling (5 ug /ml), behandlet vi celler for 24, 48 og 72 timer. Som vist på fig. 3CD, honokiol behandling hemmet protein ekspresjon av EGFR, STAT3, ERK, og AKT på en tidsavhengig måte i KB-3-1 og KB-8-5-celler. Tilsvarende, fosforylering av disse proteinene ble redusert ved honokiol behandling (Fig. 3CD). Konsekvent, uttrykket nivåer av tre kjente Stat3 målgener, dvs. Survivin, Bcl-2 og Mcl-en, ble dramatisk redusert etter honokiol behandling (Fig. 3e).
KB-3-1 og KB- 8-5 celler ble behandlet med 5 pg /ml honokiol for kort tid (0,5, 1, eller 2 h) eller lang tid (24, 48, eller 72 h). Helcellelysater ble immunoblottet for de angitte proteiner. Effekten av honokiol på tidlige tidspunkter: (a) fosforylering av EGFR og STAT3; (B) Honokiol reduserer fosforylering av AKT og ERK. Effekten av honokiol ved sene tidspunkter: (c) fosforylering og ekspresjon av EGFR og STAT3; (D) fosforylering og ekspresjon av AKT og ERK; (E) uttrykk for survivin, Bcl-2, Mcl-en. (F) Honokiol hemmer EGFR-signaleringsreaksjonsveien og nedregulerer STAT3 målgener på en doseavhengig måte. KB-3-1 og KB-8-5-celler ble behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol i 48 timer. Helcellelysater ble immunoblottet for de angitte proteiner. (G) Honokiol hemmer EGFR-STAT3 veien i KB-C1 og KB-V1 celler. KB-C1 og KB-V1-celler ble behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol i 48 timer. Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger, og representative data presenteres.
Vi neste undersøkte doseavhengig respons av EGFR-STAT3 aliserte til honokiol behandling i KB-3-1 og KB-8 -5 celler. Som vist på fig. 3f, ekspresjon og fosforylering av EGFR (Try1173) ble redusert i nærvær av 5 eller 10 ug /ml honokiol (48 h), og ble ytterligere redusert ved en dose på 15 pg /ml honokiol (fig. 3f). Konsekvent, ekspresjon og /eller fosforylering av EGFR nedstrøms signalkomponentene, inkludert ERK, Akt, STAT3, Survivin, Bcl-2 og Mcl-1, ble også dramatisk inhibert på en doseavhengig måte (fig. 3f). En tilsvarende effekt av honokiol på EGFR-signale STAT3 ble også observert i både KB-C1 og KB-V1-celler (fig. 3g). Av særlig interesse, fant en RT-PCR-analyse som honokiol inhibering av Survivin ekspresjon kan involvere undertrykkelse av Survivin transkripsjon på mRNA-nivå (fig S1).
Honokiol Øker in vitro Cytotoksisitet av paclitaxel i MDR Cancer Cells
Vi har undersøkt hvorvidt hemming av survivin, Bcl-2 og Mcl-1 av honokiol kunne bevisst MDR kreftceller til konvensjonell kjemoterapi som palictaxel. Som vist på fig. 4, 24-timers behandling med enten honokiol (5 ug /ml) eller paclitaxel (450 ng /ml) resulterte i ≤20% av apoptose i KB-C1-celler, mens kombinert behandling med både honokiol og paclitaxel resulterte i omtrent 30% apoptose . Dessuten, på 48 h og 72 h tidspunkter, den kombinerte behandling mer effektivt indusert apoptose (76% og 86%, henholdsvis) i KB-C1 celler enn enten som monoterapi (≤25%) eller bærerkontroll. Konsekvent, den kombinerte behandlingen var mer effektive i å indusere apoptose enn enten monoterapi i MDR KB-8-5 og KB-V1-celler (fig. 4). Ved hjelp av KB-8-5-celler som et eksempel, en kombinasjonsindeksen (CI) analyse bekreftet den synergistiske effekten av kombinert behandling med honokiol og paclitaxel i å redusere levedyktigheten av MDR-kreftceller (tabell S1).
(a ) KB-8-5, (b) KB-C1, og (c) KB-V1 celler ble behandlet med 5 ng /ml honokiol, paclitaxel (15 ng /ml for KB-8-5, 450 ng /ml for KB-C1, og 6 ug /ml for KB-V1), eller en kombinasjon av to medikamenter i de angitte konsentrasjoner for 24, 48 og 72 timer. Apoptose ble målt. * Indikerer statistisk signifikante p-verdier (*, kombinasjon versus honokiol, p 0,05; **, kombinasjon versus paclitaxel, p 0,05). Alle forsøk ble gjentatt tre ganger.
Western blot-analyse videre funnet at den kombinerte behandling med honokiol og paclitaxel var mer effektiv enn noen av midlene alene til å indusere spaltingen av caspase-3, PARP, og frigjørings av cytokrom
c
fra mitokondriene i KB-8-5-celler (fig. 5a, 5b). En 48-timers behandling med honokiol alene eller kombinasjonen av honokiol og paclitaxel reduserte ekspresjon og fosforylering av EGFR, så vel som andre viktige EGFR-STAT3 signaleringskomponenter, inkludert STAT3, p-STAT3 (Tyr705), ERK, p-ERK ( Thr202 /Tyr204), Akt og p-Akt (Ser473). Proteinet ekspresjon av Survivin, Bcl-2 og Mcl-1 ble også betydelig redusert ved behandling med honokiol eller kombinasjonen av honokiol og paclitaxel. Interessant er imidlertid behandling med paclitaxel alene ikke har signifikant effekt på disse signalkomponenter eller målgener av EGFR-STAT3 veien (fig. 5c).
(a) Honokiol forsterker paclitaxel indusert PARP og caspase- 3 cleavage i KB-8-5 celler. Cellene ble behandlet med 5 pg /ml honokiol, 15 ng /ml paclitaxel, eller kombinasjonen av de to medikamenter for 24, 48 og 72 timer. Full-lengde og spaltet PARP, kløyvde caspase-3 og β-actin som en lasting kontroll ble oppdaget av immunblot hjelp helcellelysater. (B) Honokiol forbedrer paclitaxel indusert frigjøring av cytokrom
c
i cytoplasma i KB-8-5 celler. Cellene ble behandlet med 5 pg /ml honokiol, 15 ng /ml paclitaxel, eller en kombinasjon i 48 timer. Cytoplasmisk og mitokondrielle fraksjoner ble separert og immunoblottet med cytokrom c (Cyto C) antistoff. COX4 (en mitokondrie protein) ble anvendt for å vise effektiviteten av cellefraksjonering. (C) Honokiol hemmer EGFR-STAT3 signalveien og nedregulerer STAT3 mål genuttrykk i KB-8-5 celler. Cellene ble behandlet med 5 pg /ml honokiol, 15 ng /ml paclitaxel, eller en kombinasjon i 48 timer. Helcellelysater ble immunoblottet for de angitte proteiner. (D) Paclitaxel induserer microtubule polymerisasjon i KB-8-5 celler. Legemiddelindusert stabilisering av mikrotubuli som vist ved en økning i mikrotubulus polymermasse som resulterer i bunting ble observert ved behandling med både paclitaxel og kombinasjonen; imidlertid, honokiol alene ikke var effektiv i mikrotubuli-stabilisering (forstørrelse 400x). Cellene ble behandlet med 5 pg /ml honokiol, 15 ng /ml paclitaxel, eller en kombinasjon i 24 timer. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger, og representative data er presentert.
Paclitaxel utøver sin antitumoraktivitet ved binding til tubulin inne i lumen av mikrotubuli, noe som resulterer i polymerisering mikrotubulus, stabilisering og forstyrrelse av mikrotubuli dynamikk, forårsaker mitotisk arrest og apoptose i prolifererende celler. For å undersøke om honokiol kan forbedre paclitaxel indusert microtubule polymerisasjon og stabilisering, undersøkte vi effekten av hver behandling på mikrotubuli i KB-8-5 og KB-C1 celler. Medikament-indusert stabilisering av tumorcellene «interfase mikrotubuli, som vist ved en økning i mikrotubulus polymermasse som resulterer i bunting, ble observert ved behandling med både paclitaxel og kombinasjonen; imidlertid, honokiol alene var ikke effektiv i dannelsen av mikrotubul bunter (fig. 5d). Sammen er disse dataene indikerer at honokiol forbedrer
in vitro
cytotoksisitet av paclitaxel i MDR kreft, kan være gjennom hemming av EGFR-STAT3 overlevelse signalering.
Honokiol Forbedrer in vivo Effekt av Paclitaxel i MDR Cancer xenografttumorer
Vi har evaluert antitumor effekt av honokiol, paclitaxel, og deres kombinasjon i behandling av MDR kreft i KB-8-5 xenograft modell. Behandlingen ble fortsatt i 4 uker. Som vist på fig. 6a, ved en dose på 20 mg /kg en gang per uke, en 4-ukers injeksjon av paclitaxel alene ikke signifikant hemme veksten av KB-8-5 subkutane tumorer, sammenlignet med bærerkontrollen (p = 0,917). Behandling med honokiol alene (50 mg /kg, 3 ganger pr uke, via i.p.) litt undertrykket tumorvekst, selv om forskjellen var ikke signifikant (p = 0,194) (Fig. 6a). I motsetning til dette kombinasjonsbehandling dramatisk hemmet veksten av KB-8-5 tumorer, sammenlignet med alle andre grupper (vs kontroll: p 0,0001, sammenlignet med honokiol: p = 0,036; vs paclitaxel: p = 0,004). Den gjennomsnittlige tumorvolumet i hver behandlingsgruppe på endepunktet var 2585.4 ± 510,0 mm
3 (kontroll), 1810.2 ± 483,2 mm
3 (honokiol), 2591.3 ± 726,2 mm
3 (paclitaxel), og 573,9 ± 146.1mm3 (kombinasjon). Representative mus fra hver gruppe er vist i (fig. 6c). Disse resultatene indikerer at honokiol kunne gi en betydelig forsterke antitumor-aktivitet av paclitaxel i MDR-kreft xenograft tumorer.
(a) Tumorvekst av KB-8-5-xenografter ble signifikant hemmet i kombinasjons-behandlede gruppe sammenliknet med den kontroll (p 0,0001), honokiol (p = 0,0356) og paclitaxel (p = 0,004) behandlede grupper. Tumorvolumer i honokiol (p = 0,1942) ble behandlet gruppe og paclitaxel (p = 0,9165) behandlede gruppe viste ingen signifikant forskjell sammenlignet med kontroll. (b) Kroppsvektene til mus i alle grupper. Kroppsvektene til mus i alle fire gruppene var like. (C) Representative mus fra hver gruppe. (D) Histopatologisk analyse av store organer (lever, milt, nyre, hjerte og lunge) fra kontroll og kombinasjonsbehandlingsgruppe. (e) Effekt av kombinasjonsbehandling av honokiol og paclitaxel på celledelingen, proliferasjon og apoptose in vivo. Parafininnstøpte vevssnitt fra forskjellige behandlingsgrupper ble immunofarget med anti-KI-67 for celleproliferasjon, og TUNEL-farging for påvisning av apoptotiske celler. Apoptotiske celler er vist i grønt; DNA kontra med DAPI i blått (forstørrelse 200x).
Vi har evaluert systemisk toksisitet av honokiol, paclitaxel og kombinasjonsbehandling i KB-8-5 xenograft modell. Sammenlignet med kontrollgruppen, kroppsvekt hos mus i alle de tre behandlingsgruppene var like, noe som indikerer en ubetydelig toksisitet under de testede betingelser (Fig. 6b). Konsekvent, analyserer histopathologic fant ikke noe betydelig vevsskade i de store organer (inkludert lever, milt, nyre, hjerte og lunge) samlet inn fra alle behandlingsgrupper, inkludert kombinasjonsbehandling (Fig. 6d).
videre utført IHC analyse for å undersøke
in vivo
effekten av hver behandling på uttrykk for generelle kreft biomarkører. Den kombinerte behandlingen reduserte betydelig vev nivået av Ki-67 i KB-8-5 tumorer (prosentandel av Ki-67 positive celler: 3,84 ± 1,10), sammenlignet med den i kontrollgruppen (11,96 ± 2,86; p 0,001) , honokiol gruppen (7,18 ± 2,07; p = 0,027), eller paclitaxel gruppe (11,68 ± 1,82; p 0,001) (figur 6e.). Konsekvent, TUNEL-analysen viste en signifikant økning i apoptotiske tumorceller i tumorvev fra kombinasjonsgruppen (7,07 ± 2,11) sammenlignet med det i kontrollgruppen (1,64 ± 0,17; p 0,001), honokiol gruppe (5.45 ± 1.19; P 0,05) og paclitaxel-gruppen (3,97 ± 3,58; P = 0,08) (figur 6e).. Disse resultatene indikerer at honokiol kunne bevisst MDR kreftceller til paclitaxel gjennom induksjon av apoptose.
Diskusjoner
Til tross for en viss suksess i forbigående kontrollere de kliniske symptomene på kreft med cellegift, en betydelig andel av pasientene utvikle «multiresistens», eller MDR, og uunngåelig fremgang uten kur. Det haster med å utvikle nye strategier for å overvinne MDR og forbedre effektiviteten av kjemoterapi. I denne studien undersøkte vi den potensielle nytte av den naturlige forbindelsen honokiol i behandling av kreft ved bruk av kjemoresistent prekliniske modeller. Vi demonstrerte at honokiol kan effektivt indusere celledød i kreftceller uten hensyn til deres resistens mot kjemoterapi stoffet paclitaxel. Betydelig, honokiol markert øket
in vivo
effekten av paclitaxel i å hemme veksten av MDR kreft i en xenograft modell. Vi videre utstyrt molekylære bevis som støtter at honokiol indusert apoptose og forbedret kjemoterapi gjennom hemming av EGFR-STAT3 signalering og nedregulering av flere overlevelses faktorer, blant annet survivin, Bcl-2 og Mcl-en. Disse observasjonene indikerer at honokiol kan være lovende i sensibiliserende kreftceller til kjemoterapi og forbedre paclitaxel effekt i kliniske settinger.
EGFR overekspresjon har vært nært knyttet til tumorprogresjon, terapeutisk motstand og dårlig klinisk resultat i hode og nakke kreft og andre krefttyper [16], [17], [18], [19]. EGFR-signaleringsreaksjonsveien, herunder flere nedstrøms reaksjonsveier, for eksempel PI3K /AKT, ERK1 /2, JAK /STAT3 og mTOR /NF-kB, spiller en viktig rolle i regulering av proliferasjon, overlevelse, migrasjon og chemoresistance i kreftceller. EGFR-signalering, derfor blir aktivt fulgt som et lovende mål å utvikle therapeutics for bestandig og hode- og halskreft og andre krefttype med små molekyl hemmere og antistoffer [20], [21]. I denne studien demonstrerte vi at honokiol redusert både fosforylering og ekspresjon av EGFR, noe som tyder på en inhibering av EGFR-signalisering som er i overensstemmelse med tidligere studier [5]. Som forventet ble uttrykket og aktiviteten av flere viktige komponenter av EGFR-signalering, inkludert AKT, ERK og STAT3, også hemmet i kjemoresistent KB celler ved honokiol behandling. En fersk studie rapporterte at honokiol nedregulerer heat shock protein (HSP) 90 i brystkreftceller [22]. HSP90 og andre chaperonproteiner slik som HSP70 og HSP40 regulere EGFR degradering. Avbrytelse av HSP70 /HSP90-folding syklus fører til ubiquitinylation og nedbrytning av EGFR [23] [24]. Derfor er det mulig at honokiol fremmer EGFR degradering og hemmer EGFR signaliserer gjennom en HSP90 avhengig mekanisme.
Flere Stat3 målgener som survivin, Bcl-2 og Mcl-en, har sentrale roller i regulering
