Abstract
G-protein-koblede reseptorer (GPCR) er den største familie av celleoverflatemolekyler som spiller viktige rolle /s i en rekke biologiske og patologiske prosesser, inkludert kreft. Tidligere studier har understreket betydningen av Wnt7a signalering via kognatreseptoren Frizzled9, en GPCR, i hemming av celleproliferasjon, forankringsuavhengig vekst, og reversering av transformert fenotype i ikke-småcellet lungekreft primært gjennom aktivering av tumor suppressor, PPARy. Men G-protein effektorer som par til dette viktige tumor suppressor veien ikke er identifisert, og er av potensiell terapeutisk interesse. I denne studien, ved hjelp av to uavhengige Wnt7a /Frizzled9-spesifikke lese-outs, identifiserer vi G
α16 som en roman nedstrøms effektor av Wnt7a /Frizzled9 signalering. Interessant, G
α16 uttrykket er sterkt nedregulert, både på messenger RNA nivåer og protein nivå, i mange ikke-småcellet lungekreft cellelinjer. I tillegg, gjennom gen-spesifikke knock-downs og uttrykk for GTPase-mangelformer (Q212L) av G
α16, vi også etablere G
α16 som en roman regulator av ikke-småcellet lungekreft celleproliferasjon og forankringsuavhengig cellevekst. Tatt sammen, våre data ikke bare fastslå viktigheten av G
α16 som en kritisk nedstrøms effektor av den ikke-kanonisk Wnt signalveien, men også som et potensielt terapeutisk mål for behandling av ikke-småcellet lungekreft.
Citation: Avasarala S, Bikkavilli RK, Van Scoyk M, Zhang W, Lapite A, Host L, et al. (2013) Heterotrimeric G-Protein, G
α16, er en kritisk Nedstrøms Effector of Non-Canonical Wnt signalnettverk og en potent hemmer av transformert cellevekst i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (10): e76895. doi: 10,1371 /journal.pone.0076895
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 29. mai 2013; Godkjent: 28 august 2013; Publisert: 18 oktober 2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en Merit Award fra US Department of Veterans Affairs, National Institutes of Health (NIH) gir R01CA1385282522717 og 5R21CA153268- 02 til RAW. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Co-forfatter, er Dr. Robert Winn en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Forfatterne hevder at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Wnts skilles glykoproteiner som transduce viktige signaloverførings hendelser som spiller viktige roller, ikke bare under pattedyr utvikling, men også i mange menneskelige sykdommer [1 ]. Wnts bind til frizzled reseptorer (Fzds), og aktivere enten en kanonisk eller β-catenin avhengige sti eller ikke-kanoniske eller β-catenin uavhengige trasé via c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 mitogen aktivert protein kinase (MAPK ) sti eller peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor y-baner (PPARy) [2] – [7]. Avvikende aktivering av Wnt signal har vært innblandet i mange sykdommer, inkludert kreft [1], [8]. Vi har tidligere identifisert som Wnt7a er tapt i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [5], [6], og restaurering av Wnt7a signalering i NSCLC cellelinjer fører til reversering av transformert fenotype [6], avslører Wnt7a signaliserer som en roman svulst undertrykkende sti i lungekreft. Imidlertid er mekanismen for Wnt7a signaltransduksjon fra plasmamembranen til cytoplasma og cellekjernen forblir stort sett ukjent.
superfamilien av G-protein-koblede reseptorer (GPCR) er det største kjente familien av proteiner i pattedyrgenomet [9] og deres dysfunksjon er forbundet med en rekke utbredte sykdommer hos mennesker. Faktisk, vekst eksperimentelle og kliniske data indikerer at GPCR ha en kritisk rolle ikke bare i progresjon av kreft og metastase, men også i mange andre menneskelige sykdommer, slik GPCR de største mål for dagens terapeutiske midler [10]. Det har tidligere blitt vist at GPCR er forbundet med autokrin vekst i småcellet lungekreft (SCLC, [11], [12]). Frizzleds er rette inngår i den G-protein-koblet reseptor (GPCR) superfamilien som de viser syv transmembrane domene struktur, følsomhet for pertussis toksin og modulering av intracellulær kalsium. Interessant er det ti forskjellige Fzds klonede hittil. Selv om, viser lignende heptahelical struktur alle Fzd reseptorer, er det fortsatt unnvikende hvordan disse reseptorene signal til forskjellige nedstrøms effektorer. En annen kardinal eiendom GPCRs er at de signaliserer via heterotrimeric G-proteiner [13] -. [19], noe som tyder på at heterotrimeric G-proteiner kan modulere effekten av Fzds
Vi har tidligere vist at restaurering av Wnt7a /Fzd9 signale hemmet både celleproliferasjon og forankrings-uavhengig vekst, fremmet cellulær differensiering, og reversert den transformerte fenotypen i NSCLC-celler via aktivering av PPARy og stimulering av E-cadherin-proteiner [5], [20]. Men G-protein /s formidling av anti-tumorigen rollen Wnt7a /Fzd9 signale fortsatt ukjent. I denne studien, benyttet vi Wnt7a-stimulert PPARy og E-cadherin aktivering som avlesninger og identifisere heterotrimeric G-protein, G
α16, som en viktig nedstrøms effektor av Wnt7a /Fzd9 signalering. Interessant, vi også observere redusert uttrykk for G
α16; både i transkripsjon nivå og på proteinnivå, i mange NSCLC-cellelinjer. I tillegg bruker genet spesifikke knock nedturer og uttrykk for konstitutivt aktive mutanter av G-proteiner, vi viser også at G
α16 er kritisk for Wnt7a /Fzd9 hemming av forvandlet vekst i NSCLC. Videre har vi også etablere G
α16 som en roman formidler av Wnt7a /Fzd9-mediert aktivering av ERK5 og kjernefysisk reseptor tumor suppressor PPARy. Til sammen G
α16 er vist her å være en roman regulator av NSCLC celleproliferasjon og forankringsuavhengig cellevekst.
Resultater
Identifikasjon av Heterotrimeric G-proteiner Regulerings Wnt7a /Fzd9 signale
for å vurdere mulig involvering av G-protein /s på Wnt7a /Fzd9 signalering, har vi gjort bruk av konstitutivt aktiv G
a-subenheter av G-proteiner som er mangelfull i GTPase aktivitet, og undersøkt deres effekter på to veletablerte Wnt7a /Fzd9-avhengige lese-outs
nemlig.,
PPAR-avhengige gentranskripsjon og E-cadherin avhengig gentranskripsjon hos NSCLC cellelinjer [5], [20]. NSCLC cellelinjer (H157 og H2122) ble transient transfektert med enten en tom vektor eller et panel av konstitutivt aktiv G
a-subenheter av G-proteiner (G
αi2Q205L, G
αoQ205L, G
αqQ209L , G
αzQ205L, G
α12Q229L, eller G
α16Q212L) sammen med en PPAR-responselement (RE) luciferase reporter vektor. Virkningene av ekspresjonen av konstitutivt aktive G- proteiner på PPAR-avhengige gentranskripsjon ble senere bestemt ved å måle luminescens i cellelysatene (Fig. 1A, B). Interessant, uttrykk for G
α16Q212L, men ikke G
αi2Q205L, G
αoQ205L, G
αzQ205L, eller G
α12Q229L, resulterte i en fire ganger økning i PPAR-RE luciferase aktivitet i begge cellelinjene som ble testet, en effekt som minner om Wnt7a /Fzd9-stimulerte PPAR-RE luciferase-aktivitet alene (fig. 1A, B). For de positive kontroller, siden, har H157 og H2122 celler redusert eller ingen Wnt7a ekspresjon ble cellene transfektert med ekspresjonsplasmidene Wnt7a [5], [20]. H157-celler ble også transfektert med plasmid Fzd9, som de gjør ikke å uttrykke endogen Fzd9 [5], [20]. Det var også interessant å merke seg at uttrykket av G
αqQ209L også indusert PPAR-RE-luciferase aktivitet,
riktignok
mindre effektivt enn G
α16Q212L (Fig. 1A, B). Effektene av enten G
α16Q212L eller G
αqQ209L uttrykk var spesifikke for PPARy aktivitet, men ikke til PPARδ aktivitet, ettersom uttrykket av G
α16Q212L, G
αqQ209L eller Wnt7a /Fzd9 i H157 og H2122 unnlatt å stimulere PPARδ-RE luciferase aktivitet, en spesifikk reporter for PPARδ (data ikke vist). Siden, Wnt7a /Fzd9 signale unnlatt å stimulere PPARa aktivitet (data ikke vist), vi derfor ikke forsøke å teste effekten av G
α16Q212L, G
αqQ209L på PPARa aktivering.
Effekter av konstitutivt aktiv G
a-subenheter på Wnt7a /Fzd9-avhengige lese-outs. NSCLC-cellelinjer, ble H157 (A) eller H2122 (B) transfektert med enten tom vektor eller konstitutivt aktiv G
a-subenheter av G-proteiner sammen med PPAR-RE-luciferase reporter og CMV-β-galaktosidase rapportør vektorer. Etter 48 timer ble cellene lysert og luciferase-aktivitet ble målt som beskrevet i fremgangsmåtene. NSCLC-cellelinjer, ble H157 (C) eller H2122 (D) transfektert med enten tom vektor eller konstitutivt aktiv G
a-subenheter av G-proteiner sammen med E-cadherin promoter-luciferase-rapportør og CMV-β-galaktosidase reporter vektorer. Etter 48 timer ble cellene lysert og luciferase-aktivitet ble målt som beskrevet i fremgangsmåtene. Luciferase-verdier ble normalisert til CMV-β-galaktosidase-verdier og var representert i diagrammet. Konstitutivt aktiv G
α-subenheten-indusert PPRE avhengig gentranskripsjon eller E-cadherin promoter aktivitet ble representert som fold endring over tom vektor kontroll. Data representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre separate eksperimenter. **,
p
0,01; versus tom vektor kontroll.
E-cadherin er et velkjent markør for epitelial differensiering [21], [22] og har tidligere vist seg å være en viktig nedstrøms mål for både Wnt7a /Fzd9 signale og PPARy uttrykk i NSCLC [6], [23]. Vi har derfor også vurdert effekten av konstitutivt aktiv G-proteiner på E-cadherin promoter aktivitet hos NSCLC celler (H157 og H2122). I likhet med effektene på PPARy-aktivitet, ekspresjon av G
α16Q212L induserte en sterk økning av E-cadherin promoter-aktivitet i begge cellelinjene som ble testet sammenlignet med tom vektorkontroll (fig. 1 C, D). Virkningene av G
αqQ209L ekspresjon på E-cadherin promoter-aktivitet, selv om signifikante, var mindre potent enn den for G
α16Q212L uttrykket (fig. 1 C, D). Samlet utgjør disse resultatene tyder på en sterk tilknytning til G-proteiner, G
α16 og G
αq, med aktivering av PPARy og økt cellulær differensiering som vist ved økt E-cadherin uttrykk.
G
α16 Expression er tapt i NSCLC
Vi har identifisert G
α16 og G
αq som viktige formidlere av PPARy og E-cadherin uttrykk i NSCLC cellelinjer (fig. 1). Det var interessant å merke seg at både G
α16 og G
αq tilhører GQ familien av G-proteiner. Men siden G
αqQ209L uttrykk ikke bare viste mindre potent innvirkning på PPARy aktivitet og E-cadherin uttrykk, men hadde også dårlig og inkonsekvent effekter på NSCLC spredning og forankring uavhengig cellevekst (data ikke vist), fokuserte vi på å vurdere rollen G
α16, men ikke G
αq. For å etablere en potensiell rolle for G
α16 i NSCLC, vi først analysert uttrykket nivåer av G
α16 i et panel av NSCLC-cellelinjer ved bruk av kvantitativ RT-PCR (qPCR, fig. 2A). For disse eksperimentene ble total RNA ekstrahert fra ikke-transformerte lunge bronkial epitelceller (Beas2B), lunge adenokarsinom (A549, H2122), plateepitelkarsinom (H157) og store cellekreft cellelinjer (H661 og H1299), omvendt transkribert og cDNA ble senere brukt til å måle nivåene av G
α16 ekspresjon (fig. 2A). Interessant, G
α16 ekspresjon ble alvorlig svekket i alle NSCLC-cellelinjene som ble testet sammenlignet med ikke-transformerte bronkiale epitel cellelinje (Beas2B, fig. 2A). Vi har også bestemt protein nivåer av G
α16 i den ikke-transformerte lunge bronkial epitelceller (Beas2B) og NSCLC cellelinjer ved hjelp av et antistoff spesifikt til G
α16 (Fig. 2B)
. Western blotting av NSCLC cellelysater avdekket et fullstendig tap i uttrykk for G
α16 (Fig. 2B). Selv om det ikke er noen påviselig mRNA uttrykk, H157 celler viste noen G
α16 protein uttrykk. Bare en spekulasjon, den påvisbare uttrykk for G
α16 i H157 kan skyldes lav protein omsetning. Tvert imot, NSCLC-cellelinjer og Beas2B uttrykk for lignende nivåer av G
αo (Fig. 2B), G-protein som er spesifikk for p-catenin avhengige signalveien [2], [24]. Siden, tap av heterozygositet (LOH) spiller en viktig rolle under inaktivering av tumorsuppressorgener (TSG), vi har også søkt etter LOH (segmentert genotype intensitet) på GNA15 /16 locus (G
α16) på vår lungekreft celle linjer ved hjelp av CONAN (Kopier nummer Analysis) verktøyet (https://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/conan/) fra Sanger Cancer Genome Project. Vi kunne oppdage LOH i H157, A549, H2122 og H661. I tillegg har vi også søkte på somatiske eksemplar nummer variasjoner (CNV) ved GNA15 /16 locus i humane lungekrefttilfellene. For dette formålet ble CNV data i 493 lunge adenokarsinom og 416 lunge plateepitelkarsinom pasienter ned fra Kreft Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov/) Project. Gene-nivå kopi tallanslag ble senere behandlet ved hjelp GISTIC2 [25] og TCGA Firehose rørledningen. Påfallende, mutasjonsstatus GNA15 /16 locus var 1,22% for homozygot slettinger og 53,14% for løssalgsslettinger i humane lunge adenokarsinom pasienter og 0,96% for homozygot slettinger og 41,34% for løssalgsslettinger i menneskelig lunge plateepitel karsinom pasienter. Disse dataene gir ytterligere bevis for tap av G
α16 i lungekrefttilfellene.
A, Real-time PCR-analyser av uttrykket av G
α16 i ikke-transform og NSCLC cellelinjer. Total RNA ble ekstrahert fra en ikke-transformert cellelinje (Beas2B) eller NSCLC-cellelinjer (H157, H2122, A549, H661 og H1299) og G
α16 ekspresjon ble kvantifisert ved å bruke sense: caccacgctagcctggtcatg og anti-sense: gcgcccttcttgctgccctcggg primere . β-aktin ble benyttet som en intern kontroll for normalisering. Data representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre separate eksperimenter utført i duplikater.
##
p
0,01; versus kontroll (Beas2B). B, Western blot-analyse av G
α16 ekspresjon i ikke-transformerte og NSCLC-cellelinjer. Like mengder av totale cellelysater av en ikke-transformert cellelinje (Beas2B) eller NSCLC-cellelinjer (H157, H2122, A549, H661 og H1299) ble separert på en SDS-PAGE-geler, overført på nitrocelluloseblotting og «blots» ble senere undersøkt med enten anti-G
α16, anti-G
αo eller anti-p-aktin antistoffer.
rolle G
α16 i NSCLC celleproliferasjon og Anchorage- uavhengige cellevekst
Tidligere studier har etablert en viktig rolle for PPARy i NSCLC celleproliferasjon, forvandlet vekst, metastase, og epitelial differensiering [23], [26]. Tilsvarende har vi også etablerte viktigheten av Wnt7a /Fzd9 signalering i redusert transformert vekst og økt cellulær differensiering i NSCLC via induksjon av PPARy [5], [20]. Hvis G
α16 er en viktig formidler av Wnt7a /Fzd9 signalering, resonnere vi at G
α16 kan også potensielt megle transformert cellevekst i NSCLC. For å avhøre den spesifikke involvering av G
α16 i NSCLC celleproliferasjon og transformert cellevekst, benyttet vi to tilnærminger: (1) effekten av små forstyrrelser RNA (siRNAs) som er spesifikke for G
α16 og (2) uttrykk for en konstitutivt aktiv G
α16Q212L. Små forstyrrelser RNA (siRNAs) spesielt rettet mot enten G
α16 eller G
αo ble utviklet, testet for deres spesifisitet, og deretter brukt til å selektivt undertrykke G
α16 eller G
αo i Beas2B celler. SiRNA reagenser som spesifikt undertrykt enten G
α16 eller G
αo, å oppnå en 70% eller mer reduksjon i ekspresjon av hvert protein (Fig. 3A). Egge siRNAs designet av den kommersielle leverandøren ble testet som kontroller i enkelte undergrupper; de viste ingen kapasitet til å undertrykke enten G
α16 eller G
αo uttrykk (Fig. 3A). Behandling av ikke-transform bronkiale epitelceller (Beas2B, med G
α16 uttrykk) med G
α16-spesifikk sirnas betydelig økt celleformering som bestemmes av klonogene (Fig. 3B) og MTS celle proliferasjonsanalyser (fig. 3C). Mens, behandling av Beas2B celler med G
αo-spesifikke sirnas, et G-protein som er spesifikt for β-catenin-avhengige signalveien [2], [24], hadde ingen eller beskjeden effekt på celleproliferasjon priser, i Sammenlignet med kontroll siRNA behandlede celler, som bestemt ved klonogene (fig. 3B) og MTS celle proliferasjonsanalyser (fig. 3C), noe som indikerer en spesifikk assosiasjon av G
α16 og NSCLC celleproliferasjon. Hvis vår hypotese at G
α16 medierer NSCLC celleproliferasjon ble sann, da uttrykk for en konstitutivt aktiv, GTPase mangelfull (Q212L) mutant av G
α16 i NSCLC-celler bør resultere i redusert celleproliferasjon, selv i fravær av Wnt7a. Faktisk, forbigående ekspresjon av G
α16Q212L, men ikke G
αoQ205L, på H2122-celler resulterte i redusert celleproliferasjon som bestemmes av klonogene (fig. 3D), MTS celle proliferasjonsanalyser (fig. 3E), og /eller 5-dagers cellevekstkurve-analyse (fig. 3F). I tillegg stabil uttrykk for G
α16Q212L i H2122 celler også hemmet evnene til H2122 celler til å vokse på soft agar, en
in vitro
mål på cellulær transformasjon (Fig. 3G). Således, ved hjelp av flere distinkte og kraftfulle analyser, viser vi at G
α16 men ikke G
αo regulerer NSCLC celleproliferasjon og transformert cellevekst.
A. Beas2B celler ble transfektert med enten kontroll siRNA eller sirnas spesifikk for G
α16 eller G
αo. Totalt RNA ble isolert og analysert for ekspresjon av G
α16 eller G
αo ved hjelp av kvantitativ PCR. Normalisert G
α16 eller G
αo mRNA nivåer som for β-aktin mRNA var representert i grafene.
##
p
0,01; versus kontroll siRNA. Beas2B-celler ble transfektert med enten kontroll siRNA eller sirnas-spesifikk for G
α16 eller G
αo og celleproliferasjonsprosesser rater ble senere bestemt enten ved hjelp av en klonogene assay (B) eller en MTS-analyse (C) som beskrevet i Metoder. Øvre panel representerer gjennomsnitt ± SEM fra to uavhengige svært reproduserbare eksperimenter, mens representative bilder ble vist i nedre panel. Data representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige svært reproduserbare eksperimenter. *,
p
0,05; **,
p
0,01; versus kontroll siRNA. H2122-celler ble transfektert med enten tom vektor eller konstitutivt aktiv G
α16Q212L eller G
αoQ205L ekspresjonsvektorer og celleproliferasjon Hastighetene ble senere fastslått ved anvendelse av enten en klonogene assay (D), en MTS-analyse (E) eller fem- dag cellevekstkurve analyse (F), som beskrevet i fremgangsmåtene. Øvre panel representerer gjennomsnitt ± SEM fra to uavhengige svært reproduserbare eksperimenter, mens representative bilder ble vist i nedre panel. Data representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige svært reproduserbare eksperimenter.
#
p
0,05; G, H2122 celler ble transfektert med enten tom vektor eller konstitutivt aktiv G
α16 Q212L og evnene til de transfekterte celler til å vokse på soft agar ble senere analysert. Data representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige svært reproduserbare eksperimenter.
##
p
0,01; versus tom vektor kontroll.
Wnt7a stimulert ERK5 Aktivering er G
α16 Dependent
Vi har tidligere sett at uttrykket av Wnt7a /Fzd9 hos NSCLC cellene resulterer i robust aktivering av ERK5 [5]. Vi testet neste hvis rekombinant hWnt7a stimulering av Beas2B celler er også i stand til å aktivere ERK5; ved immunblotting av SDS-PAGE-gel-blots med antistoffer som er spesifikke for fosfo-ERK5 (Fig. 4A). Stimulering av Beas2B kulturer med rWnt7a resulterte i en rask aktivering av ERK5 nådde en topp i løpet av 15 minutter av behandlingen (fig. 4A). For å fastslå om Wnt7a /ERK5 signale ble opererer via G
α16, vi gjort bruk av G
α16 spesifikke siRNAs (Fig. 4B). I disse studiene, Beas2B-celler ble ko-transfektert med G
α16-spesifikk sirnas enten med eller uten Wnt7a ekspresjonsvektorer (Fig. 4B). Interessant, behandling med G
α16 spesifikke sirnas avskaffet evne Wnt7a å stimulere ERK5 aktivering (Fig. 4B). Hvis uttømming av G
α16 kan blokkere Wnt7a-mediert aktivering av ERK5, da uttrykk for konstitutivt aktiv form av G
α16 (Q212L) skulle forårsake ERK5 aktivering. For å teste denne hypotesen, vi har gjort bruk av en MEF2-C-avhengige luciferase reporter-konstruksjonen [27]. Dette reporter måler ERK5 kinaseaktivitet, som det er obligate for aktivering MEF2-C-avhengige gentranskripsjon [27]. Forbigående uttrykk for konstitutivt aktiv form av G
α16Q212L sammen med MEF2-C-luciferase reporter plasmider resulterte i en robust økning i luciferase aktiviteter som bestemmes i begge H157 (fig. 4C) og H2122 (fig. 4D) NSCLC cellelinjer. Videre G
α16Q212L-indusert MEF2-C-avhengige luciferase-aktivitet var følsomme for behandling av PD98059, som inhiberer MEK-1, 2, og 5 (Fig. 4C, D), men ikke av MEK1 /2 inhibitoren U0126 (data ikke vist), noe som indikerer spesifisiteten av vår analyse. Samlet utgjør disse data klart fast at G
α16 funksjon er avgjørende for Wnt7a-mediert ERK5 aktivering.
A, Beas2B celler ble serumsultede for to-PAGE-geler og senere undersøkt for ERK5 aktivering av sondering nitrocellulose blot med anti-pERK5 antistoffer og normalisert for lik belastning ved sondering med anti-ERK5 antistoffer. B, Beas2B celler ble transfektert med enten kontroll siRNA eller G
α16 spesifikke sirnas sammen med eller uten Wnt7a uttrykk vektor. Etter 48 timer ble cellene lysert og analysert for ERK5 aktivering ved sentret blottene med anti-pERK5 og ERK5 antistoffer. NSCLC-cellelinjer, H157 (C) eller H2122 (D) celler ble transfektert med enten tom vektor eller G
α16Q212L sammen med MEF2-C-avhengige luciferase reporter, etterfulgt av en behandling, enten uten eller med MEK-inhibitor PD98059 (20 pM ). Etter 24 timer, ble lysatene analysert for luciferase-aktivitet som beskrevet i Metoder. Data representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre separate eksperimenter. **,
p
0,01; versus tom vektor kontroll.
##
p
0,01; versus G
α16 Q212L.
G
α16 Regulerer Wnt7a stimulert PPARy Activation
Vi neste avhørt om uttømming av G
α16 blokkerer også langt nedstrøms signale effektor av Wnt7a /Fzd9 signaliserer
nemlig., etter PPARy [5]. H157 og H2122 celler ble ko-transfektert med G
α16 spesifikke sirnas enten med eller uten Wnt7a ekspresjonsvektorer og PPAR-RE luciferase reporter vektor (fig. 5A, B). Uttømming av G
α16, men ikke G
αo, selektivt blokkert Wnt7a-stimulert PPARy-aktivering i begge cellelinjene som ble testet (Fig. 5A, B). Konsistent for effektene av G
α16 uttømming på Wnt7a-stimulert PPARy-aktivering, ekspresjon av konstitutivt aktiv G
α16Q212L, men ikke G
αoQ205L, på H157 eller H2122 cellelinjer induserte en sterk økning av PPARy-aktivitet ( fig. 5C, D). Videre G
α16Q212L-induserte anti-proliferative virkninger på H2122 cellevekst ble opphevet ved forgiftning av de transfekterte celler med PPARy-inhibitor (T007090) i begge H157 (fig. 5E) og H2122 cellelinjer (fig. 5F). Disse dataene tyder sterkt på at de anti-proliferative effekter av G
α16 i NSCLC medieres via ERK5 (Fig. 4) og PPARy (Fig. 5).
NSCLC cellelinjer, H157 (A) eller H2122 (B) celler ble transfektert med enten kontroll siRNA eller G
α16 spesifikke sirnas sammen med PPAR-RE-luciferase reporter og enten uten eller med Wnt7a uttrykk vektor. Etter 48 timer, ble lysatene analysert for luciferase-aktivitet som beskrevet i Metoder. Data representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre separate eksperimenter. **,
p
0,01; versus tom vektor kontroll.
##
p
0,01; versus Wnt7a. NSCLC-cellelinjer, H157 (C) eller H2122 (D) celler ble transfektert med enten tom vektor eller konstitutivt aktiv G
α16 Q212L eller G
αo Q205L ekspresjonsvektorer sammen med PPAR-RE-luciferase reporter. Etter 48 timer, ble lysatene analysert for luciferase-aktivitet som beskrevet i Metoder. Data representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre separate eksperimenter. **,
p
0,01; versus tom vektor kontroll. NSCLC-cellelinjer, H157 (E) eller H2122 (F) ble transfektert med enten tom vektor eller konstitutivt aktiv G
α16Q212L. Etter 24 timer ble cellene behandlet enten med eller uten PPARy inhibitor (T0070907, 10 uM) som beskrevet i fremgangsmåtene. Celleproliferasjon Hastighetene ble senere fastslått ved anvendelse av en MTS-analyse som beskrevet i fremgangsmåtene. Data representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige svært reproduserbare eksperimenter.
##
p
0,01; versus tom vektor kontroll. **,
p
0,01; versus G
α16 Q212L + T007090.
Novel rolle for ROR1 /2 i Wnt7a /Fzd9 Signa
Det er vel etablert at aktivering av Wnt /β-catenin avhengig signalering krever ko-reseptorer low-density lipoproteiner (LRP5 /6) og G-protein, G
αo [24], [28] – [30]. Siden har vi etablert G
α16 som en kritisk formidler av Wnt7a /Fzd9 signalering (Fig. 1, 2, 3,4), vi neste vurdert for rollen som co-reseptorer, om i det hele tatt, i formidling Wnt7a /Fzd9 signalering. For disse studiene ble H157 og H1299 celler transfektert med enten tom vektor eller Wnt7a og Fzd9 ekspresjonsplasmider. Interessant, sondering cellelysatene som uttrykker Wnt7a /Fzd9 viste en sterk økning i ekspresjon av tyrosin-proteinkinase orphan-reseptorer, ROR1 /2 (Fig. 6A). Mens, ko-reseptorene kardinal til Wnt /β-catenin-avhengige signalveien, LRP6 eller dens aktiverte form (fosfor-LRP6-S1490) er upåvirket (Fig. 6A). I sterk støtte av våre funn, Wnt7a /Fzd9 signale også unnlatt å stimulere TOPFLASH aktivitet, en Wnt /β-catenin-spesifikke lese-out (Fig. 6B). Mens, under tilsvarende betingelser, Wnt7a /Fzd9 stimulert en sterk økning av PPAR-RE-avhengige gentranskripsjon, som forventet (fig. 6C). Til sammen disse dataene tyder på at Wnt7a /Fzd9 signalveien, i motsetning til det β-catenin avhengig signale mekanisme, kan signalisere via G-protein, G
α16 og co-reseptorer, ROR1 /2.
A, H157 og H1299 celler ble enten transfektert med tom vektor eller med Wnt7a og Fzd9 ekspresjonsvektorer. Etter 48-β-aktin antistoffer. H157-celler ble transfektert med enten tom vektor eller Wnt7a og Fzd9 ekspresjonsvektorer sammen med enten M50-TOPFLASH luciferase reporter (B) eller PPAR-RE-luciferase reporter (C). Positive kontroller som brukes i M50-TOPFLASH reporter eksperimenter er det β-catenin ekspresjonsvektor og i tilfelle av PPAR-RE-luciferase vektoren er den PPARy ekspresjonsvektor. Etter 48 timer, ble lysatene analysert for luciferase-aktivitet som beskrevet i Metoder. Data representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre separate eksperimenter. **,
p
0,01; versus tom vektor kontroll.
Diskusjoner
Wnt7a har tidligere vist seg å være viktig for normal epitel dannelse og for å opprettholde en normal epitelial fenotype i lungene [31]. Videre er Wnt7a uttrykk ofte tapt i NSCLC [32]. Vi har tidligere vist at re-ekspresjon av Wnt7a reverseres cellulær transformasjon, redusert forankrings-uavhengig vekst, og indusert epitelial differensiering i NSCLC-celler gjennom kognatreseptoren Fzd9 [5], [20]. Denne virkning er mediert, i det minste delvis, gjennom ERK5-avhengig aktivering av PPARy [5]. Viktigere, ikke Wnt7a /Fzd9 ikke aktivere den kanoniske Wnt /β-catenin signalveien. Frizzleds, medlemmer av GPCR-superfamilien [33], vise mange av landemerkene observert i praktisk talt alle GPCR, inkludert tilstedeværelse av syv hydrofobe transmembrane segmenter forutsagt for å danne alfa-viklingene, og tre intracellulære løkker, så vel som en cytoplasmatisk hale [33] , [34]. Av notatet, er Fzds også rapportert som nært forbundet med adapter molekyler, som det av beta arrestins, en velkjent adapter protein involvert i GPCR de-allergi [35] og regulatorer av G-protein signalering (RGS, [ ,,,0],36]).
G-proteiner er kardinal å GPCR alarm og har vist seg å være involvert i kanonisk Wnt /β-catenin signalering, ikke-kanoniske Wnt /Ca
2 + /cGMP-veien og planar celle polaritet trasé [34]. Hittil har G
αo og G
αq vist seg å være kritisk i løpet av pattedyr utvikling, og teratocarcinom stamcelledifferensiering som svar på onkogene Fzd1 stimulering [24]. Imidlertid tumor beskyttende rollene for G-proteiner, om noen, har ikke blitt identifisert. I denne studien har vi identifisert G
αq familie av G-proteiner som nye nedstrøms formidlere av Wnt7a /Fzd9-mediert aktivering av ERK5 og tumorsuppressorgenet PPARy. For første gang viser vi at G
αq familiemedlemmer, spesielt, G
α16 kan aktivere en ny ikke-kanoniske Wnt signalering. Den signalkaskade nedstrøms G
a proteiner innebærer varierte og komplekse kinaser som til slutt fører til regulert gentranskripsjon og endringer i cellefysiologi. Hver G
αq familiemedlem har vært implisert i regulering av en eller flere av mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) baner i cellekulturer, selv om den nøyaktige mekanismen /s for signalering er fortsatt uklar. I denne studien, viser vi også at G
α16 er nedstrøms effektor av Wnt7a /Fzd9 signalering som fører til aktivering av ERK5. Interessant, har andre studier vist at GPCR kan også stimulere ERK5 gjennom mekanismer som involverer G
αq og G
α12 /13, uavhengig av Rho, Rac1 og Cdc42 [37]. Men vi fikk ikke se noen aktivering av PPARy av G
α12 uttrykk (Fig. 1). Hittil G
αq-mediert signalisering MAPK er begrenset til aktivering av JNK1 /2 eller ERK1 /2, men ikke ERK5. I denne studien, viser vi også at et medlem av G
αq familie, G
α16, som en roman regulator av ERK5. Det er velkjent at G
αq familie (G
αq, G
α11, G
α14, G
α15 /16), ved aktivering, bindinger og stimulerer PLC-β- mediert inositolfosfat signalkaskade som fører til kalsium-mobilisering og PKCα aktivering via fosfolipid fosfatidylinositol bisfosfonat (PIP2), inositol-trifosfat (IP3) og diacyl glycerol (DAG, [38]). I de samme linjene, Wnt7a /Fzd9 signale også stimulert PLCβ og PKC (data ikke vist). Interessant nok PKCα har vist seg å være forbundet med redusert kreftcellevekst via inhibering av S-fase og opp regulering av p21 [39].
