Abstract
Endometriekreft, den vanligste gynekologisk kreft, er et hormonelt regulert sykdom. Respons på progestinterapi positivt korrelerer med hormon-reseptor-ekspresjon, spesielt progesteronreseptoren (PR). Men mange avanserte tumorer miste PR uttrykk. Vi har nylig rapportert at effekten av progestin terapi kan bli betydelig forbedret ved å kombinere progestin med epigenetiske modulatorer, som vi betegnelsen «molekylært forbedret progestinterapi.» Det forble uklart var virkningsmekanisme og hvis østrogen reseptor α (ERα), prinsippet inducer av PR, er nødvendig for å gjenopprette funksjonell ekspresjon av PR via molekylært forbedret progestinterapi. Derfor modellert vi avanserte endometrial svulster som har mistet både ERα og PR uttrykk ved å generere ERα-null endometrial kreft cellelinjer. CRISPR-Cas9 teknologien ble brukt til å slette ERα på genomisk nivå. Våre data viser at behandling med en histondeacetylase-inhibitor (HDACi) var tilstrekkelig til å gjenopprette funksjonelle PR ekspresjon, selv i celler blottet for ERα. Våre studier viser også at HDACi behandling resulterer i markant nedregulering av onkogen Myc. Vi har fastslått at PR er en negativ transcriptional regulator av Myc i endometrial cancer i nærvær eller fravær av ERα, noe som er i motsetning til studier hos brystkreftceller. Først østrogen stimulering utvidet PR uttrykk og redusert Myc i livmorkreft cellelinjer. For det andre, progesteron økt PR aktivitet enda avstumpet Myc mRNA og protein uttrykk. Endelig overekspresjon av PR av adenovirus transduksjon i ERα-null livmorkreftceller betydelig redusert uttrykk for Myc og Myc-regulerte gener. Analyse av databasen Cancer Genome Atlas (TCGA) av endometriale tumorer identifisert en invers korrelasjon mellom PR og Myc mRNA-nivåer, med en tilsvarende invers korrelasjon mellom PR og Myc nedstrøms transkripsjonelle mål SRD5A1, CDK2 og CCNB1. Sammen utgjør disse data indikerer en tidligere uventede invers sammenheng mellom tumor suppressor PR og onkogen Myc i livmorkreft
Citation. Kavlashvili T, Jia Y, Dai D, Meng X, Thiel KW, Leslie KK, et al. (2016) omvendte forholdet mellom progesteron reseptor og Myc i livmorkreft. PLoS ONE 11 (2): e0148912. doi: 10,1371 /journal.pone.0148912
Redaktør: Wei Xu, University of Wisconsin – Madison, USA
mottatt: 05.01.2016; Godkjent: 24 januar 2016; Publisert: 9. februar 2016
Copyright: © 2016 Kavlashvili et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av American Cancer Society Institutional stipend (SY), og NIH R01CA99908 og R01CA184101 (KKL), Institutt for obstetrikk og gynekologi Research Development Fund (KKL). De bevilgende myndighet ikke spille en rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Donghai Dai, og Kristina W. Thiel er co-grunnleggerne av Immortagen, LLC, som ikke har noen bedrifts rolle i de nåværende studier. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Alle andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Innledning
Livmorlivmorkreft er den vanligste gynekologi malignitet. Over 52 000 tilfeller er diagnostisert hvert år, og amerikanske kvinner har en levetid risiko for 1:11 [1]. Den endometrium er utsøkt sensitive til steroidhormoner. Østrogen som virker gjennom østrogenreseptoren (ER: ERα og ERβ), driver proliferasjon, mens progesteron virker gjennom progesteronreseptoren (PR: PRA og PRB) for å motvirke disse effektene ved å indusere differensiering, fremme apoptose, og inhibering av invasjon [2]. Basert på rollen av progesteron som en tumor suppressor i endometriet, har progestin-baserte hormonbehandling blitt brukt til å behandle endometriehyperplasi og endometriekreft for mer enn 60 år [3]. Imidlertid har hormonterapi typisk vært vellykket bare i tumorer hvor hormonreseptorer blir uttrykt. Vår gruppe og andre grupper har rapportert at ekspresjon av PR positivt korrelerer med en gunstig prognose og respons på behandling progestin [3,4], mens tap av PR uttrykk ligger til grunn for behandlingssvikt. Dette begrenser effekten av hormonbehandling i avansert sykdom hvor reseptorene er tapt.
I vår nylig publisert studie, kan vi tilby overbevisende bevis for at det er mulig å konvertere en PR-negativ kreft i en PR-positive kreft ved hjelp epigenetisk modulatorer [5]. Denne tilnærmingen øker følsomheten for progestin terapi i tumorer med lave nivåer av PR og induserer progestin følsomhet i svulster som aldri var forståelsesfull. Vi foreslår at effekten av progestin terapi kan bli betydelig forbedret ved å kombinere den med epigenetiske modulatorer, som vi begrepet «molekylært forbedret progestin terapi.»
For å undersøke om dette molekylært forbedret progestin terapi kan brukes til avansert livmorkreft pasienter med ERα og PR-negative tumorer; genererte vi ERα null livmorkreft cellelinjer ved å påføre ny CRISPR-Cas9 teknologi for å slette ERα på genomisk nivå (ESR1). Våre data viser at behandling med en HDACi er tilstrekkelig til å gjenopprette funksjonelle PR uttrykk, selv i celler blottet for ERα.
Våre studier viser også en tidligere uventede invers korrelasjon mellom PR og onkogen Myc i livmorkreft, noe som tyder på at HDACi behandling gir en ekstra fordel av Myc downregulation. Vi rapporterer en grundig analyse av denne sammenhengen og hypoteser om at tap av myc ligger til grunn for de unike effekten av progestin terapi.
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
Østradiol ( # E2257) og progesteron (# P6149) ble oppnådd fra Sigma Aldrich og resuspendert i etanol. Panobinostat (LBH589) ble kjøpt fra Selleck Chemicals og resuspendert i DMSO. Antistoffer mot PRA /B (# 3153), PRB (# 3157), FOXO1 (# 2880) og Myc (# 13987) var fra Cell Signaling. HSP90 antistoff (ADI-SPA-835) var fra Enzo. ERα antistoff (sc-8002) var fra Santa Cruz. β-actin antistoff (# A1978) ble oppnådd fra Sigma Aldrich.
Cellelinjer og cellekultur
ECC-1 endometrial kreft celler ble kjøpt fra ATCC og dyrket i henhold til de anbefalte retningslinjene. Ishikawa H endometrial kreft celler [6] (gave fra Dr. Erlio Gurpide, New York University) ble dyrket i DMEM media supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS vanlig, r-FBS) eller trekull-strippet FBS (cs-FBS, life-teknologi, # 12676-011) og penicillin-streptomycin (Gibco). Før tilsetning av progesteron (P4) til celler, cellevekstmedium med 10% FBS ble erstattet med vekstmedium inneholdende 5% trekull-strippet serum for å fjerne steroider fra FBS.
Generation of ERα Knockout-celler
Genomisk sletting av ERα (ESR1) ble opprettet i ECC1 celler ved hjelp av tre par kimære enkle guide RNA (sgRNAs) som tidligere beskrevet [7]. Kort sagt ble sgRNA oligoer (S1 Table) syntetisert og klonet inn i lentiCRISPR overføring plasmid for virusproduksjon. Virale vektorer ble produsert i HEK293T celler, etterfulgt av infeksjon av ECC1 celler som beskrevet [7]. ECC1-ESR1 CRISPR knockout (KO) celler ble selektert med 2 ug /ml puromycin etter 48 timer etter transduksjon. ECC1-ESR1 CRISPR KO-celler ble dyrket ved lav tetthet på 2 uker for å velge kloner. ERα ekspresjon ble bestemt ved Western-blotting for å identifisere kloner med ingen eller lav ERα proteinekspresjon. ECC1-ESR1 CRISPR KO kloner ble opprettholdt i media supplert med 5 mikrogram /ml puromycin.
Adenoviral Expression of PR
ECC1-ESR1 CRISPR KO klone 1-12 og 2-12 ble infisert med adenovirale vektorer som koder PRA, PRB, eller PRA /B eller en tom vektorkontroll (Adcontrol) ved hjelp av en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 10 viruspartikler per celle som tidligere beskrevet [8]. En MOI av 10 viruspartikler per celle ble ansatt for å få PR uttrykk nivåer tilsvarer omtrent den avdøde proliferativ fase av menstruasjonssyklusen.
Real-Time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler bruker Mirvana miRNA Isolation kit (Ambion, Life Technologies). RNA utbytte og renhet ble vurdert ved hjelp av en Nanodrop Model 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific). Total RNA (500 ng) var oligo-dT revers transkribert med Superscript III (Invitrogen, Life Technologies). Sanntids PCR ble utført i triplikat på en Applied Biosystems modell 7900 Genetic Analyzer under standardbetingelser. Primer sekvenser er oppført i S1 tabell. Resultatene ble kvantifisert ved hjelp av sammenlignende syklus terskel (ΔΔCt) metoden [9]. Data ble normalisert til 18S rRNA.
Western blotting
Etter behandling ble cellene oppløst i kaldt NP-40 cellelyseringsbuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris /HCl, pH 7,4, 1 % NP-40 med en protease og fosfatase-inhibitor cocktail fra Pierce) og deretter sonikert for å frigjøre kjerneproteiner. Lysater ble analysert ved Western blotting med spesifikke primære og HRP-konjugerte sekundære antistoffer. For påvisning av PR protein, en kombinasjon av PRA /B PRB antistoffer ved en 1: 1000 fortynning hvert ble brukt
TCGA Data Analysis
Pasientinformasjon ble lastet ned fra Kreft Genome Atlas. portal~~POS=HEADCOMP (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) vedlikeholdes av National Cancer Institute og National human Genome Research Institute. Genekspresjon ble analysert basert på RNASeq gjennomført på Illumina plattform og ble lastet ned fra NCI Cancer Genomics Hub (https://cghub.ucsc.edu/). Den beregnede Uttrykket var for alle leser innretting til et spesielt gen per prøve. Det var totalt 379 endometriekreft pasienter med behov for analyse av genuttrykk. Pasientene ble delt inn i fire grupper: endometrioid livmorkreft klasse 1, klasse 2, klasse 3 og serøs grad 3 som inkluderer tilfeller betegnet som høy klasse og blandet histologi typen
Statistical Analysis
Student t. -test ble anvendt for sammenligning av to grupper. For TCGA dataanalyse, ble statistisk analyse og data plotting utført med R Studio, og korrelasjonsanalyse ble utført med Spearman metode. Statistisk signifikans ble avsluttet med p-verdi 0,05.
Resultater
Modellering Tap av ERα i livmorkreft Cells
For å etterligne mer avansert livmorkreft som er forbundet med tap av ERα og PR, søkte vi CRISPR-Cas9 teknologi for å slette ERα på genomisk nivå (ESR1) i ERα- og PR-positive ECC1 endometrial kreft celler ved hjelp av tre forskjellige sgRNA sekvenser [7]. Disse cellene blir betegnet som ECC1-ESR1 CRISPR knockout (KO) celler. Vi neste valgte individuelle kloner fra celler transfektert med hver av de tre sgRNAs. Vi har bekreftet at mesteparten av klonene hadde fullstendig delesjon av ERα på proteinnivået, men klon 3-5 hadde et lavt nivå av gjenværende ERα sammenlignet med foreldre ECC1 celler (fig 1). I samsvar med ERα som prinsippet induserer PR uttrykk, tap av ERα resulterte i tap av PR, samt en reduksjon i PR målet genet FOXO1 (fig 1).
Ved hjelp CRISPR-Cas9 teknologi, ERα ble stille på genomisk nivå i ECC1 celler. Ishikawa, paren ECC1 celler og enkelte ESR1 KO ECC1 kloner ble behandlet med 20 nM LBH589 i 24 timer. Uttrykk av ERα, PR, FOXO1, og Myc ble evaluert av Western blotting. β-actin fungerer som en lasting kontroll.
HDAC hemmer Gjenoppretter PR Expression i ECC1-ESR1 CRISPR KO livmorkreft cellelinjer
neste spurte om ERα uttrykk er nødvendig for HDACi- mediert induksjon av PR, som vi tidligere har rapportert som en mekanisme for å gjenopprette sensitiviteten til progestin-basert terapi [5,10]. I alle ECC1-ESR1 CRISPR KO kloner, behandling med pan-HDAC hemmer LBH589 (panobinostat, Novartis) vesentlig økt PR protein uttrykk og aktivitet som bestemmes av uttrykk for PR målet genet, FOXO1 (fig 1). Legg merke til at celler ble holdt i serum som inneholder progesteron. Som en kontroll, vi også undersøkt PR-nivåer i foreldre ECC1 celler og Ishikawa celler, som har beskjeden baseline PR uttrykk. I samsvar med våre tidligere studier [5,10], LBH589 fremmet robust PR uttrykk i disse cellelinjene. Tatt med vår tidligere publiserte data at kombinasjonen av LBH589 og progesteron avtar kolonidannelse ved paren Ishikawa-celler [5], tyder disse data på at, selv hos pasienter med tap av både ERα og PR, kan det være mulig å oppnå følsomhet for progestinterapi med en epigenetisk modulator.
HDAC inhibitor undertrykker Oncogene Myc Expression i livmorkreft Cells
som en kontroll, vi også vurdert uttrykk for onkogen Myc basert på flere rapporter som ERα og PR fremmer transkripsjon av myc i brystkreft [11-13]. Uventet, uttrykk for Myc var uendret i ubehandlede ECC1-ESR1 CRISPR KO celler tross tap av ERα og PR uttrykk. Imidlertid HDACi behandling, i tillegg til å indusere PR som beskrevet ovenfor, fullstendig undertrykt Myc proteinekspresjon. Vi har også observert en nedgang i Myc og en oppregulering av PR i foreldre ECC1 celler samt annen livmorkreft cellelinje, Ishikawa, etter behandling med LBH589. Disse data identifiserer en invers sammenheng mellom Myc og PR i endometrial kreft celler.
Vi har også anvendes høyere konsentrasjoner av LBH589 for å fastslå om myc-nivåer kan bli ytterligere undertrykket. I både foreldrenes og ECC1-
ESR1
CRISPR KO livmorkreftceller, PR-nivåene ble gradvis forhøyet som svar på økende konsentrasjoner av LBH589, med en tilsvarende doseavhengig reduksjon i Myc uttrykk (fig 2). Disse funnene bekrefter vår observasjon av omvendt korrelasjon mellom PR og Myc uttrykk i figur 1 og foreslår at høyere konsentrasjoner av LBH589 kan være nødvendig for å gjenopprette PR nivåer i tumorer med langvarig tap av hormonreseptor uttrykk.
Celler ble behandlet med indikerte konsentrasjoner av LBH589 i 24 timer og protein ekspresjon analysert ved Western blotting. β-actin fungerer som en lasting kontroll.
Østrogen Stimulering Øker PR og Reduserer Myc Expression i livmorkreft cellelinjer
omvendt korrelasjon mellom PR og Myc uttrykk i figur 1 og 2 utfordrer godt akseptert paradigme i brystkreft som PR fremmer Myc uttrykk [12,14]. Vi først bekreftet at østrogen stimulering av MCF7 celler som inneholder endogene ERα og PR, resulterer i robust uttrykk for PR og Myc, med forventet ligand-mediert ERα downregulation (S1 fig). Tilsetting av progesteron ytterligere økt MYC nivåer, i tråd med tidligere studier [12,14]. I motsetning østrogen stimulering av livmorkreftceller med endogen ERα uttrykk indusert PR uttrykk, med en samtidig reduksjon (Ishikawa celler) eller ingen ytterligere økning (ECC1 celler) i MYC protein nivåer (fig 3).
Ishikawa og ECC1-celler ble behandlet med 10 nM østradiol (E2) for angitte tidspunkter. PR, Myc og ERα protein-ekspresjon ble målt ved Western blotting. HSP90 fungerer som lasting kontroll.
PR Negativt Regulerer Myc Expression og aktivitet i livmorkreft Cell
For å undersøke om PR formidler Myc downregulation i livmorkreftceller, vi behandlet Ishikawa celler, som ha lav grunnlinje ERα og PR-nivåer (fig 3), med LBH589 i fravær eller nærvær av progesteron i 0-72 timer. Forsøk ble utført på trekull-strippet serum for å fjerne hormoner. Behandling med progesteron produsert en tidsavhengig reduksjon i MYC protein nivåer, og tillegg av HDACi aksentuert denne effekten (figur 4A). Vi vurderte også Myc transkripsjonen aktivitet ved å undersøke mRNA nivåer av MYC målgener. I samsvar med Western blot-dataene, ble mRNA-nivåer av Myc redusert med mer enn 90% etter behandling med LBH589, og tilsetning av progesteron resulterte i en ytterligere reduksjon (figur 4B). Den Myc målgener CDK4, CAD, SRD5A1 og HES1 ble undertrykt i respons til LBH589 + progesteron (fig 4B).
(A) Ishikawa celler ble behandlet med 20 nM LBH589, 100 nM progesteron (P4) eller kombinasjonen i de angitte tidsrom. PR og Myc-protein-ekspresjon ble målt ved Western blotting. β-actin tjener som en lasting kontroll. (B) Uttrykk for Myc og nedstrøms gener (CDK4, CAD, SRD5A1 og HES1) ble analysert ved QRT-PCR i Ishikawa celler ble behandlet med 20 nM LBH589 – /+ 100 nM P4 for 4 eller 24 timer. Data ble normalisert til 18S og beregnes som ganger endring i forhold til kontroll. * P 0,05 vs. kontroll.
For å undersøke om PR formidler Myc downregulation i ERα-null endometrial kreft celler, ble molekylært forbedret progestin terapi brukt i ECC1-
ESR1
CRISPR KO celler. I samsvar med figur 4, ble lignende resultater oppnådd i ERα-null cancerceller (figur 5). Nærmere bestemt, behandling med LBH589 øket ekspresjon av PR og redusert ekspresjon av Myc og nedstrøms transkripsjonelle mål, CDK4 og CAD. Denne effekten ble amplifisert ved tilsetning av progesteron (figur 5A). Dette tapet av Myc uttrykk ble bekreftet på proteinnivå (figur 5B).
(A) ECC1-
ESR1
CRISPR KO klone 1-12 ble behandlet med 100 nM P4 for 16 timer, 20 nM LBH589 i 24 timer, eller en kombinasjon, etterfulgt av analyse av PR, mYC, og PR målgener ved QRT-PCR. Data ble normalisert til 18S og beregnes som ganger endring i forhold til kontroll. Resultatene er representative for 3 uavhengige eksperimenter; * P 0,05 vs. DMSO; # P 0,05 vs. LBH589. (B) ECC1-
ESR1
CRISPR KO kloner ble behandlet som i (A), etterfulgt av analyse av PR og Myc proteinnivåer ved hjelp av Western blotting. β-actin fungerer som en lasting kontroll.
For å gi ytterligere bevis for koblingen mellom PR og Myc downregulation, overexpressed vi PRA og PRB i ECC1-
ESR1
CRISPR KO klone en -12. Vi først bekreftet at eksogene uttrykk for PRA eller PRB av adenovirus transduksjon fører til robust overekspresjon av PR og også induksjon av PR nedstrøms genet AREG (fig 6). Overekspresjon av PR resulterte i Myc nedregulering, og tilsetning av progesteron ytterligere redusert mRNA-nivåer av Myc og Myc målgenet, HES1 (figur 6). Disse data støtter vår hypotese om at PR negativt regulerer Myc uttrykk i livmorkreft.
ECC1-
ESR1
CRISPR KO klone 1-12 ble transduced med kontroll adenovirus (Adcontrol) eller adenovirus som inneholder PRA, PRB eller PRA + PRB i 24 timer, etterfulgt av 100 nM P4 i ytterligere 24 timer. mRNA-nivåer ble kvantifisert ved QRT-PCR, normalisert til 18S, og data uttrykt som gangers endring relativt til Adcontrol i fravær av P4. Resultatene er representative for 3 uavhengige eksperimenter; * P 0,05 vs. Adcontrol; # P 0,05 vs.-P4 i samme gruppe.
omvendt korrelasjon mellom PR og Myc i Endometriebiopsier Pasient Svulster
For å undersøke om det er en invers korrelasjon mellom PR og Myc uttrykk i livmor kreftpasientprøver, analyserte vi RNA-Seq data fra 379 endometrial svulster i TCGA datasett. Vi observerte en progressiv nedgang i PGR og ESR1 mRNA uttrykk fra endometrioid livmorkreft til mer aggressive serøs svulster som definert av karakternivå (figur 7A). Tvert imot, ble Myc mRNA uttrykk økt betydelig i store svulster klasse i forhold til lavere karakterer. Den Spearman korrelasjon metode bekreftet at korrelasjonen av PGR med Myc og ESR1 med Myc er signifikant (figur 7B og 7C).
(A) Boxplot av mRNA uttrykk for PGR (venstre panel), ESR1 (midtre panelet) og Myc (høyre panel) ble analysert i henhold til livmorkreft karakter i 379 livmorkreft pasient svulster fra TCGA database. Pasientene ble delt inn i fire grupper: endometrioid type I klasse 1 (G1, n = 86), klasse 2 (G2, n = 103), klasse 3 (G3, n = 123) og serøs type II grad 3 (G3, n = 67). (B) Parvise korrelasjonsanalyse av PGR, ESR1 og Myc mRNA nivåer ved hjelp av Spearman metode. Korrelasjonskoeffisientene og p-verdiene vises. (C) spredningsplott for å vise negativ korrelasjon i ekspresjonen av to gener. Pasientene ble avsatt på x-aksen for å øke ekspresjon av et bestemt gen. To regresjonslinjer ble fremstilt ved enkel lineær regresjonsanalyse basert på ekspresjon av de respektive gener. Venstre: Uttrykk for Myc (rød) mot PGR (svart); høyre:. uttrykk for Myc (rød) mot ESR1 (svart)
For ytterligere å validere omvendt korrelasjon mellom PR og Myc i pasientprøver, undersøkte vi hvordan PR korrelert med MYC nedstrøms gener SRD5A1, CCNB1 og CDK2. Den Spearman korrelasjon metoden demonstrert en sterk negativ korrelasjon på PGR med SRD5A1, CCNB1 og CDK2 uttrykk (Fig 8).
(A) Parvise korrelasjonsanalyse av PGR og MYC nedstrøms gener, SRD5A1, CCNB1 og CDK2 hjelp Spearman metode . Korrelasjonskoeffisientene og p-verdiene vises. (B-D) Scatterplots for å vise positiv eller negativ korrelasjon av ekspresjon av to gener som i figur 6C. (B) Uttrykk for SRD5A1 (rød) mot PGR (svart); (C) uttrykk for CCNB1 (rød) mot PGR (svart); og (D) uttrykk for CDK2 (rød) mot PGR (svart).
Diskusjoner
Livmorkreft er et hormon regulert kreft der østrogen stasjoner vekst og progesteron undertrykker spredning og fører til Differensiering. Respons på progestin-basert terapi positivt korrelerer med hormon-reseptor-ekspresjon, spesielt progesteronreseptoren (PR), men mange avanserte tumorer er blottet for PR-ekspresjon, så vel som ERα, den primære transcriptional induser av PR. Vi har nylig funnet ut at PR uttrykk kan gjenopprettes ved HDACi. Heri vi utvide disse funnene ved å rapportere at PR uttrykk kan gjenopprettes i livmorkreftceller, selv de uten ERα. Disse data er viktig, fordi de viser at, selv hos pasienter med tap av både ERα og PR, kan det være mulig å gjenopprette sensitiviteten til progestin gjennom kombinasjonsbehandling med et epigenetisk modulator. Overraskende fant vi også at onkogen Myc, som er kjent for å bli indusert av ERα og PR i brystkreftceller, ble markert undertrykket ved HDACi behandling, blant annet i celler som mangler ERα. Videre eksogen ekspresjon av PR ved adenovirus fremmet Myc nedregulering, noe som gir ytterligere bevis på at PR regulerer negativt Myc uttrykk. I samsvar med observasjoner i kreftcellene, fant vi ut at PR og Myc er omvendt korrelert i endometrial svulster i TCGA datasett. Vi hypotese at tap av Myc ligger til grunn for de unike effekten av progestin terapi i livmorkreft.
Myc er en godt karakterisert onkogen som spiller en viktig rolle i patogenesen av mange kreftformer [15,16]. Som andre krefttyper, er Myc sterkt uttrykt i endometriale tumorer [17]. Studier i transgene musemodeller viser at Myc inaktivering fører til hurtig tumorregresjon, og er ofte forbundet med kjennetegnene ved cellulær differensiering og apoptose [18,19]. Til tross for klare bevis for den svært onkogene rolle Myc i mange krefttyper, inkludert livmorkreft, har en bestemt lite molekyl hemmer av Myc vært unnvikende [20]. Nåværende narkotika utviklingsstrategier inkluderer målretting trasé oppstrøms eller nedstrøms for Myc, som bromodomain og ekstra terminal motiv (BET) hemmer. Faktisk, hemming av BET i myelomatose resultater i bemerkelsesverdig nedregulering av Myc uttrykk og tilhørende celledød [16]. Heri vi identifisere en annen mulig mekanisme for å dempe de onkogene effekter av Myc: PR-mediert hemming av Myc transkripsjon. Derfor molekylært forbedret progestin terapi ikke bare forbedrer følsomheten til progestin ved å gjenopprette funksjonelle PR uttrykk [5,10], men gir også en ekstra fordel av downregulating Myc.
Andre har vist at Myc uttrykk er regulert gjennom epigenetiske mekanismer . For eksempel har HDACi-mediert undertrykkelse av Myc uttrykk også blitt rapportert i hode og hals plateepitelkarsinom cellelinjer [21]. Potensialet mekanismen er oppregulering av
MXI1
og
SSB2
, som inhiberer transkripsjonen aktivitet av Myc [21]. Men våre data tyder på at mekanismen for Myc undertrykkelse er gjennom PR. For det første behandling med progesteron i kombinasjon med HDACi produsert en ytterligere reduksjon i Myc i forhold til HDACi alene. For det andre, overekspresjon av PRA /B av adenovirus i ECC1-
ESR1
CRISPR KO-celler vesentlig redusert Myc-ekspresjon i fravær av en HDACi, en indikasjon på en PR-mediert effekt snarere enn en generell epigenetisk effekt.
Flere rapporter i brystkreft viser at ERα og PR fremme transkripsjon av Myc gjennom bindende østrogen respons element (ERE) og progesteron respons element (PRE) i Myc promoter regionen [11,13,22,23]. Den tidligste rapport av en PRE i Myc promoter-regionen i T47D brystkreft celler ble publisert i 1997 [14]. Observasjonen at ERα og PR indusere Myc uttrykk er i samsvar med det fenomenet at progestin brukt i prevensjon narkotika fremme kreft vekst bryst
in vitro Hotell og
in vivo product: [24-26]. Her rapporterer vi det motsatte effekt i livmorkreft, der uttrykk for Myc omvendt korrelert med ERα og PR, både i livmorkreft cellelinjer og i svulster fra TCGA database. Kontroll eksperimenter i MCF7 brystkreftceller bekreftet positiv korrelasjon av Myc med ERα og PR i denne celletype. Dermed kan den negative reguleringen av Myc av PR i livmorkreft gi en forklaring på de motstridende effekter av progesteron på spredning i bryst vs livmorkreft.
I sammendraget, fant vi at HDACi behandling av livmorkreftceller gir den doble fordelene ved oppregulering av tumor suppressor PR og downregulating onkogen Myc. Dessverre har monoterapi HDACi begrenset klinisk effekt i solide tumorer, og nye studier utforsker bruken av HDACi å «prime» svulster til andre behandlinger [27, 28]. Basert på vår omfattende studier av mekanismer for PR stanse i livmorkreft, foreslår vi at HDACi kan brukes til å prime endometrial svulster for respons til progestin-basert terapi, som vi refererer til som molekylært forbedret progestin terapi, via epigenetisk modulering. Fremtidige studier er nødvendig for å forstå hvis kombinerer en HDACi med progestin vil gjenopprette PR, downregulate Myc, og føre til sykdom ledelse. Et første skritt kan være å utforske denne kombinatorisk strategi i neoadjuvant omgivelser, noe som ville gi mulighet til å undersøke PR og myc-nivåer i pre-behandlings biopsier og i post-behandlings kirurgiske prøver erholdt ved tidspunktet for tumor cytoreduksjon. En annen terapeutisk mulighet er i innstillingen av avansert eller residiverende livmorkreft, der flertallet av endometrial svulster har mistet uttrykk for PR. Ved å integrere de epigenetiske terapi i hormonelle regimer, kan det være mulig å forbedre resultatene for livmorkreft, en sykdom som er på vei oppover.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. E2 stimulering induserer PR og Myc-ekspresjon i MCF7 brystcancerceller MCF7 celler.
Ble dyrket på trekull strippet serum og behandlet med 10 nM Estroadiol (E2) som angitt tidspunkt. PR og ERα protein-ekspresjon ble målt ved Western blotting. β-actin fungerer som lasting kontroll
doi:. 10,1371 /journal.pone.0148912.s001 plakater (TIF)
S1 Table. ESR1 sgRNA sekvens og primere for real-time PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0148912.s002 plakater (docx)
