Abstract
Eksponering for gentoksiske stoffer, som for eksempel stråling produserer DNA-skader, giftig som er forsterket når DNA-reparasjon er svekket. Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP-hemmere) ble funnet å være «
syntetisk dødelig
» i cellene mangelfulle i BRCA1 og BRCA2 som svekker homolog rekombinasjon. Imidlertid, siden mange tumorer, inkludert prostata cancer (PCA) sjelden har på slike mutasjoner er det stor interesse for å finne alternative determinanter for PARP inhibitor følsomhet. Vi evaluerte effekten av stråling i kombinasjon med PARP-inhibitor, rucaparib i PCA-celler. Kombinasjonen indeksen for klonogene overlevelse etter stråling og rucaparib behandlinger avslørt synergis interaksjoner i et panel av PCA cellelinjer, som er sterkest for LNCaP og Vcap celler som uttrykker ETS genet fusjonsproteiner. Disse funnene korrelert med synergistiske interaksjoner for senescens aktivering, som antydet med β – galaktosidase farging. Fravær av PTEN og tilstedeværelse av ETS genet fusjon dermed lettere aktivering av senescence, noe som bidro til redusert klonogene overlevelse. Økt Radiosensitivity i nærvær av rucaparib var assosiert med vedvarende DNA pauser, som bestemmes av χ-H2AX, p53BP1, og Rad51 foci. VCap-celler, som rommer
TMPRSS2-ERG
genfusjon og PC3-celler som stabilt uttrykker en lignende konstruksjon (fusjon III) viste økt følsomhet overfor rucaparib, som i sin tur øker den stråling som reaksjon på en lignende grad som DNA-PKCS inhibitor NU7441. Rucaparib radiosensitized PCA celler, med en klar fordel av lavdose-rate stråling (LDR) gis over en lengre periode som forårsaket økt DNA-skader. LDR ligne brachyterapi, som er brukt med hell i klinikken, var mest effektiv når den kombineres med rucaparib ved å indusere DNA-skade vedvarende og begynnende alderdom, noe som fører til redusert klonogene overlevelses. Denne kombinasjonen var mest effektive i nærvær av
TMPRSS2-ERG
og i fravær av
PTEN
, noe som indikerer klinisk potensiale for brachyterapi hos pasienter med middels og høy risiko PCa.
Citation: Chatterjee P, Choudhary GS, Sharma A, Singh K, Heston WD, Ciezki J et al. (2013) PARP Hemming sensitizes til lav Dose-Rate Stråling TMPRSS2-ERG Fusion Gene-Uttrykke og PTEN-Mangel prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (4): e60408. doi: 10,1371 /journal.pone.0060408
Redaktør: Philip J. Tofilon, National Cancer Institute, USA
mottatt: 31 oktober 2012; Godkjent: 26 februar 2013; Publisert: 02.04.2013
Copyright: © 2013 Chatterjee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet var først og fremst støttet av Pfizer RDG, med ekstra støtte fra National Cancer Institute (CA127264 til AA) og United States Department of Defense Post-doktor Training Award (PC094405 til KS). Det ble også støttet delvis av nasjonale Insitutes of Health stipend P30 CA43703 for bruk av stråling Resources Kjerne Facility, Case Western Reserve University og CASE Comprehensive Cancer Center. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Dette arbeidet ble i hovedsak støttet av Pfizer RDG. Stamløsninger av rucaparib ble levert av Pfizer. Forfatternes kolleger i Clovis Oncology gitt forslag og veiledning. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den mest ofte diagnostisert svulst i menn, som står alene for 29% av hendelsen tilfeller [1]. Det er den nest vanligste dødsårsaken på grunn av kreft hos menn etter lungekreft. Bestråling er en viktig behandlingsform for PCA med en klinisk respons oppnås på -85%. Den brukes først og fremst for tidlig stadium sykdom, som et hjelpestoff til kirurgi, og i kombinasjon med chemo-terapeutiske midler som tillater dets bruk ved lavere doser, med høyere effektivitet og med mindre cytotoksisk effekt til de tilstøtende normale vev.
Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) er representert ved en familie av proteiner som blir uttrykt rikelig, er primært lokalisert i kjernen, og er involvert i mange viktige cellulære prosesser, slik som respons på DNA-skade, er reparert, og når skaden er alvorlig, celledød ved apoptose eller nekrose [2]. PARP-1 og -2 er kjent for å ha en rolle i forskjellige DNA-reparasjonsmekanismer, som basen excision reparasjon, homolog rekombinasjon (HR) [3], og nonhomologous ende-sammenføyning (NHEJ) [4]. Etter påvisning av DNA-skade, ved hjelp av dens DNA-bindende domene, aktiverte PARP-1 utløser poly-ADP-ribosylering av histoner og PARP-1 seg selv. Viktigere, sikrer PARP-en regulering av DNA replikasjonsgaffelen progresjon av HR på skadet DNA [5]. PARP-1 er involvert hovedsakelig i reparasjon av enkelt-strandet pauser, som, hvis unrepaired konverteres til dobbelt strandet pauser (DSB sin) under DNA replikasjon. PARP-inhibitorer (PARPi) representerer en ny klasse av midler som hindrer syntese av poly-ADP-ribose ved som treffer nedstrøms DNA-reparasjonsprosesser, og som et resultat av DNA-skade vedvarer [2]. PARPi derfor kan fungere som monoterapi i HR-mangel tumorer (f.eks BRCA1 /2-defekt) gjennom «
syntetisk dødelighet
» [6]. Deaktivering NHEJ i HR-mangel celler via DNA-PKCS hemming kan reversere effekten av PARPi-mediert dødelighet [7]. Stråling induserer PARP-aktivitet og dens inhibering forbedrer celledød og forbedrer tumorvekstforsinkelse på bestrålte lungecancermodeller [8]. Nivåer av PARP-1 er også økt i avansert, kastrere motstandsdyktig PCa [9], [10], derfor er bruken i kombinasjon med stråling for å forbedre strålebehandling tiltalende.
«
syntetisk dødelighet
«-konseptet har vært effektiv i pattedyrceller i tumormodeller med defekt BRCA1 eller BRCA2, som, som en konsekvens har defekt HR [3] og er dermed mottagelig for bruk av PARPi som monoterapi [11]. Men for svulster der slike mutasjoner er sjeldne, for eksempel PCA det er et presserende behov for å identifisere ytterligere DNA skade og reparasjon defekter som kan gi en «
syntetisk dødelig
» kombinasjon med PARPi. Dermed utvide bruken av PARPi utover svulster med defekt BRCA1 /2 er av stor interesse.
I slutten av scenen PCA bi-allelisk sletting av
PTEN plakater (fosfatase og tensin homolog) genet er en vanlig foreteelse som er blitt foreslått å påvirke HR DNA-reparasjon. PTEN antagoniserer den PI3K /AKT overlevelsesreaksjonsveien med sin fosfolipid 3-fosfatase-aktivitet, som i sin tur regulerer proliferasjon, migrering og apoptose. Fullstendig tap av
PTEN
også stimulerer en sterk alderdom svar som fungerer som en ekstra mekanisme for svulst undertrykkelse. Senescens har vært foreslått å virke som en anti-tumor mekanisme i respons til DNA-skade ved å indusere en irreversibel vekststans og begrenser den replikative levetiden av celler [12]. I likhet med BRCA1 /2-defekte tumorceller,
PTEN
-null PCA celler har blitt rapportert å være følsom for PARPi.
I denne studien undersøkte vi svar på en potent PARP hemmer, rucaparib alene eller i kombinasjon med stråling i et panel av PCA-cellelinjer. Våre data støtter effektiviteten av rucaparib som en potent PARPi for radiosensitizing PCA celler, mest effektivt når det brukes ved lave doserater i celler som havn
TMPRSS2-ERG
genet fusjon eller er
PTEN
-deficient
Materialer og metoder
Cell Culture
Menneskelig PCa cellelinjer PC3, LNCaP, DU145, og Vcap ble oppnådd fra ATCC (Manassas, Virginia).; C4-2 ble beskrevet tidligere [13]. Celler ble dyrket i RPMI-1640-medium, bortsett fra DU145 (DMEM) og VCap (modifisert DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals), L-glutamin (Invitrogen), og 100 enheter /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen) i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2. Stamløsninger av rucaparib, levert av Pfizer, ble gjort i DMSO (Sigma Aldrich).
For transfeksjon ble cellene sådd på ~80% konfluens i en antibiotika-frie medier.
TMPRSS2-ERG
fusjon III (den vanligste) isoform [14] sjenerøst gitt av Dr. Michael Ittmann ble transfektert hjelp lipofektamin 2000, etterfulgt av valg for neomycin motstand med 1 mg /ml G418 (Invitrogen). Effektiviteten av transfeksjon ble bekreftet ved Western blotting (fig. S1 A).
strålebehandling
Ioniserende stråling ble levert med en konvensjonell cesium-137 χ-irradiator (JL Shepherd Associates, San Fernando, CA), i en dose hastighet på 146 cGy /min [15]. Dose-rate eksperimenter ble utført ved å endre posisjonen av platene eller ved bruk av et dempeledd. En Ir-192 kilde til stråling, som avgir betapartikler, ansatt en custom-fabrikkert celle irradiator, med design av enheten som er beskrevet [16].
Analyser for Colony Forming og Senescence
for kolonien formasjon analysen ble 500 celler /60-mm fatet (eller 750 celler /60-mm parabolen for LNCaP) belagt dagen før behandlingen. Rucaparib ble administrert ved de angitte doser kontinuerlig. To uker etter behandling med stråling eller /og rucaparib ble cellene farget med 0,1% krystallfiolett, og cellekolonier med 50 celler ble scoret av en alfa-bilde analysator (Alpha Innotech Corp). Den begynnende alderdom Analysen ble utført som beskrevet [17]. Etter seks eller tolv dager ble cellene fiksert og andelen av β-galaktosidase-positive celler ble bestemt ved å telle ≥five ulike felt (~70 celler /prøve).
immunfluorescens
Celler ble belagt på Dekk i 35 mm-kultur retter. Etter behandling ble cellene fiksert med 2,0% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur, vasket 3 x i 5 minutter med fosfat-bufret saltvann (PBS), permeabilisert med 0,2% Triton X-100 i PBS i 10 min, og blokkert i tre % FBS i PBS inneholdende 0,1% Triton X-100 i 1 time. Objektglassene ble så immunofarget ved hjelp av antistoffer mot χ-H2AX (Millipore), 53BP1 (Abcam), eller Rad51 (Santa Cruz Biotechnology), etterfulgt av en fluorescent-konjugert (Invitrogen), sekundært antistoff, som beskrevet [17]. Kvantifisering var basert på data som er observert fra ≥70 celler.
Statistiske analyser
For synergi analyse ble cellene behandlet med rucaparib og bestråling, alene eller i kombinasjoner i et forhold som tilsvarer forholdet mellom deres median -effekt doser, for hver dose i hvert eksperiment belagt i tre eksemplarer, og hvert eksperiment utføres tre ganger. Samspillet mellom de to behandlinger i klonogene celle overlevelse og senescence-analyser ble deretter beregnet basert på isobolographic metode for Chou og Talalay, som beskrevet tidligere [18], [19]. Alle statistiske analyser ble gjort ved hjelp av to-veis ANOVA og statistisk signifikans tildelt for p. 0,05
Western Blot Analyser
Celler ble lysert og utsatt for immunoblotting som beskrevet [17], [ ,,,0],20] og probet med antistoffer mot V5 tag (Thermo Scientific), for å oppdage den
TMPRSS2-ERG
fusjon III genet og β-aktin (Sigma Aldrich) som en lasting kontroll.
Resultater
økt følsomhet av PCA cellelinjer for stråling når den kombineres med Rucaparib
ioniserende stråling og DNA-skadende midler signifikant induserer PARP-1 og nivå av PARP er høyere i svulster [9], [10 ], derfor, PARPi kan brukes til å sensitivisere til DNA-skadende kjemo- eller radioterapi. Klinisk suksess for PARPi på en kohort av pasienter [21] som inkluderte noen med PCa bedt om vår interesse i å utforske potensialet bruk av rucaparib (CO-338, tidligere kjent som AG014699 og PF-01367338) som en radiosensitizer. Rucaparib, den første PARPi som har blitt utviklet [22], [23], og er for tiden testet i kliniske forsøk har ikke vært –previously anvendt for PCA-celler. Undersøke sin langsiktige effekt på celleoverlevelse indikerte et svar dose for stråling og rucaparib for ulike PCA celler (Fig. 1a). VCap og LNCaP (rucaparib konsentrasjon: 0,25, 0,5 og 0,75 uM) viste maksimal følsomhet overfor rucaparib, etterfulgt av PC3 og c4-2 celler. I kombinasjon med 1,5 Gy χ-bestråling, LNCaP-celler oppviste den høyeste følsomhet til så lavt som 0,75 uM av rucaparib (Fig. 1B). Synergi beregninger av isobologram analyse (se Materialer og Metoder) ble utført for de fire doser av stråling, som strekker seg 1-5 Gy i kombinasjon med rucaparib (konsentrasjonsområdet 0,6 til 3,12 uM). For PC3, en konsentrasjon av rucaparib så lav som 1,25 uM viste en signifikant reduksjon i antall koloni med en potent effekt bestrålingssensibilisering. DU145-celler var minst reagerer på stråling og rucaparib, alene og i kombinasjon, med en begrenset virkning bare oppnås ved de høyeste doser. VCap-celler, men så lenge de viste en lignende respons på strålingen som DU145, for kombinasjonen med rucaparib viste en synergistisk interaksjon (fig. 1B og S2A fig.). Kombinasjonen indeksen viste den sterkeste synergi (CI 0,2) i LNCaP-celler etter bestråling og rucaparib kombinasjon, med doser av stråling så lave som 0,5 Gy og 0,25 uM av rucaparib å være effektiv. PC3-celler viste en moderat synergi (CI = 0,7) etter 4 Gy stråling og 2,5 uM av rucaparib, mens c4-2-celler viste en additiv effekt (CI = 0,9) (fig. 1B og fig. S2).
A, Stråling og rucaparib dose respons i PC3, c4-2, DU145, Vcap og LNCaP celler ble etablert av klonogene celleoverlevelsesanalyser. Venstre panel viser responsen på stråling, de på retten til rucaparib. B, synergistisk effekt av kombinasjonen av stråling og rucaparib på klonogene overlevelses i LNCaP, PC3, c4-2, og VCap-celler, hvor CI en representerer synergi og CI en antagonistisk interaksjon mellom de to behandlingene. Feilfelt representerer SD av gjennomsnittet (n = 3).
Rucaparib og Radiation Frem Senescence i PTEN-mangelfull og TMPRSS2-ERG Fusion-uttrykke celler
Senescence er kjent for å representere en viktig svar på både stråling og PARPi at konsekvensene for celledeling og til slutt klonogene overlevelse. De behandlede celler viste karakteristiske markører av alderdom etter seks dager. Disse inkluderte flattrykt cellemorfologi med akkumulering av SA-β-galactosidase-positive celler (Fig. S3A).
PTEN
null PC3, LNCaP og c4-2 cellelinjer viste en økning stråling og PARPi doseavhengig i SA-β-galaktosidase-positive celler til behandling enten med stråling eller rucaparib (fig. 2A og 2B) . LNCaP hadde det høyeste antallet senescent celler etter enten monoterapi eller kombinasjonsbehandling. I kontrast, DU145 celler som har en villtype
PTEN
allel viste nesten ingen senescent celler selv ved de høyeste dosene som brukes. Kombinasjonen indeks for den begynnende alderdom SA-β-galaktosidase-farging indikerte en moderat sterk synergi (CI = 0,5-0,7) i PC3, LNCaP og c4-2-celler (fig. 2C og fig. S2). De senescence egenskaper ble opprettholdt opp til minst tolv dager, med en svak økning i antallet β-galaktosidase-positive celler (Fig. 2D og S3b fig.). Disse data indikerer at begynnende alderdom bidrar til redusert overlevelse av
PTEN
-deficient celler, og at graden av senescens korrelerer med klonogene overlevelses.
Prosent av β- galaktosidase-positive celler ble bestemt etter bestråling (A ) og rucaparib (B), behandling i
PTEN
-deficient LNCaP, c4-2, og PC3 celler. Prosentandelen av β-galaktosidase-positive celler ble bestemt ved telling ≥five forskjellige felter (~70 celler /prøve). C, Synergy analyser for senescence i LNCaP, PC3, og c4-2 celler for kombinasjonsbehandling. Se fig. S2 og 3 for β-galaktosidase-farging og ytterligere synergi analyser. D, Prosent av β-galaktosidase positive c4-2 celler ble bestemt etter 12 dagers behandling med stråling ± rucaparib. E, foreldre og
TMPRSS2-ERG
fusjonsgenet-uttrykk PC3-celler ble kvantifisert for SA-β-galaktosidase-farging etter 6 dager etter 4 Gy stråling, 2,5 uM rucaparib, og DNA-PKCS inhibitor NU7441 (500 nM ), alene eller i kombinasjon. Feilfelt representerer SD av gjennomsnittet (n = 3).
Vcap celler, som rommer den
TMPRSS2-ERG
fusjonsgenet, ervervet senescent celler etter stråling og PARPi (Fig. S4 ). Men disse cellene er avhengig av fusjonsgenet, derfor undersøke begynnende alderdom følgende knock-down av
TMPRSS2-ERG
var ikke informativt. Derfor brukte vi PC3 celler som uttrykker den samme isoform,
TMPRSS2-ERG fusjon III
for videre senescence eksperimenter. PC3-celler som uttrykker
TMPRSS2-ERG
hadde et økt antall SA-β-galaktosidase-positive celler etter bestråling (fig. S4). Effekten av
TMPRSS2-ERG
ekspresjon var sammenlignbare med hva som ble oppnådd i PC3-celler som bestråles i nærvær av DNA-PKCS inhibitor NU7441 (p = 0,0002), mens NU7441 alene induserte ikke senescens i begge cellelinjen . Rucaparib behandling i kombinasjon med stråling signifikant (p 0,0001) økte antallet senescent celler i
TMPRSS2-ERG
-expressing PC3 celler, som igjen korrelerte med PC3 celler behandlet med stråling, rucaparib, og NU7441, (p = 0,0009) (fig. 2E). NU7441 behandling induserte ikke senescence i PC3 cellene uttrykker
TMPRSS2-ERG
fusjon etter stråling, alene eller i kombinasjon med rucaparib. Disse dataene indikerer at DNA-PKCS aktivitet er avgjørende for senescence, som indikert av økt antall senescent celler i
TMPRSS2-ERG
-expressing celler eller når DNA-PKCS hemmes.
Rucaparib øker Persistence of Radiation-indusert DNA Damage Foci
Vi neste undersøkt om effekten av behandlingene var relatert til deres evne til å indusere DNA-skade. χH2AX og p53BP1 er etablert surrogater for måling av ioniserende stråling induserte foci (IRIF) [24]. Bestråling som genereres et økt antall χH2AX foci ved 3 og 6 timer, som ble sterkt redusert etter 24 timer, som indikerer reparasjon av DNA-skade (fig. 3A). I motsetning til dette, når cellene ble bestrålt i nærvær av rucaparib, χH2AX foci vedvarte i 24 timer. I tillegg foci for p53BP1, en annen etablert markør for DSB, var mer fremtredende ved 24 timer etter bestråling, med den kombinerte behandling med rucaparib som resulterer i et økt antall foci (Fig. 3B). Rad51 er en viktig del av HR; uttrykket ble ikke berørt av
PTEN
status, i samsvar med en fersk rapport [25]. Ikke desto mindre, kombinasjonen av rucaparib og stråling viste vedvarende Rad51 foci ved 24 timer (fig. 3C), noe som indikerer at kombinasjonen er mer effektiv i å påføre vedvarende DNA-skade i de behandlede cellene.
χH2AX (A) og 53BP1 (B) foci ble bestemt av immunofluoresecence mikroskopi etter 24 timer etter kombinert behandling med stråling og rucaparib i PC3 og LNCaP celler (venstre panel), med tidsavhengige kinetikk vist (panel høyre). C, Rad51 foci ble visualisert og kvantifisert i PC3-celler på samme måte etter 24 timers behandling. Feilfelt representerer SD av gjennomsnittet (n = 3).
LDR fører til økt DNA Damage og Redusert Cell Survival
Stråling gis i klinikken enten som ekstern stråle strålebehandling (EBRT ) eller brachyterapi. Stråling for behandling av PCa av brachyterapi vanligvis benytter doserater 70 cGy /t sammenlignet med 200-300 cGy /min som ofte brukes for EBRT for
in vitro
stråling studier av humane kreftcellelinjer med konvensjonelle bestråle. For å undersøke effektiviteten av lavere doserater, ble c4-2 og PC3-celler utsatt for dosehastigheter av 56-690 cGy /min, for å oppnå en total dose på 5Gy. Jo lengre eksponeringstid direkte korrelert med mer omfattende DNA-skade, noe som resulterer i færre kolonier (fig. 4A) og mer χH2AX og 53BP1 foci (Fig. 5A og 6A). Den laveste dosen satsen (56 cGy /min) økte antallet χH2AX foci signifikant (p 0,0002) sammenlignet med den konvensjonelle doserate (146 cGy /min). Tilsetning av rucaparib signifikant (p 0,0001) induserte DNA-skade som målt ved en økning i antall χH2AX foci (figur 5B.). Videre er det var signifikant (p 0,0001) ble økt antall p53BP1 foci etter kombinasjonsbehandling (figur 6B.). Den laveste dose av stråling (56 cGy /min) indusert betydelig mer 53BP1 IRIF (p = 0,004 0,0007 for c4-2 og PC3 celler) sammenlignet med den høyeste doserate (690 cGy /min)
A, klonogene overlevelsesanalyser ble utført for PC3 (venstre panel) og c4-2 celler (panel til høyre) ved forskjellige doserater ± 1,25 mikrometer rucaparib. B, c4-2 celler ble utsatt for ulike doserater av stråling fra en Ir-192 kilde ± 2,5 mikrometer rucaparib. En total strålingsdose på 5 Gy (venstre panel) og 10 Gy (høyre panel) ble levert; derfor eksponeringstiden avvek for de ulike doserater brukt. Feilfelt representerer SD av gjennomsnittet (n = 3).
A, Confocal farging for χH2AX foci, enumarated i PC3 og c4-2 celler etter stråling ved de angitte doserater. B, Kvantifisering av doseavhengig dannelsen av γH2AX foci. Feilfelt representerer SD av gjennomsnittet (n = 3).
A, Confocal farging av 53BP1 foci i PC3 og c4-2 celler etter stråling ved de angitte doserater. B, Grafisk fremstilling av doseavhengig 53BP1 IRIF generasjon. Feilfelt representerer SD av gjennomsnittet (n = 3).
Lignende eksperimenter ble utført med en lr-192 strålingskilde (fast totaldose på 5 og 10 Gy) ± rucaparib. Cellene som mottok den laveste dosen-rate (4,34 cGy /h), levert via den lengste periode av tid, dannes færre kolonier sammenlignet med de som utsettes for moderate til høyere doser (26,8 cGy /h) stråling (fig. 4B). Rucaparib sterkt redusert kolonidannelse, selv ved den høyeste dose som ble testet LDR (26,8 cGy /t), som krevde ~18 timer for å oppnå 5 Gy.
PARP Inhibition Radiosensitizes TMPRSS2-ERG fusjonsgenet-uttrykkende celler til en grad lik til DNA-PKCS Hemming i Foreldre Cells
fusjon mellom
TMPRSS2
, en androgen-regulert onkogen, og en ETS transkripsjonsfaktor østrogen-regulert gen, ERG generert av en interstitiell sletting på kromosom 21 eller ved gjensidig trans er til stede i ~ 50% av tidlig stadium PCa [26]. Vcap celler som uttrykker
TMPRSS2-ERG
endogent ble radiosensitized av rucaparib (Fig. 1B og S2A fig.). Disse cellene er avhengige av
TMPRSS2-ERG
som de slutter voksende når det er oppbrukt av siRNA (data ikke vist). Derfor ble PC3 celler transfektert med
TMPRSS2-ERG
fusjon III isoform, den vanligste PCa fusjonsgenet. Dens stabil uttrykk ikke har en signifikant effekt på Radiosensitivity, anslått av klonogene overlevelsesanalyser (Fig. S1B) og ved χH2AX og 53BP1 foci. Imidlertid, når det ble administrert sammen med rucaparib, ble antall kolonier reduseres signifikant (p = 0,0105) (fig. 7B). Denne effekten var sammenlignbar med det som ble oppnådd i PC3 celler behandlet med DNA-PKCS inhibitor NU7441. Den rucaparib Kombinasjonen ytterligere radiosensitized disse cellene (p = 0,0005), i en grad som kan sammenlignes med celler som uttrykker
TMPRSS2-ERG
fusjonsgenet ble behandlet med rucaparib (Fig. 7A). Et økt antall 53BP1 og χH2AX foci var synlige selv ved laveste dose rate, ytterligere demonstrere at rucaparib er en potent radiosensitizer for PCA celler som havn en fusjonsgenet (Fig. 7C).
A, klonogene overlevelse analyse i PC3 celler etter 4 Gy stråle ± 2,5 mikrometer rucaparib og DNA-PKCS inhibitor NU7441 (500 nM, venstre panel). B, klonogene overlevelsesforsøk i PC3 celler og derivater uttrykker TMPRSS2-ERG fusjon III ved forskjellige doserater ± 2,5 mikrometer rucaparib. C, immunofarging for χH2AX og 53BP1 i PC3-celler som uttrykker fusjonsgenet følgende stråling ± rucaparib behandling i 24 timer. Feilfelt representerer SD av gjennomsnittet (n = 3)
Diskusjoner
Rucaparib (CO-338, tidligere kjent som AG014699 og PF-01367338). Representerer en PARPi en ny klasse av midler med dokumenterte antitumoraktivitet mot humane cellelinjer og transplantater inneholdende mutert eller epigenetiske stilnet BRCA1 /2 [4], [27]. Tidligere arbeid har påvist at PARP-1 virker sammen med TRMPRSS2-ERG, og gir således en mekanistisk begrunnelse for bruk av PARPi i ETS genfusjon-positive PCa [3]. Her viser vi for første gang dens effektivitet som en bestrålingssensibilisator i et panel av PCA-cellelinjer, med maksimal synergi oppnådd med en lav dose-rate (LDR) i stedet for konvensjonelle dose stråling. LDR doser brukt her mimick de som er ansatt i klinisk praksis for PCa brachythrepay [28]. Vi tror dette funnet er viktig siden brachyterapi er mer effektivt enn EBRT for PCa behandling, og det kan ansette molekylære mekanismer som fremmer økt kreftcelle Radiosensitivity, i vår studie gjennom økt alderdom. Faktisk, kjemisk inhibering av PARP-aktivitet indusert en markert bestrålingssensibilisering av flere eksponensielt voksende tumorcellelinjer i 5-30 cGy doseringsområdet. LDR bestrålingssensibilisering aktivt dele kreftceller ved PARPi tyder på at de kan ha en rolle i å forbedre effekten av ultra-fraksjonerte eller LDR regimer [29]. Våre studier indikerer at rucaparib er en meget potent PARPi som synergizes med kliniske doser av stråling oppnådd i løpet brachyterapi. Bruken som et rediosensitizer er effektiv selv når stråledosen er sterkt redusert, en situasjon som møtte de radioaktive «frø» forråtnelse i den omfattende tid de brukes i PCA-pasienter.
Rucaparib, den første PARPi som var utviklet og testet i klinikken (i 2003 under navnet AG014699) [22], [23], har også vist seg å være effektiv i tumorxenografter i bryst, lunge, kolon, kolorektal-, og kreft i bukspyttkjertelen [27], [30 ]. Samtidig har det vist seg å være ikke-toksisk i mus som bar minst en funksjonell kopi av BRCA2-genet. Vår studie er den første noensinne utført for rucaparib ved PCA. Selv om vi ikke har fulgt lignende xenograft studier, basert på de ovennevnte rapporter med ulike krefttyper, alt tyder på at disse resultatene vil bli oversatt til PCa xenograft modeller.
Rucaparib har blitt undersøkt i kombinasjon med ulike kjemoterapi. Den ble funnet å være effektiv i kombinasjon med platina i bryst- og eggstokk-kreft xenograft-modeller [27], [31]. Vår studie er den første til å undersøke sin effektivitet i kombinasjon med strålebehandling. Andre PARPi, i kombinasjon med bestråling, ble rapportert å forårsake betydelig tumorvekst forsinkelse i lungekreft
in vivo
modeller [8], og å være effektive radiosensibiliserende både lunge og PCa cellelinjer [32]. Sensibilisering for stråling og alkyleringsmidler ble forbedret i DSB reparasjon-manglende celler [33], i samsvar med bemerkelsesverdig følsomhet for PARP-inhibering av BRCA-1 og BRCA-2-manglende tumorceller [6]. Den ABT-888 (veliparib) PARPi ble nylig vist å forbedre responsen av PCA celler og svulster til bestråling i DU145 og PC3 celler [34]. Kombinere ABT-888 med 6 Gy gitt forsinket svulst gjenvekst sammenlignet med begge substansene alene bare i PC3 xenografttumorer, mens DU145 svulster fortsetter å vokse. I likhet med våre studier, PC3 men ikke DU145 celler og svulster ble vist å inneholde rikelig senescent celler som viser vedvarende DNA-skader foci [34]. Vi viser at rucaparib er effektivt i ekstra
PTEN
-deficient celler, inkludert de som havna ETS Genfusjonene. Åpenbart kan effekten av PARPi avhenger av en kompetent senescence reaksjon på akkumulert DNA-skader, for eksempel når
PTEN
er mangelfull eller når
TMPRSS2-ERG
uttrykkes. En fersk studie har funnet at rucaparib radiozensitization kan også være NF-kB avhengig [35]. I denne studien viser vi at
TMPRSS2-ERG
, i tillegg til
PTEN
mangel, kan sensitiv til PARPi, som synergizes med strålebehandling.
Siden mutasjoner i BRCA1 /2 som gir en «
syntetisk dødelighet
» forhold med PARPi er sjeldne i PCA er det stor interesse for å definere andre molekylære markører for PARPi følsomhet. Faktisk, allergi å PARPi har nylig blitt vist å bli forsterket ved å blokkere DNA-skader signalering, gjennom ATM /Chk2 [36], [37] og MRN komplekse gjennom Mre11 [38]. I kontrast, blokkerer NHEJ DNA reparere gjennom p53BP1 [39], kan faktisk motvirke utsøkt følsomhet for PARPi forårsaket av BRCA1-mangel [40]. På den annen side, ekspresjon av p53 i vår PCa celle panel og en fersk rapport [39] ikke gjør en forskjell som både p53 null (PC3) eller p53 dyktig (LNCaP, c4-2) celler reagerte så vel til PARPi som en radiosensitizer. Responsen var heller avhengig primært på en kompetent senescent respons som var fraværende i DU145 celler som har en funksjonell
PTEN
allel og en avkortet, ikke-fungerende retinoblastom tumor suppressor [41].
ETS Genfusjonene er funnet i de fleste PCA tilfeller [26]. Uttrykket av fusjonsgenet er ansvarlig for celleproliferasjon i PCA celler som uttrykker
TMPRSS2-ERG product: [42]. Muse prostata blottet for
PTEN
skjerm forbedret svulst opprinnelse i nærvær av uttrykt ERG [43]. En fersk rapport viser at fusjon genekspresjon endrer radio- og chemo-følsomhet når røntgenstråling administreres i kombinasjon med paclitaxel [44]. I likhet med BRCA1 /2-mangel, inhibitorer av PARP-1 forbedre graden av DNA-skade fremmes først ved overekspresjon av fusjonsgen [3]. Derfor prostata kreftceller som bærer ETS fusjoner, for eksempel
TMPRSS2-ERG
er mer utsatt for robust svar på PARPi, alene på i kombinasjon med LDR. En annen studie har imidlertid funnet ut at
PTEN
sletting i PCA cellene kan ikke nødvendigvis forbinder med tap av RAD51 funksjon [25], med følsomhet for en annen PARPi bli assosiert stedet med en defekt i MRE11 uttrykk. Vi oppdaget at DNA-PKCS hemming av
TMPRSS2-ERG (data ikke vist)
har en avgjørende rolle for senescence aktivering. Bemerkelsesverdig, har DNA-PKCS uttrykk er nylig blitt vist å forutsi responsen til radioterapi i PCa [45].
I tillegg til sin rolle i DNA-skade og reparasjon, en transkripsjonen rolle er også knyttet til PARP-1 [3], senest noe som indikerer at det er nødvendig for androgen-reseptor-funksjon, særlig i kastrerings-resistente modeller av PCa [46].
