Abstract
Quassinoids er en gruppe av diterpenoids finnes i planter fra bittervedfamilien familien. De er også de store bioaktive forbindelser som finnes i
eurycoma longifolia
som vanligvis brukes som tradisjonell medisin i Sørøst-Asia for å behandle ulike plager, inkludert seksuell dysfunksjon og infertilitet. Disse anvendelser er tilskrevet dens evne til å forbedre testosteron-nivå hos menn. Kronisk forbruket av
E
.
longifolia
ekstrakter har blitt rapportert å øke testosteronnivå hos menn og dyremodell, men dens effekt på prostata vekst er fortsatt ukjent. Derfor undersøker denne studien virkningene av en standardisert total quassinoids sammensetning (SQ40) inneholder 40% av de totale quassinoids funnet i
E
.
longifolia
på LNCaP human prostatakreft cellelinje. SQ40 hemmet LNCaP-cellevekst ved IC
50 verdi på 5,97 ug /ml, mens IC
50 på RWPE-1 humane prostata normale celler var 59,26 mg /ml. SQ40 også inhiberte 5α-dihydrotestosteron-stimulert vekst i LNCaP-celler doseavhengig. Den hemmende effekten av SQ40 i forankrings-uavhengig vekst av LNCaP-celler ble også påvist ved bruk av myk-agar assay. SQ40 trykt LNCaP cellevekst via G
0 /G
1 fase arrest som ble ledsaget av nedregulering av CDK4, CDK2, cyclin D1 og Cyclin D3 og oppregulering av p21
Waf1 /Cip1 protein nivåer. SQ40 ved høyere konsentrasjoner eller lengre behandlingsvarighet kan føre G
2M vekst arrest fører til celledød ved apoptose som demonstrert ved påvisning av poly (ADP-ribose) polymerase spalting i LNCaP celler. Videre SQ40 også hemmet androgen receptor translokasjon til kjernen som er viktig for transaktivering av dens målgen, prostataspesifikt antigen (PSA) og resulterte i en betydelig reduksjon av PSA-sekresjon etter behandlingen. I tillegg intraperitoneal injeksjon av 5 og 10 mg /kg SQ40 også i betydelig grad undertrykkes den LNCaP tumorvekst i mus xenograft modell. Resultater fra denne studien tyder på at den standardiserte totale quassinoids sammensetning fra
E
.
longifolia
fremmer anti-prostatakreft aktiviteter i LNCaP menneskelige prostata kreft celler
Citation. Tong KL, Chan KL, Abubakar S, lav BS, Ma HQ, Wong PF (2015) The
In vitro Hotell og
In Vivo
Anti-Cancer aktiviteter av en standardisert Quassinoids sammensetning fra
eurycoma longifolia
på LNCaP menneskelige prostata kreft celler. PLoS ONE 10 (3): e0121752. doi: 10,1371 /journal.pone.0121752
Academic Redaktør: Keith R. Davis, Indiana University, USA
mottatt: 15 august 2014; Godkjent: 04.02.2015; Publisert: 31 mars 2015
Copyright: © 2015 Tong et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av landbruks~~POS=TRUNC og Agro basert industri, Malaysia, NKEA stipend Scheme (NRGS) -NH0711S001 og University of Malaya /Ministry of Higher Education (UM /Mohe) High Impact stipend (HIRG) E00002-20001. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Quassinoids er en gruppe av diterpenoids funnet i planter av familien av bittervedfamilien som er i besittelse bioaktiviteter slik som anti-tumor [1,2], antituberkulose [3], anti-malaria [4,5], anti-ulcer [6,7], insektvekstregulerende [8], anti-HIV-[9] og anti-inflammatorisk [10,11]. Deres anti-kreft aktivitet ble grundig diskutert i tidligere omtaler [12,13]. Quassinoids ble rapportert som de viktigste komponentene som finnes i
eurycoma longifolia product: [14].
E
.
tilhører longifolia
til anlegget familien bittervedfamilien og er lokalt kjent som «Tongkat Ali» eller «Pasak Bumi» i Malaysia og Indonesia, «Ian-Don» i Thailand og «Cay ba binh» i Vietnam [15] .
E
.
longifolia
er en populær urt som brukes tradisjonelt til å forbedre mannlige libido, seksuelle dyktighet og fruktbarhet. På grunn av sin unike testosteron styrke eiendom, er de grove ekstrakter av denne planten nå mye markedsført og brukt til å øke mannlig virilitet og riktig seksuell dysfunksjon [14,15]. Flere studier har vist at inntak av ekstraktet økt produksjon av testosteron og bidratt til bedre sædkvalitet hos menn med idiopatisk infertilitet og testosteron nivået av sen-utbruddet hypogonadisme [16] og i androgen-mangel osteoporose dyremodell [17]. Den økte produksjonen av testosteron etter
E
.
longifolia
har blitt tilskrevet til økningen i humant choriongonadotropin nivå [18] og inhiberingen av aktiviteten av fosfodiesterase og aromatase omdannelsen av testosteron til østrogen, som deretter utløser hypothalamus-hypofyse-gonadal-aksen for å øke testosteronnivået [ ,,,0],19,20].
androgener som testosteron og 5α-dihydrotestosteron (DHT) er viktig for utvikling, modning og funksjon av prostatakjertelen. Ikke desto mindre, deregulering av androgenreseptoren (AR) reaksjonsveien har vært implisert i godartede og ondartede prostata forstyrrelser, så som benign prostatahypertrofi (BPH) og prostatakreft [21,22]. Etter heving av testosteron har blitt assosiert med en økning i risiko for prostata kreft [23], er mitogen i prostatiske celler [24-26] og har vist seg å være en sterk promoter svulst i gnager prostata [27], foretok vi foreliggende studie for å finne ut om
E
.
longifolia
ekstrakt fremmer eller hemmer prostatakreft cellevekst.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Eksperimenter med mus ble utført i henhold til protokollen godkjent ved det medisinske fakultet Institutional Animal Care og bruk komité, Universitetet i Malaya (Ethics Referansenummer: 2013-06-07 /PHAR /WPF). Hele forsøket ble utført i AAALAC International akkreditert Animal Experimental Enhet for Det medisinske fakultet, Universitetet i Malaya.
Utarbeidelse av en standardisert quassinoids sammensetning fra
E
.
longifolia
En standardisert quassinoids sammensetning (SQ40) inneholder 40% av de totale quassinoids i
E
.
longifolia
ble fremstilt i henhold til metoden til lav undersøkelse [28]. Kort, lufttørket pulverisert røtter (15 kg) av
E
.
longifolia
ble ekstrahert med 6 × 4 liter 95% metanol i 6 dager ved 60 ° C. Den kombinerte metanolekstrakt ved fordampning til tørrhet under partielt vakuum ga en mørk brun rest på 450 g (3% w /w), som var ved kromatografert på en ferdigpakket Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japan) harpikskolonne. Den valgte quassinoid rike fraksjon, SQ40 ble utledet ved eluering med en gradient med H
2O-MeOH-blandinger (1: 0 til 0: 1) ved avtagende polaritet [20], og deretter tørket under partielt vakuum til 45 g ( 10% vekt /vekt av råekstrakt). Den høyytelses væskekromatografisk (HPLC) analyse kvantifisert de store quassinoids som 32,16% vekt /vekt i SQ40, bestående av 14,49 ± 0,26% av eurycomanone, 7,39 ± 0,17% epoxyeurycomanone, 0,72 ± 0,06% 13,21-dihydroeurycomanone og 9,54 ± 0,22% w /w eurycomanol [19]. Disse quassinoids ble isolert og deres rensede strukturer (mer enn 95%) ble identifisert og bekreftet etter den protokoll som er beskrevet tidligere [29-31]. Renheten av forbindelsene ble bestemt med Empower to arbeidsstasjonen (Waters, Milford, MA, USA) som drives i et Waters Delta Prep HPLC-system utstyrt med en Waters 2996 fotodiodeseriedetektor.
Fremstilling av trekull-strippet serum (CSS)
trekull-strippet serum (CSS) ble fremstilt som beskrevet tidligere for å utarme vekstfaktorene som er tilstede i serum [32]. I korte trekk ble 5 g dekstran-belagt trekull (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tilsatt til 500 ml føtalt bovint serum (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og blandes forsiktig i en time. Den FBS ble deretter sentrifugert ved 2500 x g i 10 minutter under steril tilstand. Serum supernatant ble så samlet opp og underkastet en andre syklus av dekstran-belagt trekull-behandling. Til slutt ble serumet filtrert gjennom et 0,2 um porøs membran (Orange Scientific, Braine-l’Alleud, Belgia) og lagret ved -20 ° C for videre bruk. Sterilitet av CSS ble kontrollert ved å inkubere del av media i en fuktig atmosfære som inneholder 5% CO
2 i 14 dager.
Cell kultur
Menneskelig prostatakreft, LNCaP og PC- 3-celler, human normal prostata, RWPE-1-celler og human normal lever, ble WRL 68 celler kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). LNCaP celler ble avledet fra supraclavicularis lymfeknute av pasient som prostatakreft var utstilling androgen uavhengig vekst. LNCaP celler er androgen følsom og uttrykke prostataspesifikt antigen (PSA), prostata syre fosfatase og AR [33]. LNCaP-celler har et enkelt punktmutasjon i kodon 868 (Thr til Ala) i androgen-bindende domene av AR og reagere ikke bare på androgener, men også for å antiandrogens, østrogener og progestiner [34]. PC-3-celler ble avledet fra benmetastaser hos en pasient med klasse IV prostata adenokarsinom og ikke reagerer på androgener, glukokortikoider, eller epidermale eller fibroblast vekstfaktorer [35]. RWPE-1-celler ble den ikke-neoplastiske voksne humane prostatiske epitelceller fra randsonen av et histologisk normalt voksent menneske prostata og er immortalisert med humant papillomavirus 18 [36]. LnCap og PC-3-celler ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI 1640, Invitrogen, Carlsbad, USA) supplementert med 10% volum /volum FBS og 1% volum /volum penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, USA) mens RWPE -1-celler ble dyrket i keratinocytt-serumfritt medium (K-SFM, Invitrogen, Carlsbad, USA) supplert med 0,5% volum /volum penicillin-streptomycin. WRL 68 celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, USA) supplementert med 10% volum /volum FBS og 1% volum /volum penicillin-streptomycin. Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i fuktig atmosfære med 5% CO
2 i luft.
Celleviabilitet assay
Virkningen av SQ40 på levedyktigheten av LNCaP, PC- 3, RWPE-1 og WRL 68-celler ble bestemt ved 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl tetrazoliumbromide (MTT; Invitrogen, Carlsbad, USA) assay. I korthet ble cellene sådd ut på 96-brønners plater ved optimal celletetthet på omtrent 1,5 x 10
4 LNCaP-celler /brønn; 1,25 x 10
4 PC-3 celler /brønn; 1,5 x 10
4 RWPE-1 celler /brønn; 1,25 x 10
4 WRL 68 celler /brønn. Etter 24 timer ble cellene behandlet med økende konsentrasjoner (2,5 til 100 ug /ml) av SQ40 i 72 timer. Ved slutten av inkuberingen, ble MTT-analyse utført som beskrevet tidligere [37]. Cellen levedyktighet ble beregnet som prosentandel av cellelevedyktighet i forhold til kjøretøyet kontrollceller ble bestemt å være 100% levedyktighet. Til slutt, halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) ble bestemt ved hjelp av GraphPad Prism programvare versjon 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, California).
dihydrotestosteron (DHT) behandling
LNCaP-celler ble behandlet med 5α-androstan-17β-ol-3-on (DHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble anvendt for å undersøke responsen til disse cellene til mitogen stimulering av DHT. Før behandlingen, LNCaP-celler ble dyrket i RPMI supplert med 5% CSS i 48 timer for å unngå forstyrrelser av androgener og andre vekstfaktorer som er tilstede i fullstendig FBS. Omtrent 1,5 x 10
4 LNCaP-celler /brønn ble sådd ut på 96-brønners plate og behandlet med økende konsentrasjoner (20-140 nM) av DHT med eller uten 3, 6 og 12 ug /ml av SQ40 i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse.
myk agar-kolonidannelsesbestemmelsen
LNCaP-celler ble forbehandlet med SQ40 ved sin IC
50 verdi i 72 timer. Før såing på soft agar, ble enkeltcellesuspensjon erholdt ved å føre cellene gjennom en fin nål. Fem tusen SQ40-behandlede og kjøretøy-kontrollerte celler ble blandet med vekstmedium inneholdende 0,3% agar og sådd på toppen av et basislag inneholdende 0,5% agar i vekstmedier i 60 mm petriskåler. Kulturene ble inkubert ved 37 ° C i fuktig atmosfære med 5% CO
2 i luft i ytterligere 3 uker. Mediene var opp igjen etter 3 dager med frisk vekst medium. Ved endepunktet av eksperimentet, kolonier bare større enn 0,5 mm ble talt under mikroskopet.
Real-time analyse celleproliferasjon
Vekstkinetikk LNCaP og RWPE-1 celler ble undersøkt sanntid av real-Time Cell Analysis (RTCA) System (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) som tidligere beskrevet [37]. Impedansen vil øke når festede celler feste og spredt over sensoren overflaten av en elektrode og nedgang når cellene runde opp og løsne. I korthet, ble 50 ul av ferdig kulturmedium satt til hver brønn av E-plate 16 og bakgrunn lesning ble notert. En cellesuspensjon av 50 ul ved celletetthet på 3,0 x 10
4 celler /brønn ble deretter tilsatt til hver brønn av E-plate 16. De endringer i impedans på grunn av celleadhesjon, proliferasjon og sprer ble overvåket over natten. Når cellene angitt logaritmisk vekstfase, ble cellene behandlet med 2,5 til 80 ug /ml av SQ40. Cellene ble behandlet med komplett vekstmedium ble omtalt som kjøretøykontroll mens 5 mikrometer paclitaxel-behandlede celler ble omtalt som positiv kontroll. Cellene ble deretter overvåket i ytterligere 72 timer. De impedansverdier ble uttrykt som celleindeks (CI). Vekstkurver ble normalisert til den CI av den siste målte tids punkt før tilsetning av medikamenter eller bærerkontroll.
Trypan blå eksklusjon test
Konfluent LNCaP-celler ble behandlet med bærer kulturmedium, 3 , 6, 12 og 20 ug /ml av SQ40 i 72 og 96 timer. LNCaP-celler ble behandlet med 1 pM paclitaxel i 72 og 96 timer ble brukt som positiv kontroll, og de ubehandlede celler ble anvendt som negativ kontroll, respektivt. De behandlede og kjøretøy kontrollceller ble høstet ved sluttpunktet av inkubasjonsperioden og cellene suspensjoner ble blandet med 0,4% trypanblått-oppløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i et forhold på 1: 1 og inkuberes i 3- 5 minutter. De fargede og ufargede celler ble talt opp ved hjelp av en hemocytometer kammer. Prosentandelen av døde celler i hver konsentrasjon ble beregnet i henhold til ligningen nedenfor. Product: (1)
cellesyklusanalyse
Konfluent LNCaP-celler ble behandlet med bærer kulturmedium, 3, 6 og 12 ug /ml av SQ40 for 24, 48 og 72 timer. Cellesyklus analyse ble utført ved hjelp av Cycle TEST PLUS DNA Reagent Kit (BD Biosciences, New Jersey, USA). Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble de behandlede cellene høstet, vasket og farget med propidiumjodid i henhold til produsentens instruksjon. Etter farging ble prøvene analysert ved FACSCanto II strømningscytometri (BD Biosciences, New Jersey, USA). Et minimum på 20.000 hendelser per prøve ble registrert for hver prøve, og dataene ble analysert ved hjelp av flowcytometri DNA Modeling Software, ModFit LT 3.2 (Verity Software House, USA).
immunoblotanalyse
protein uttrykk for G
1 /S regulatorer som cyclin-avhengig kinase (CDK), CDK4, cDK2, Cyclin D1, Cyclin D3, p21
Waf1 /Cip1 og p27
Kip1 og kløyvet-poly (ADP -ribose) polymerase (PARP) ble analysert ved immunblotting. Cellelysater ble fremstilt ved å anvende radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) Lysis Buffer System i nærvær av 1% fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) løsning, 1% natrium-ortovanadat oppløsning og 1% protease inhibitor cocktail løsning. Proteinkonsentrasjonen i cellelysatene ble bestemt ved Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Walthan, MA). Lik mengde av proteiner ble underkastet 12% natriumsulfat docecyl-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og deretter overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (porestørrelse 0,45 um, Milipore, Bedford, MA). Membranene ble deretter undersøkt med primære antistoffer mot CDK4, CDK2, cyclin D1, Cyclin D3, p21
Waf1 /Cip1, p27
Kip1 og kløyvet-PARP (Asp214) (D64E10) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA ). Dette trinn ble etterfulgt av inkubasjon med de passende sekundære antistoffer konjugert til pepperrot-peroksidase. Etter at vasketrinnene, ble proteinbåndene visualisert ved hjelp av kolorimetrisk 3,3,5,5 tetramethylbenzine (TMB; Sigma Aldrich, Louis, MO) løsning og kvantifisert ved anvendelse av en gel dokumentasjonssystem (BioRad, Richmond, CA)
androgen reseptor (AR) og prostataspesifikt antigen (PSA) ELISA
Kort oppsummering LNCaP celler ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 5% CSS i 48 timer. Cellene ble deretter behandlet med 3, 6 og 12 ug /ml av SQ40 med eller uten 100 nM DHT i ytterligere 72 timer. DHT ble lagt for å stimulere AR trans. Atom fraksjonen ble hentet fra cellelysat ved hjelp Nuclear Extraction Kit (Cayman Chemical, MI, USA) og atom AR nivå ble målt ved hjelp av Nuclear Receptor Sandwich AR ELISA (Active Motif, Carlsbad, USA). AR-nivået ble normalisert til total kjerneproteinnivå. I det samme eksperimentet, ble vekstmedium av kjøretøyet kontroll og behandlede celler oppsamlet og det utskilte PSA-nivået ble kvantifisert ved prostata spesifikt antigen Humant ELISA Kit (Abcam, MA, USA). PSA-verdiene ble normalisert mot total celle nummer.
In vivo
LNCaP xenograft studie
Mann NCR immunsvikt mus, 5 uker gamle, 20-25 gram ble kjøpt fra InVivos Pte. Ltd (Singapore) og holder til i individuelt ventilerte bur under konkrete patogen-frie forhold og vedlikeholdes på en 12 timers lys-mørke-syklus ved 24 ° C. Dyrene ble gitt med sterilt mat og vann ad Libitium. Musene ble bedøvet før injeksjonen av LNCaP-celler (2 x 10
6) med 50% matrigel (0,1 ml; Becton Dickinson, Jersey, USA) inn i den høyre flanken av naken mus subkutant. Behandlingen ble igangsatt da svulstene var følbar. Tumor-bærende mus ble tilfeldig inndelt i 4 grupper. Hver gruppe besto av 6 dyr. Disse grupper av mus ble deretter gitt intraperitoneale injeksjoner av kjøretøy-løsning (saltvann), 5 mg /kg paclitaxel (positiv kontroll), 5 og 10 mg /kg SQ40 tre ganger i uken i 6 uker. Tumorstørrelse ble palperes og lengde og bredde ble målt med et skyvelære. Tumorvolumet ble beregnet ved anvendelse av formelen, 0,5 x lengde x bredde
2. Vekten og tumorvolum hos hver mus ble målt en gang i uken over et tidsrom på 6 uker. Musene ble avlivet når tumorknuter nådde 1,5 cm i diameter.
Statistisk analyse
Alle analyser ble utført i minst tre separate forsøk. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Statistiske analyser ble utført ved anvendelse av enveis variansanalyse (ANOVA), med Bonferroni multiple sammenligningstest ved bruk av GraphPad Prism software (versjon 5.0). Statistisk signifikans ble uttrykt som *,
p
0,05; **,
p
0,01; ***,
p
0,001 versus kjøretøy kontroll og
#
p
0,05;
##
p
0,01;
###
p
. 0,001 versus 100 Nm DHT-stimulerte celler
Resultater
SQ40 selektivt cytotoksisk til LNCaP prostatakreftceller og hemmet DHT stimulert veksten av LNCaP celler
In vitro
cytotoksisitet aktivitet SQ40 ble undersøkt på menneskelig normal prostata, RWPE-1 celler, humant normalt lever, WRL 68 celler, human prostatakreft, PC- 3 og LNCaP celler. Konsentrasjonene som forårsaket halv maksimal hemmende effekt (IC
50) på RWPE-1 og WRL 68 celler var 59,26 mg /ml og 27,69 mg /ml, henholdsvis (fig. 1, sorte og blå linje). SQ40 hemmet LNCaP-cellevekst ved IC
50 av 5,97 mikrogram /ml i en doseavhengig måte (fig. 1, rød linje). IC
50 verdier av quassinoids preparatet på RWPE-1 og WRL-68 celler ble høyere sammenlignet med den i LNCaP-celler, noe som antyder at SQ40 var mer selektiv til LnCap kreftceller enn normale celler. På den annen side, SQ40 hemmet 50% av cellevekst på PC-3-celler i en konsentrasjon høyere enn (87,94 mg /ml, Fig. 1, grønn linje) som fra LNCaP-celler som tyder på at den quassinoid rike fraksjon påvirket LNCaP-celler, men ikke PC-3 prostata kreft celler.
RWPE-en normal prostata celler (svarte), WRL 68 normale leverceller (blå), LNCaP (rød) og PC-3 prostatakreftceller (grønt) ble behandlet med økende konsentrasjoner (2,5 til 100 ug /ml) av SQ40 i 72 timer og cellelevedyktighet ble målt ved hjelp av MTT-reduksjon analyse. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av fire uavhengige eksperimenter. IC
50 verdier av SQ40 på RWPE-1, WRL 68, LNCaP og PC-3-celler etter 72 timers behandling var 59,26 mg /ml, 27,69 pg /ml, 5,97 pg /ml og 87,94 mg /ml, respektivt.
Den cytotoksiske effekten av SQ40 ble videre evaluert på androgen-stimulert LNCaP prostata kreft celler. LNCaP-celler ble først tillatt å vokse i dyrkningsmedium som supplementert med 5% CSS og DHT ble tilsatt for å stimulere celleproliferasjon. I nærvær av økende konsentrasjoner av DHT, ble LNCaP-celler stimuleres til å vokse eksponensielt. Samtidig behandling med 3, 6 og 12 ug /ml SQ40 hemmet LNCaP-cellevekst med mer enn 50% sammenlignet med celler stimulert med DHT alene (fig. 2).
LNCaP-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av DHT med eller uten 3, 6 og 12 ug /ml av SQ40 i 72 timer i RPMI 1640 supplert med 5% CSS og cellenes levedyktighet ble målt ved anvendelse av MTT-reduksjon analyse. Prosentandel av levende celler ble beregnet i forhold til bærerkontrollceller uten DHT behandling. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
SQ40 trykt forankringsuavhengig vekst av LNCaP celler
Effekten av SQ40 på LNCaP celler forankringsuavhengig vekst ble undersøkt ved hjelp av soft agar assay. De LNCaP celler ble forbehandlet med SQ40 på sitt IC
50 verdi for 3 dager før plating på den myke agar media på en lik celle nummer i forhold til bilens kontrollcellene. Størrelsen på quassinoids sammensetning behandlede cellekolonier er markert redusert sammenlignet med bærerkontrollcellekolonier (Fig. 3A og 3B). I tillegg ble kolonidannelse effektiviteten av SQ40-behandlede LNCaP-celler signifikant redusert sammenlignet med bærerkontrollen (fig 3C;.
p
0,05). Dette funn tyder på at SQ40 hemmet forankrings-uavhengig vekst av LNCaP prostatakreftceller.
LNCaP-celler ble forbehandlet med SQ40 eller bærerkontroll i 72 timer og deretter sådd ut på soft agar mediet i ytterligere 3 uker. Representative kolonier av (A) bærerkontroll og (B) SQ40-behandlede LNCaP-celler er vist. (C) Grafiske fremstillinger av myk agar-kolonidannelse effektivitet. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter for kjøretøykontrollceller og seks uavhengige eksperimenter for SQ40-behandlede celler. * Viser
p
. 0,05 versus kjøretøy kontroll
SQ40 hemmet LNCaP cellevekst ved lav konsentrasjon, men indusert celledød ved høy konsentrasjon
Vekst kinetikk LNCaP og RWPE-1 celler ble overvåket i sanntid ved hjelp av en impedans-basert mobil sensing målesystem. Det ble observert at de normaliserte CI verdiene for SQ40-behandlede LNCaP-celler viste en jevn nedgang etter 6 timers behandling med quassinoids sammensetning. Etter 72 timers behandling ble det observert at det LNCaP-celler behandlet med lavere konsentrasjoner (2,5-10 ug /ml) av SQ40 bare mottok omtrent halvparten av de normaliserte CI verdiene av kjøretøykontrollceller og dette tyder på at SQ40 ved lave konsentrasjoner utøver cytostatisk effekt på LNCaP celler. Imidlertid SQ40 ved høyere konsentrasjoner (20-80 ug /ml) resulterte i svært lave normaliserte KI verdier tilsvarende den for den positive kontrollen, 5 uM paclitaxel-behandlede celler (Fig. 4A).
Vekstkinetikken av (A) LNCaP og (B) RWPE-1 celler ble undersøkt i sanntid ved hjelp av RTCA. De impedansverdier som ble registrert i sann tid, og ble uttrykt som celleindeks (CI). Celler behandlet med vekstmedier alene ble omtalt som kjøretøykontroll mens 5 mikrometer paclitaxel-behandlede celler ble omtalt som positiv kontroll. (C) SQ40-behandlede LNCaP-celler ble farget med 0,4% trypanblått-løsninger i et forhold på 1: 1 etter 72 og 96 timers behandling hhv. Celler behandlet med vekstmedier alene ble omtalt som kjøretøykontroll mens 1 mikrometer paclitaxel-behandlede celler ble omtalt som positiv kontroll. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. ** Indikerer
p
0,01 versus 72-timers behandlet kjøretøy kontroll.
## indikerer
p
0,01;
###
p
. 0,001 versus 96-timers behandlet kjøretøy kontroll
I kontrast til normal prostata RWPE-1 celler behandlet med 20 ug /ml av SQ40 viste normaliserte CI-verdier som var lik de av kjøretøyet kontrollcellene som tyder på at SQ40 ved disse dosene induserte ikke cytotoksisk effekt på normale prostataceller. Imidlertid cytotoksisitet ble observert på RWPE-1-celler ved meget høye konsentrasjoner av quassinoids sammensetning (40 og 80 ug /mL, Fig. 4B). I alle påfølgende studier, 3, 6, og 12 ug /ml av SQ40 ble brukt til å behandle LNCaP-celler. For å demonstrere at påfølgende molekylære virkninger av SQ40 ved disse doser ble ikke bidro med den høye prosentandelen av døde celler, ble trypan blå eksklusjon farving utført for å bestemme prosenten av levedyktige celler i kulturene. Etter 72 timers behandling var prosentandelen av døde celler var ~ 20% og 35% i 12 og 20 ug /mL SQ40-behandlede LNCaP-celler når sammenlignet med den ubehandlede kontroll. En forlenget behandling varte i 96 timer økte prosentandelen av døde celler til ~ 30% og ~ 60% i 12 og 20 ug /mL SQ40-behandlede LNCaP-celler, respektivt (figur 4C;.
p
0,001 ).
SQ40 indusert G
0 /G
1 fase arrest i LNCaP celler
celle~~POS=TRUNC syklus~~POS=HEADCOMP analyse ble utført for å undersøke den hemmende effekten av SQ40 i cellesyklusprogresjon av LNCaP celler. LNCaP-celler på 70-80% konfluens ble behandlet med 3, 6 og 12 ug /ml av den quassinoids sammensetning for 24, 48 og 72 timer. Som vist på fig. 5, SQ40 betydelig arrestert LNCaP-celler ved G
0 /G
en fase i en dose- og tidsavhengig måte. Ved 24-timers behandling, LNCaP celler viste høyere G
0 /G1 fase cellepopulasjon på 80,22% (
p
0,01) i 3 mg /ml quassinoids celler sammensetning behandlet og 85,45% (
p
0,001) i 6 mikrogram /ml quassinoids celler sammensetning behandlet i forhold til bilens kontrollcellene (65,22%, fig. 5A). Cellen befolkning på 6 mikrogram /ml quassinoids sammensetning behandlet LNCaP cellene i G
0 /G
1 fase betydelig økt til 96,15% (
p
0,001) og 93,67% (
p
. 0,001) etter 48- og 72-timers behandling, henholdsvis (figur 5A). Den økning i andelen av cellepopulasjonen i G
0 /G
1 fase ble ledsaget av en reduksjon i prosentandelen av cellepopulasjonen i S-fasen (3,11%;
p
0,01) og G
2 /M fase (3,21%) på LNCaP celler etter 72 timers behandling (fig. 5D). Disse betydelige endringer antyder at SQ40 hemmet veksten av LNCaP-celler ved å arrestere cellene ved G
0 /G
1 fase.
LNCaP-celler ble behandlet med vekstmedium (bærerkontroll), 3, 6 og 12 ug /ml av SQ40. Celle fordeling i (A) G
0 /G
1, (B) S og (C) G
2 /M-fase ved 24, 48 og 72 timer etter behandling ble analysert ved FACSCanto II flowcytometri og evaluert med ModFit cellesyklusanalyse programvare. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * Viser
p
0,05; **,
p
0,01; ***,
p
0,001 versus kjøretøy kontroll. (D) Protein ekspresjon av spaltet PARP-i LNCaP-celler etter behandling SQ40 i 72 og 96 timer. β-actin tjente som en kontroll lasting.
På den annen side, LNCaP-celler ble behandlet med 12 ug /ml av SQ40 viste en signifikant økning i G
2 /M-fasen etter 72 timer etter behandling. G
2 /M fase cellepopulasjonen i 12 mikrogram /ml SQ40-behandlede LNCaP celler var 9,58%, 8,94% og 10,23% (
p
0,01) etter 24-, 48-, og 72- timers behandlinger, henholdsvis, mens de av kjøretøykontrollcellene var 10,55%, 7,95% og 4,58% etter 24-, 48-, og 72-timers behandling, henholdsvis (fig. 5C). I tillegg spaltes PARP-, ble en apoptotisk markør påvises når behandlingsvarigheten med 12 ug /ml av SQ40 ble utvidet til 96 timer. Videre spaltet-PARP er også betydelig detektert på 72 timer, når konsentrasjonen av SQ40 ble øket til 20 pg /ml (fig. 5D). Samlet utgjør disse funnene tyder på at SQ40 indusert celledød følgende G
2 /M arrest.
SQ40 hemmet veksten av LNCaP celler ved nedregule CDK4, CDK2 og cyclin D1 proteiner og opp regulerende p21
WAf1 /Kip1 protein uttrykk nivå
Immunanalyse analyse~~POS=HEADCOMP ble utført for å undersøke effektene av SQ40 på cellesyklus regulatorisk protein uttrykk. Ekspresjonsnivået av G
1 /S regulatoriske proteiner inkludert CDK4, CDK2, cyklin D1 og syklin D3 var oppregulert i LNCaP-celler når de ble stimulert til å proliferere med DHT, en metabolitt av testosteron (fig. 6). Tilstedeværelsen av SQ40 i 100 nM DHT-stimulerte LNCaP-celler nedregulert protein ekspresjonsnivåene av CDK4, CDK2, cyklin D1 og D3 syklin på en doseavhengig måte (fig. 6). I tillegg SQ40 øket protein ekspresjonsnivået av cellesyklus-inhibitor p21
Waf1 /Kip1 i nærvær av 100 nM DHT, men den quassinoids sammensetningen ikke påvirker ekspresjonen nivået av p27
Kip1 etter 72 timers behandling i LNCaP celler. Disse resultatene videre støttet flowcytometri funn som SQ40 stansede celler ved G
0 /G
1 fase.
LNCaP-celler ble først dyrket i vekstmedium supplementert med 5% CSS i 48 timer og deretter behandlet med 3, 6 og 12 ug /ml av SQ40 med nærvær av 100 nM DHT i 72 timer. Immunoblotting ble utført på proteinekstrakter for å oppdage CDK4, CDK2, cyclin D1, Cyclin D3, p21
Waf1 /Cip1 og p27
Kip1. β-actin fungert som en lasting kontroll.
SQ40 trykkes AR proteinnivå og redusert produksjon av PSA i LNCaP celler
Effekten av SQ40 på AR protein av LNCaP ble undersøkt neste. Nuclear AR ekstrakt i 100 nM DHT stimulerte-LNCaP-celler økte med 25% sammenlignet med ustimulerte celler (fig. 7A). SQ40 behandling på 3 og 6 mikrogram /ml alene reduserte basalatom AR nivå med 25%, så vel når sammenlignet med ustimulerte celler (figur 7A;.
p
0,05). Derfor kombinasjonsbehandling av DHT og quassinoids komposisjon ved 3 og 6 mikrogram /ml ikke påvirke atom AR nivå i forhold til de ustimulerte celler (Fig 7A;.
p
0,05).
