Abstract
Aktivering av Wnt /β-catenin veien har blitt observert i minst 1/3 av hepatocellulært karsinom (HCC), og et betydelig antall av disse har mutasjoner i β-catenin genet. Derfor kunne effektiv inhibering av denne veien tilveiebringe en ny metode for å behandle HCC. Den hensikt med denne studien var å finne ut om FH535, som tidligere ble vist å blokkere β-catenin vei, kan hemme β-catenin aktivering av målgener og hemme spredning av leverkreft stamceller (LCSC) og HCC cellelinjer. Ved hjelp av β-catenin som reagerer rapportørgener, tyder våre data på at FH535 kan hemme målgenet aktiveringen av endogent og eksogent uttrykt β-catenin, inkludert konstitutivt aktiv form av β-catenin som inneholder en Serine37Alanine mutasjon. Våre data indikerer også at spredning av LCSC og HCC linjer inhiberes av FH535 på en doseavhengig måte, og at dette korrelerer med en reduksjon i prosentandelen av celler i S-fasen. Til slutt viser vi også at ekspresjon av to velkarakteriserte mål for β-catenin, Cyclin D1 og Survivin, reduseres med FH535. Til sammen viser disse dataene at FH535 har potensial terapeutisk verdi i behandling av leverkreft. Viktigere, disse resultatene tyder på at denne behandlingen kan være effektiv på flere nivåer ved å målrette både HCC og LCSC
Citation. Gedaly R, Galuppo R, Daily MF, Shah M, Maynard E, Chen C, et al. (2014) Targeting Wnt /β-catenin signalveien i Liver Cancer stamceller og leverkreft cellelinjer med FH535. PLoS ONE 9 (6): e99272. doi: 10,1371 /journal.pone.0099272
Redaktør: Zhiyuan Gong, National University of Singapore, Singapore
mottatt: Oktober 30, 2013, Godkjent: 12 mai 2014; Publisert: 18 juni 2014
Copyright: © 2014 Gedaly et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne publikasjonen ble støttet av tilskuddet antall UL1RR033173 [TL1 RR033172, KL2 RR033171] fra National Center for Forskning Resources (NCRR), DK074816 (BTS) finansiert av Office of direktør, National Institutes of Health (NIH), og støttes av NIH Roadmap for medisinsk forskning. Denne forskningen også ble støttet av flowcytometri og Cell Sortering delt ressurs ved University of Kentucky Markey Cancer Center (P30CA177558). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av NCRR og NIH. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC), den vanligste leverkreft, er den femte vanligste kreftformen og den tredje høyeste årsaken til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis [1] – [2]. Den alarmerende økning i HCC forekomst i Europa og Nord-Amerika de siste årene er knyttet hovedsakelig til hepatitt C-infeksjon, selv om andre faktorer som høyt alkoholforbruk og fedme også bidra til denne økningen [3]. Årsakene til HCC er komplekse og involverer mange genetiske og epigenetiske forandringer og forstyrrelser av ulike signalveier inkludert Wnt /β-catenin, Ras /Raf /MAPK, PI3K /AKT /mTOR, HGF /c-MET, IGF, VEGF og PDGF veier. Blant disse er det Wnt /β-catenin vei regnes blant de vanskeligste å hemme [4]. Foreløpig noen kjemiske midler rettet mot Wnt /β-catenin sti er tilgjengelige eller under etterforskning [5].
Aktivering av den kanoniske Wnt /β-catenin pathway involverer binding av Wnt proteiner til celleoverflaten frizzled reseptorer og LRP5 /6 co-reseptorer. I fravær av wnt proteiner, mye av den cellulære β-catenin er bundet til E-cadherin på cellemembranen. Cytosol β-catenin er konstitutivt fosforylert ved bestemte serinresidua av en enzymatisk kompleks som inkluderer adenomatøs polypose coli (APC), Axin, og kinaser glykogensyntasekinase-3β (GSK-3β) og kasein kinase jeg, merking det for ubiquitin-mediert proteolyse. Under disse betingelser, det TCF /LEF transkripsjonsfaktorer er bundet til deres beslektede DNA-gjenkjenningselementer sammen med medlemmer av familien av Groucho co-repressorer, opprettholde den transkripsjonelle stanse av β-catenin målgener. Inngrep av wnt proteiner med den frizzled reseptoren aktiverer Dishevelled protein, noe som resulterer i dissosiasjonen av cytosoliske destruktive kompleks og hemming av GSK-3β. Dette fører til stabilisering og akkumulering av cytoplasmisk β-catenin, noe som deretter går inn i kjernen, binder TCF /LEF proteiner og som fører til den påfølgende dissosiasjon av Groucho co-repressorer, rekruttering av coactivator P300 og aktivering av β-catenin målgener [ ,,,0],6] – [9]. Mange av de β-catenin mål, deriblant Cyclin D1, c-myc og Survivin, fremmer cellesyklusprogresjon og inhibere apoptose [10] – [12]. I samsvar med denne data, blir aktivering av Wnt /β-catenin bane sett i en rekke kreftformer, inkludert HCC. Avvikende aktivering av Wnt /β-catenin reaksjonsvei er blitt observert i minst 1/3 av HCC, og omtrent 20% av HCCs har mutasjoner i β-catenin genet. Mer enn 50% av HCC svulster viser atom akkumulering av β-catenin som indikerer at andre faktorer kan være involvert, slik som avvikende metylering av tumor suppressorer APC og E-cadherin, inaktivering av kasein kinase og GSK-3β, eller økt sekresjon av wnt ligants [4] -. [5]
det har vært økende interesse i rollen leveren kreft stamceller (LCSC) i tumorigenesis, tumorprogresjon, invasjon og metastaser. Kreft stamcelle teori antyder at en svulst består av en heterogen populasjon av celler som danner en distinkt cellulær hierarki. Nyere studier har gitt overbevisende bevis for at disse cellene finnes i faste tumorer i mange typer, inkludert, hjerne, bryst, kolorektal, leveren, bukspyttkjertelen og prostata cancer. I 2006, to forskjellige grupper isolert en CD133 + undergruppe fra HCC cellelinjer og beskrevet høyere proliferativ og karsinogent potensial, i samsvar med stamcelleegenskaper. CD44 ble også funnet som en viktig markør som brukes i kombinasjon med andre stamcellemarkører for å bedre definere overflate fenotypen av LCSC. Det har blitt vist at CD133 + og CD90 + celler som ko-uttrykker CD44 + er mer aggressive enn de som uttrykker CD133 eller CD90 alene [13] – [14]
De kjemiske stoffer som brukes til å målrette Wnt- /β-catenin pathway. er på membranen, cytosol og transkripsjonsfaktornivåer [5]. De små molekylære midlet FH535 er en dobbel inhibitor av peroksisomproliferator-aktivert reseptor (PPAR) og β-catenin /TCF /LEF. FH535 har vist seg å hemme proliferasjon av HCC og hepatoblastoma cellelinjer og dens spesifisitet på inhibering av β-catenin /TCF /LEF aktivitet ble illustrert i hepatoblastoma cellelinje HepG2 [15].
Formålet med denne studien var for å avgjøre om FH535 kan hemme aktiveringen av β-catenin-regulerte gener ved endogene og ectopically uttrykt β-catenin i HCC cellelinjer Huh7, Hep3B og PLC og leverkreft stamceller (LCSC). Spesifisiteten til FH535 på hemming av β-catenin via TCF /LSF aktivering ble analysert i dual luciferase reporter transfektert i LCSC og i HCC celler. Spredning, cellesyklus, og andre målrettede gener og proteiner ble analysert.
Materialer og metoder
2.1 Cellekultur
HCC cellelinje Huh7 [16] var en gave fra Dr. Guangxiang Luo (University of Alabama – Birmingham). HCC cellelinjer Hep3B og PLS ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Hep3B og PLC både uttrykke HBV overflate antigen, og Huh7 uttrykke hepatitt delta antigen. Den Hep3B er p53 negativ, PLC har redusert p53-ekspresjon, og Huh7 har økt p53-protein nivå [17] – [18]. Disse cellelinjene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), glutamin og penicillin /streptomycin. De lever kreft stamceller (LCSC; Catalog # 36116-43, CelProgen, San Pedro, CA, USA) ble utvidet til og brukes i løpet av de 4 første passasjer i CelProgen komplett vekstmedier med 10% FBS i ekstracellulære matriks (ECM ) belagt kolber (CelProgen). Flowcytometri profil og tumorigenisitet av LCSC er vist i figurene S1 og S2. Andre cellelinjer ble dyrket i standard og plast uten ECM belegg. Cellene ble dyrket i NuAire inkubator (Plymouth, MI, USA) ved 37 ° C med 5% CO
2.
2.2 Kjemikalier
FH535, XAV939 og LiCl ble kjøpt fra Sigma- Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Metyl
3H-tymidin (2 Ci /mM) var fra MP Biomedicals (Costa Mesa, CA, USA). X-Treme Gene 9 og Turbofect transfeksjon reagenser var fra Roche (Indianapolis, Indiana, USA) og Thermo Scientific (Waltham, MA, USA), henholdsvis. Den propidiumjodid-baserte cellesyklusanalyse kit var fra GenScript (Piscataway, NJ, USA). Alle andre kjemikalier var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).
2,3 Plasmider
TOPFlash luciferasereportergenet, som inneholder 3 eksemplarer av en TCF /Lef bindingssete og FOPFlash luciferase reporter, identisk med TOPFlash unntatt TCF /LEF nettsteder har blitt mutert, ble kjøpt fra Addgene (Cambridge, MA, USA) [19]. PRL Renilla luciferase vektor var fra Promega (Madison, WI, USA). Ekspresjonsvektorer for villtype β-catenin og βCatS37A ble gitt av S. Byers [20] og E3-pGL3, som inneholder mus alfaføtoprotein Enhancer E3 smeltet til pGL3-promoter, ble beskrevet tidligere [21].
2,4
3H-tymidin-inkorpore-ringsanalyse
Denne analysen ble utført som tidligere beskrevet av den publiserte metode og av andre forskere [22] – [24]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater ved 1,000-5000 celle /brønn i 0,2 ml DMEM + 10% FBS og behandles i duplikat med forskjellige konsentrasjoner av FH535 i 72 timer. Cellene ble pulset med
3H-tymidin på 1 uCi /brønn i 4 timer. Alternativt ble cellene dyrket ved 2500 celler /brønn i 0,1 ml medium i 24 timer, etterfulgt av samtidig tilsetning av FH535 (0-15 uM) og
3H-tymidin (1 pCi /brønn) i et sluttvolum på 0,2 ml /brønn., etterfulgt av inkubasjon i ytterligere 18 timer. I begge tilfeller, ved slutten av inkubasjonen ble cellene vasket og fiksert i 0,3 ml 10% trikloreddiksyre (TCA) i 12 min. Etter aspirasjon av TCA ble cellene lysert i 0,2 M NaOH /0,2% SDS i 40 min.
3H-tymidin inkorporering ble målt ved scintillasjonstelling i en Packard Scintillation Analyzer (Covina, CA, USA). Vi gjorde ikke utføre MTT assay for celleproliferasjon å sammenligne med
3H-tymidin inkorporering fordi det er fargen reaksjon mellom FH535 og MTT assay reagens (tiazolyl blå tetrazoliumbromid). Konsentrasjonen av FH535 for å forårsake en 50% hemning av cellelaget (IC
50) ble bestemt ved følgende metode. Ingen legemiddel-data ble brukt som 100% ved Y-aksen, og fra dette til en 50% inhibering på Y-aksen er bestemt. Fra 50% verdien punkt, vi trekke en parallell linje med X-aksen (den legemiddelkonsentrasjonen aksen) for å identifisere den krysspunktet på konsentrasjonskurven. Fra korset punktet vi trekke en parallell linje til Y-aksen, og finne krysspunktet på X-aksen. Dette krysspunktet på x-aksen er IC
50 punkt. Alle forsøkene ble utført minst to ganger.
2,5 Forbigående transfections og Dual luciferase Analyser
For transfections, ble Huh7, PLC og LCSC belagt på 3 × 10
5 celler /brønn i en ml kulturmedium i 12 brønners plater; etter 24 timer, celler ble transfektert med TOPFlash /PRL vektorer (DNA ratio 10:1) eller FOPFlash /PRL vektorer (DNA ratio 10:1) ved hjelp av X-treme Gene 9 (Roche, Indianapolis, IN, USA) transfeksjon reagenvolumer etter produsentens anvisninger. Etter 6 timer, ble mediet aspirert og cellene ble tilsatt 1 ml kulturmedium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av FH535, DMSO alene (kjøretøy), og /eller 10 mM LiCl. I alle tilfeller, den endelige konsentrasjonen av DMSO var 0,08%. Mengden av kjøretøyet DMSO ble holdt konstant i medikamentell behandling og sluttkonsentrasjonen av DMSO i hver behandling var den samme og er designet til mindre enn 0,1%. Etter 36 timer ble to luciferasepreparater analyser gjort med Promega Dual Luciferase Assay System (Madison, WI, USA) i henhold til produsentens protokoller. Luciferase aktivitet ble målt i Lumat LB 9507 luminometer (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN, USA). I korthet ble cellene vasket en gang med sterilt PBS og lysert i 1 x lyseringsbuffer (Promega) (0,25 ml /brønn) i 15 minutter ved romtemperatur. Ti pl av råolje cellelysat (fremstilt i henhold til Promega Protocol) ble tilsatt til 50 ul av luciferase-assay LARII substrat i et 12 x 75 mm polystyren-rør (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) for å måle den ildflue luciferase-aktivitet, etterfulgt av tilsetning av 50 ul stopp og Glo substrat for å måle den Renilla luciferaseaktivitet. Den målte Renilla luciferaseaktivitet ble anvendt for å normalisere de målte ildflue luciferase-aktivitet.
For ko-transfeksjoner med β-catenin ekspresjonsvektorene, ble cellene sådd ut i 1 x 10
5-celler /brønn i 24-brønners plater. Celler ble transfektert med 340 ng luciferase reporter plasmid, 170 ng β-catenin ekspresjonsplasmid, og 10 ng PRL /brønn ved hjelp av Turbofect transfeksjon reagens (Pittsburg, PA, USA). Etter 5-6 timer ble FH535 (DMSO eller bærerkontroll) tilsatt. Etter ytterligere 36 timer ble celleekstrakter (fremstilt i henhold til protokollen Promega) fremstilles og brukes umiddelbart eller lagres ved -80 ° C. Alle transfeksjoner ble utført i duplikat og gjentatt minst to ganger. Luciferase analysene ble utført med celleekstrakter med Dual Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens protokoller. Luciferase-aktivitet ble målt in duplo.
2,6 cellesyklusanalyse
Huh7-celler ble dyrket i DMEM + 10% FBS i 24 timer. Cellene ble vasket med serumfritt DMEM 3 ganger, deretter dyrket i DMEM + 0,1% FBS i 24 timer for synkronisering av cellene. Cellene ble deretter dyrket i DMEM + 10% FBS med forskjellige konsentrasjoner av FH535 i 24 timer. Cellene ble høstet og farget med propidiumjodid (PI) og analysert ved flow-cytometri ifølge GenScript protokollen. LCSC ble dyrket i CelProgen komplett vekstmedium og behandles på samme måte som angitt ovenfor.
2,7 RT-PCR og Western analyse
RT-PCR.
Cellene ble dyrket i DMEM + 10% FBS i 100 mm vevskulturskåler til ~70% konfluens og deretter behandlet med DMSO alene eller økende konsentrasjoner av FH535 i DMSO i 38 timer. For RNA-analysen ble cellene høstet og cDNA ble fremstilt som beskrevet [21]. Kvantitativ PCR ble utført med SYBR grønn med Bio-Rad MyiQ termosykler med følgende primere: Survivin (BIRC5, CAAGGAGCTGGAAGGCTGG og GTTCTTGGCTCTTTCTCTGTCC), cyclin D1 (CCND1: GGATGCTGGAGGTCTGCGA og TAGAGGCCACGAACATGCAAGT), og β2-mikroglobulin (B2M: GACTTTGTCACAGCCCAAGATAG og TCCAATCCAAATGCGGCATCTTC ).
Western blot.
Huh7-celler (5 x 10
5) ble dyrket i DMEM + 10% FBS i 100 mm vevskulturskåler i 72 timer. Etter endring med friskt medium, ble cellene behandlet med 0, 2,5, 5 og 10 uM av FH535 i 38 timer. DMSO ( 0,1%) ble benyttet som bærerkontroll. Proteinkonsentrasjoner i celleekstrakter ble analysert med mikro BCA proteinanalysesettet i henhold til leverandørens protokoll (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). Spesifikke antistoffer ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Western Blot bandet tetthet ble analysert med NIH ImageJ programvare (Bethesda, Maryland, USA), og normalisert ved β-aktin. Alle de andre prosedyrer ble utført som tidligere beskrevet [25].
2.8 Statistisk analyse
Alle analysene ble utført ved hjelp av programvaren SPSS versjon 20 (International Business Machines Corporation, Endicott, NY, USA) . Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. Enveis ANOVA etterfulgt av Tukey korreksjon ble brukt til å sammenligne midler. Nivået av statistisk signifikans ble satt til
p
. 0,05
Resultater
3,1 FH535 hemmer transkripsjonen aktivering mediert av villtype og konstitutivt aktiv β-catenin
FH535 har vist seg å blokkere signalisering gjennom endogen β-catenin i flere cellelinjer, blant annet hepatoblastoma cellelinje HepG2 [15]. For ytterligere å utforske denne forskriften og for å teste om FH535 kan blokkere ektopisk β-catenin, co-transfections med β-catenin ekspresjonsvektorer og TCF4 avhengige luciferase reporter vektor TOPFlash ble utført i den menneskelige HCC cellelinjer Huh7 og Hep3B (fig. 1 ). I begge cellelinjer, ko-transfektert villtype β-catenin ekspresjonsvektoren økte luciferaseaktivitet fra TOPFlash nesten 15-ganger sammenlignet med celler ko-transfektert med tom vektor (E.V.) kontroll. Dette β-catenin avhengig økning ble inhibert med FH535 på en doseavhengig måte. β-catenin er ofte mutert i ulike kreftformer, inkludert HCC. En naturlig mutasjon endrer serin i posisjon 37; dette endret form av β-catenin er motstandsdyktig mot nedbrytning ved APC-komplekset, og har dermed høyere stabilitet. For å teste hvorvidt denne form for aktivert form av β-catenin kan også bli blokkert av FH535, en ekspresjonsvektor for βCatS37A, hvori serin i posisjon 37 er endret til et alanin, ble ko-transfektert med TOPFlash. Som forventet, βCatS37A-mediert transaktivering av TOPFlash var vesentlig høyere enn transaktivering av villtype β-catenin. Men i begge cellelinjer, βCatS37A-mediert transaktivering ble betydelig inhibert av FH535. Som kontroller, ble cellene også ko-transfektert med FOPFlash, som er identisk med TOPFlash bortsett fra at TCF4 områder har blitt mutert, og derfor ikke lenger reagerer på p-catenin; FOPFlash ble ikke aktivert ved villtype β-catenin eller βCatS37A som vist i figur 1.
Huh7 (panel A) og Hep3B (panel B) HCC-celler ble transfektert med luciferase-rapportørgener TOPFlash (venstre paneler) , som inneholder tre TCF-bindingsseter, eller E3-pGL3 (høyre panel), som inneholder AFP-enhancer element E3 som har et høyt konservert TCF-området. Celler ble ytterligere ko-transfektert med en ekspresjonsvektor som inneholdt ingen innsatsen (tom vektorkontroll, E.V.), vill-type β-catenin (β-catenin), eller en konstitutivt aktiv form av β-catenin (βcatS37A). Renilla luciferase ble brukt til å kontrollere for variasjoner i transfeksjonseffektivitet. Seks timer etter tilsetning av DNA, ble celler behandlet med DMSO alene (ingen behandling) eller økende mengder av FH535. Etter 48 timer ble luciferase nivåer bestemt; ildflue luciferase ble normalisert til Renilla. I begge cellelinjene, FH535 hemmet β-catenin avhengig aktivering av målgener. *
P
0,05. Eksperimentet ble utført to ganger med samme resultat.
TOPFlash inneholder tre konsensus TCF4 bindende motiver der det gis respons p-catenin. For å teste om FH535 kan også blokkere β-catenin-mediert trans av en TCF4 motiv i sammenheng med en naturlig regulerende område, ble co-transfections utført med E3-pGL3. E3 er en ~340 bp fragment som inneholder alfa-fetoprotein (AFP) enhancer element E3, en av tre forsterkere som styrer nedsatt ekspresjon av muse AFP-genet. E3 inneholder bindingssteder for flere faktorer, blant annet Foxa /HNF6, C /EBP, foreldreløs kjernereseptorer, og TCF4 [26] – [27]. Vi har nylig viste at denne forsterkeren er regulert av p-catenin i celler og transgene mus [21]. E3-pGL3 ble transactivated av β-catenin, og i større grad ved βCatS37A (fig. 1). Men denne transaktivering av både villtype og S37A former av β-catenin ble blokkert ved FH535 på en doseavhengig måte.
3,2 FH535 hemmer β-catenin-mediert transkripsjonen aktivering i LCSC
Tidligere studier har vist at β-catenin signal er forhøyet i EpCAM positive celler med LCSC egenskaper [28]. Vi har tidligere beskrevet at CD133 +, CD44 +, CD24 + LCSC aggressivt danne svulster når små antall av disse cellene blir injisert inn i nakne mus [29]. For å teste evnen til FH535 å hemme β-catenin i disse LCSCs, forbigående transfections utført med TOPFlash. Som kontroller, ble TOPFlash også transfektert inn i HCC cellelinjer Huh7 og PLC (fig. 2). I alle tre populasjonene, ubehandlede celler utstilt lave luciferase nivåer. Ved behandling med en GSK-3β inhibitor LiCl, noe som fører til endogen β-catenin aktiverings [30], økt TOPFlash aktivitet dramatisk. FH535 effektivt blokkert LiCl-mediert aktivering av TOPFlash på en doseavhengig måte. Interessant nok denne inhiberingen var mer robust i LCSC enn i enten HCC cellelinje. Som en kontroll, ble også transfeksjoner utført med FOPFlash, som ikke lenger er mottakelig for p-catenin. Som ventet ble luciferase aktivitet i FOPFlash-transfekterte celler verken økt med LiCl eller hemmes av FH535.
LCSC (venstre panel), Huh7 (i midten panel) og HPLC (høyre panel) celler ble ko-transfektert med TOPFlash eller FOPFlash luciferase reporter gener sammen med Renilla luciferase. Etter 6 timer ble cellene ubehandlet (ingen behandling) eller behandlet med LiCl LiCl alene eller sammen med økende mengder FH535. LiCl er en kjent aktivator av β-catenin. Etter ytterligere 36 timer ble cellene høstet og luciferase-nivåer ble bestemt; ildflue luciferase ble normalisert til Renilla. TOPFlash aktivitet ble sterkt indusert i alle tre cellepopulasjoner; denne aktiveringen ble inhibert med FH535. Den negative kontrollen FOPFlash viste minimal respons på LiCl eller FH535. TOPFlash hemming av FH535 var mer robust i LCSC enn i enten HCC cellelinje. *
P
0.003, # P 0,001. Eksperimentet ble utført to ganger med samme resultat.
3,3 FH535 hemmer spredning av LCSC og HCC cellelinjer
En rekke studier har vist at β-catenin spiller en viktig rolle i spredning ved normal utvikling og i cellulær transformasjon i mange vev, inklusive lever. Liver utvikling er svekket i fravær av β-catenin, og mutasjoner som aktiverer β-catenin reaksjonsveien er funnet i omtrent 1/3 av HCC [4] – [5]. Videre kan veksten av voksen lever progenitor stamceller (oval celler) bli inhibert ved blokkering av β-catenin pathway. Siden våre data tydet på at FH535 kan blokkere β-catenin-mediert transcriptional aktivering, vi også testet om spredning av LCSC og HCC cellelinjer ble berørt av denne forbindelsen. LCSC ble dyrket i nærvær av 10% eller 1% serum og med mellom 5 uM og 30 uM FH535 i 72 timer, og celleproliferasjon ble overvåket ved
3H-tymidin inkorporering (fig. 3A og 3B, henholdsvis). Proliferasjon ble redusert med økende mengder av FH535, med en mer dramatisk reduksjon observert i celler dyrket i nærvær av lavere serum; konsentrasjonen av FH535 for å forårsake en 50% hemning av cellelaget (IC
50) var 13,8 uM for celler dyrket i 10% serum og 5,1 pM for celler dyrket i 1% serum. Denne inhibering var mer potent enn det som sees med XAV939 (IC
50 = 55 uM), som hemmer tankyrase, og dermed stabilisere Axin og fremme β-catenin degradering (fig. 3C) [31]. FH535 også blokkerte proliferasjon av HCC celler ved konsentrasjoner som var lik den som sees med LCSC (IC
50 på 10,9 uM, 9,25 uM og 6,6 uM for Huh7, PLC og Hep3B, henholdsvis; Fig.3D). For å bekrefte at FH535 faktisk hemmet celledeling og ikke føre til økt celledød, ble FH535 og
3H-tymidin tilsatt samtidig til Huh7 celler, som så ble dyrket i 18 timer. I dette tilfellet, ble det observert en signifikant inhibering av proliferasjon ved 2,5, 5, 10 og 15 uM av FH535 behandling sammenlignet med kontroll (p 0,05, n = 6), med FH535 15 pM å forårsake en 41% hemning (figur S3 ). Disse data indikerer at FH535 er inhibering av celleproliferasjon stedet for å øke celledød.
Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater i 0,2 ml av mediet som beskrevet nedenfor i 72 timer, etterfulgt av tilsetning av
3 H -tymidin ved 1 uCi /brønn i 4 timer. Inkorporering av
3H-tymidin, ble bestemt ved scintillasjonstelling. I panelene A, B og D, sluttkonsentrasjonen av DMSO i hver brønn var 0,05%; i panel C, den endelige DMSO-konsentrasjon i hver brønn var 0.1%. (
A
) LCSCs ble platet ut ved 1000 celler /brønn i DMEM med 10% FBS sammen med DMSO alene eller sammen med økende mengder FH535. (
B
). LCSCs ble platet ut ved 5000 celler /brønn i DMEM med 1% FBS med DMSO alene eller sammen med økende konsentrasjoner av FH535. (
C
). LCSCs ble sådd ut i DMEM med 10% FBS ved 1000 celler /brønn med DMSO alene eller økende konsentrasjoner av XAV939. (
D
). Huh7, Hep3B og PLS-celler ble sådd ut i DMEM med 10% FBS ved 1000, 2500, og 5000 celler /brønn, henholdsvis, med DMSO alene eller økende konsentrasjoner av FH535.
P
Verdiene for alle tre cellelinjene som ble behandlet med FH535 er sammenlignet med kontroller. Eksperimentet ble utført to ganger med samme resultat.
3,4 FH535 induserer cellesyklus arrest i HCC cellelinje Huh7 og i LCSC
Evnen FH535 å hemme celledeling bedt oss om å undersøke cellesyklusfordelingen etter behandling. Huh7-celler ble synkronisert ved hjelp av vekst i 0,1% FBS i 24 timer og deretter dyrket i nærvær av 10% FBS og uten FH535 eller FH535 på 7,5 uM og 15 uM. Etter 24 timer ble cellene høstet og DNA-innhold ble analysert ved propidiumjodidfarging. I nærvær av FH535, var det en statistisk signifikant økning i antallet av celler i G0 /G1 og en tilsvarende redusert i prosentandelen av celler i S-fasen sammenlignet med celler dyrket i fravær av FH535 (Fig. 4A). Antall celler i G2 ble ikke vesentlig endret av FH535. I tillegg var det ingen under G1 topp detektert ved strømningscytometri, som indikerer at FH535 ikke var fremme apoptose i de konsentrasjoner som brukes (se fig S4). Vi gjorde også cellesyklusanalyse i LCSC etter FH535 behandling og fant FH535 15 mikrometer betydelig forårsaket G1 fase arrest i LCSC (P = 0,012). FH535 også betydelig redusert G2 /M fase i LCSC etter 24 timer på 7,5 uM og 15 uM FH535 behandling (P = 0,038 og P henholdsvis 0,001), ingen vesentlig S-fasen inhibering ble observert i LCSC (p = 0,446) (fig. 4B.). Våre data er i likhet med tidligere publiserte resultater og reflekterer β-catenin regulering av cellesyklusen er forskjellig i ulike celletyper [32] – [33]. Cellesyklus regulatorer (cykliner, CDK og regulatorer) kan variere i ulike celletyper, som kan føre til ulike reaksjoner etter FH535 behandling. Dette kan verdt å utforske i vår fremtidige studier.
A. Huh7-celler ble dyrket i DMEM + 10% FBS i 24 timer. Cellene ble vasket med serumfritt DMEM 3 ganger, deretter dyrket i DMEM + 0,1% FBS i 24 timer for cellesynkronisering. Celler ble deretter dyrket i DMEM + 10% FBS sammen med forskjellige konsentrasjoner av FH535 i 24 timer. Cellene ble høstet og farget med propidiumjodid (PI) og analysert ved flow-cytometri ifølge GenScript protokollen (Piscataway, NJ, USA). Behandling med FH535 økte prosentandelen av celler i G1 og reduserte prosentandelen av celler i S-fasen. Eksperimentet ble utført to ganger med lignende resultater. B. LCSC celler ble dyrket i komplett CelProgen LCSC kulturmedium i 24 timer. Cellene ble så vasket med serumfritt medium CelProgen 3 ganger og dyrket i CelProgen medium + 0,1% FBS i 24 timer for synkronisering av cellene. Cellene ble deretter returnert til CelProgen Komplett medium + 10% FBS med forskjellige konsentrasjoner av FH535 i 24 timer. Cellesyklus ble analysert som per Huh7 beskrevet ovenfor.
3,5 Uttrykk for β-catenin målgener cyclin D1 og Survivin hemmes av FH535
p-catenin kontroller celleproliferasjon og overlevelse av som regulerer ekspresjonen av mange gener er rettet mot. To veletablerte mål er genene som koder Survivin (Birc5) og cyclin D1 (CcnD1). Survivin er en anti-apoptotiske protein som også regulerer progresjon gjennom mitose [34]; Cyclin D1 styrer proliferasjon ved aktivering av G1-kinaser cdk4 og cdk6 [35]. Survivin og cyclin D1 transkripsjon er regulert gjennom TCF elementer i sine promotorområdene [36]. For å teste hvorvidt FH535 inhiberer ekspresjonen av disse to β-catenin målgener, ble sanntids RT-PCR utført med LCSC og HCC celler som ble behandlet med økende mengder FH535. Cyklin D1 og Survivin mRNA-nivåene ble redusert med FH535 i alle tre cellepopulasjoner i en doseavhengig måte (fig. 5). For å bekrefte at denne reduksjonen i mRNA nivåer førte også til lavere proteinnivå, ble western analyse utført ved hjelp av hele celleekstrakter fra Huh7 celler. Både Cyclin D1 og Survivin proteinnivåer ble redusert på en doseavhengig måte, med den største reduksjonen sett i nærvær av 10 pM FH535 (Fig. 6.). Densitometrisk analyse indikerte at FH535 ved 5 og 10 uM inhiberte Cyclin D1 henholdsvis 28% og 64%; FH535 ved 5 og 10 uM hemmet overlevende henholdsvis 24% og 48% (fig. 6).
LCSCs, Huh7 og Hep3B cellene behandlet med DMSO alene eller økende konsentrasjoner av FH535 til 38-time PCR for ekspresjon av cyclin D1 (panel A) eller survivin (panel B). I begge tilfellene ble mRNA-nivåer er plottet i forhold til p
2-mikroglobulin. Eksperimentet ble utført to ganger med samme resultat.
Huh7 celler ble behandlet med DMSO alene eller økende mengder FH535 for 38-PAGE og overført til Vest-analyse med antistoffer mot Cyclin D1, Survivin, og β aktin. Toppen av viser den vestlige blot image; bunnen Grafen viser densitometrisk analyse av de vestlige data. Dette densitometrisk analyse indikerte at FH535 på 5 og 10 mikrometer hemmet cyclin D1 protein nivåer 28% og 64% henholdsvis; FH535 på 5 og 10 mikrometer hemmet Survivin protein nivåer 24% og 48% henholdsvis. Eksperimentet ble utført to ganger med samme resultat.
Diskusjoner
I de senere årene, mange signalveier har vært innblandet i leverkreftutvikling. Den β-catenin veien er viktig i stamceller for selvfornyelse og vedlikehold av stamcelleegenskaper. Forstyrrelse av denne balansen resultater i både genetiske og epigenetiske forandringer, som finnes i mange kreftformer, inkludert tykktarmskreft og HCC [4]. I denne studien brukte vi FH535 som en inhibitor av den β-catenin pathway. Denne forbindelse har blitt brukt tidligere for å inhibere β-catenin ekspresjon i celler fra tykktarm og lunge samt i celler fra hepatoblastoma og HCC [15]. I denne rapporten forfatterne konkluderte med at FH535 var giftig for en rekke cellelinjer, inkludert Huh7.
