Abstract
lichen sammensatte usnic syre (UA) er et lipofilt svak syre som fungerer som et proton transport og fører til tap av mitokondriell indre membran potensial. I denne studien viser vi at UA behandling indusert dannelse av autophagosomes i humane kreftceller, men hadde minimal effekt på normale humane fibroblaster. Men autophagic flux var ufullstendig, nedbrytning av autophagosomal innhold skjedde ikke og forsuring var defekt. UA-behandlede celler viste redusert ATP-nivåer og aktivering av AMP-kinase, så vel som tegn på cellulært stress. UA er derfor sannsynlig å utløse autophagosome dannelsen av både energi uttømming og spenningstilstander. Våre funn tyder på at H
+ – skyt effekten av UA opererer ikke bare i mitokondriene som tidligere vist, men også i lysosomer, og har implikasjoner for terapeutisk manipulering av autofagi og pH-bestemt medikament fordeling
. Citation: Bessadottir M, Egilsson M, Einarsdottir E, Magnúsdóttir IH, Ogmundsdottir MH, Omarsdottir S, et al. (2012) Proton-Shuttling Lichen forbindelse Usnic Acid Påvirker mitokondrie og lysosomal funksjon i kreftceller. PLoS ONE 7 (12): e51296. doi: 10,1371 /journal.pone.0051296
Redaktør: Gabriele Multhoff, Technische Universitaet Muenchen, Tyskland
mottatt: 18 juni 2012; Godkjent: 31 oktober 2012; Publisert: 05.12.2012
Copyright: © 2012 Bessadottir et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Eimskip doktorgrads fondet og University of Iceland forskningsfond (www.hi.is). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Laver, symbiosen mellom en sopp partner og en photobiotic mikroorganisme, finnes over hele verden og gi opphav til et stort antall unike sekundære metabolitter [1]. Den dibenzofuran-derivat, usnic syre (UA) er en kjent sekundær metabolitt og har blitt studert i noen grad [2]. Et bredt spekter av biologiske aktiviteter er blitt rapportert for usnic syre, f.eks anti-mikrobiell, anti-virus, anti-pyretic, anti-inflammatorisk og smertestillende effekter [2]. Anti-tumor aktivitet av UA var først rapportert tre tiår siden i lungekarsinom hos mus og i P388 leukemi [3], [4]. Det er videre blitt vist at usnic syre har anti-mitotiske virkninger på humane kreftcellelinjer [5] og fører til tap av levedyktige celler i leukemi, lunge- og brystkreftceller [6], [7]. Imidlertid ikke utsettes for UA ikke aktiverer p53, og har ikke blitt foreslått å være involvert i DNA-skade [8].
UA er en lipofil svak syre (p
K
et 4,4) som kan føre proton lekkasje ved å spre gjennom mitokondrielle membraner [9]. I mus leverceller usnic syre forstyrrer de normale metabolske prosesser i celler ved frakobling oksidativ fosforylering i mitochondria og ved aktivering av oksidativt stress [10]. Mitokondrier spiller en viktig rolle i reguleringen av celledødsveier og mitokondrielle endringer har blitt beskrevet i kreftceller, inkludert økt stabilitet, og dermed hemme frigjøring av cytokrom
c
og hindre induksjon av apoptose [11]. Vår tidligere studie viste at UA behandling fører til tap av mitokondriemembranen potensial i to ulike kreftcellelinjer [12]. Interessant nok har det vist seg at endringer i mitokondriemembranpotensialet kan føre til utbruddet av autophagy [13].
Autophagy er en prosess som både kan hjelpemiddel kreftcelleoverlevelse i løpet av næringsmangel, men kan også fremme cancercelledød . De molekylære reaksjonsveier som bestemmer denne dobbeltrolle forblir uklar, og det er sannsynlig at funksjonen av autophagy i kreft avhenger tumorstadium, cellulær kontekst og vev utstedt [14], [15]. Mer enn 30 forskjellige protein-kodende gener, kjent som Autophagy-relaterte gener (ATG), er blitt identifisert og studier i musemodeller har vist at macroautophagy er essensielt for opprettholdelse av cellulær homeostase i mange vev [16], [17]. Autofagi kan utløses av ernæring uttømming eller metabolsk stress og kan variere avhengig av etterspørselen etter underlaget degradering og stimulans. Energisensor AMP kinase signaler til mammalian target of rapamycin kompleks 1 (mTORC1), en viktig regulator av autofagi, som direkte styrer proteinsyntese og anabole prosesser i et næringssensitiv måte. Sult-indusert autophagic vesikler dannes, noe som er sannsynlig å inneholde fri cytosol [18], [19]. I tillegg kan andre stress tilstander som er skadet organeller, intracellulære patogener eller stress i det endoplasmatiske retikulum indusere autofagi via ulike veier fra de som aktiveres av sult [19]. Modningsprosess, det siste trinnet i autophagy, involverer levering og nedbrytning av autophagic last. Fusion oppstår med lysosomer, og autophagic vesikler vokser sammen og innholdet er degradert. Den sure miljøet i lysosomer er essensiell for de siste trinnene av autophagy, og ved å forstyrre vacuolar H
+ ATPase, som er involvert i forsurende lysosomer, kan den fullføringen av autophagy inhiberes [15], [19].
Formålet med studien var å utforske videre konsekvensene av tap av mitokondriemembranen potensial indusert av UA. Vi spurte om dette skyldes frigjøring av cytokrom
c
og utløste apoptose. Tap av membranpotensialet og eiendom UA til skyt protoner over membraner forventes å føre til en nedgang i ATP produksjonen av mitokondriene [9]. Vi fant at UA behandlede kreftceller var redusert ATP-nivåer og økt fosforylering av AMP kinase. Interessant, UA utløste autofagi men uten degradering av autophagosomal innhold, noe som tyder på en nedbrytende effekt på autophagolysosomal forsuring. Våre resultater tyder på at induksjon av autophagy ble formidlet av en kombinasjon av respons på næringsmangel, så vel som cellulært stress.
(A) nivåer av ATP, målt i et luminometer, ble redusert i T47D-celler etter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer. Data er presentert som luminescens /celle av hver gruppe sammenlignet med DMSO-kontroll. Feil linjer indikerer standardavvik av gjennomsnittet, * p 0,05. (B) Fosforylering av AMP-kinase, verifisert ved Western blotting, ble detektert i T47D-celler etter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 og 48 timer
Materialer og metoder.
plantemateriale, Cell Culture and Exposure å teste stoffer
(+) – Usnic syre (97%) ble isolert fra
Cladonia arbuscula plakater (Wallr.) Rabenh. (Cladoniaceae) samlet i åpent landskap på Island, ikke privateide. Isolering og identifikasjon ble utført som beskrevet [12]. Stoffet ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO, Merck, 2951) og fortynnet for bruk i vev-kulturmedium. Alle testene inkluderte kontroller hvor den høyeste tilsvarende konsentrasjonen av DMSO ble brukt. Brystkreftcellelinjer T47D og MCF7 og bukspyttkjertelkreft cellelinje CAPAN-2 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATTC) gjennom LGC Promochem. T47D inneholder en enkelt kopi av mutert p53 [20], men CAPAN-2 og MCF7 er homozygote for villtype p53 [21]. MCF7 er østrogenreseptor positiv [22]. Primære humane fibroblaster ble dyrket fra normal hud biopsier og brukes i passasjen 6-13 (National bioetikkomité tillatelse VSNb2006020001 /03-16, informert samtykke innhentes). Alle cellelinjer ble holdt i RPMI-1640 vevskultur medium (GIBCO ™, 52 400), inneholdende 0,5% penicillin og streptomycin (GIBCO ™, 15140-148) og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS, GIBCO ™, 10 270) med T47D motta ytterligere 0,01 mg /ml insulin (Sigma, I1882) og subdyrket følgende løsgjøring av trypsin (0,25% trypsin /EDTA, Difco ™, 215 240) etter ønske. Celler ble sådd ut ved et passende antall overskrider 70-80% konfluens etter 24 timers kultur. (+) – Usnic syre (5 eller 10 pg /ml), metformin (10 mM, Sigma, D150959) og oppløsningsmidlet kontroll ble tilsatt, og cellene ble inkubert under standard betingelser, for ulike tidsperioder. For induksjon av autophagy av næringsmangel, ble celler inkubert med Hanks oppløsning (Sigma, H9394) for de siste 40 minutter av inkubasjonstiden.
Induksjon av autophagic vakuoler, med doble membraner er karakteristiske for autophagosomes, ble detektert ved elektronmikroskopi i T47D-celler etter behandling med UA (2,5 og 5,0 ug /ml; DMSO 0,1%) i 24 timer. Svarte piler indikerer autophagic vakuoler, hvite piler indikerer dobbel membran formasjon.
(A) En økning i LC3 puncta ble oppdaget, ved immunfluorescens i T47D og MCF7 celler etter behandling med UA (10 mikrogram /ml) i 24 timer. Ingen effekt ble observert i normale fibroblaster. Målestokken vist representerer 20 mikrometer og gjelder for alle paneler. (B) LC3 puncta per celle ble talt og kvantifisert ved ImageJ og data representeres som LC3 puncta /celle av hver gruppe sammenlignet med DMSO kontroll. Feilfelt indikere standard feil av gjennomsnittet, * p 0,05, ** p 0,001. (C) Økning i LC3 I og II LC3, verifisert ved Western blotting, ble detektert i T47D-celler etter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer
Evaluering av. nivåene av ATP
Cellene ble løsnet ved trypsinering, en liten aliquot fjernet for telling og høstet ved anvendelse av 0,5 M perklorsyre (Merck, 1,00519) i 10 minutter ved 4 ° C. Etter sentrifugering 10 pl av supernatanten ble blandet med 1 ml destillert vann. Bioluminesens ble analysert ved bruk av 75 ul luciferase-reagens (Promega, FF2021) som lyserte celler og forutsatt at substratet luciferin. Luminescens ble målt i et luminometer (Turner TD 20/20) og uttrykt som luminescens /celle.
(A) Ingen degradering av p62 ble påvist ved Western blotting, i T47D og MCF7-celler etter behandling med UA ( 5,0 og 10 ug /ml, 24 timer; DMSO 0,1%). (B) Lysotracker, påvist ved fluorescens mikroskopi, viser diffus farging i T47D-celler etter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer og 72 timer. (C) Lysotracker intensitet pr celle ble kvantifisert ved ImageJ og data som er presentert som middelverdi fluorescens i hver gruppe i forhold til DMSO-kontroll. Feilfelt indikere standard feil av gjennomsnittet, ** p 0,001. Målestokken vist representerer 100 mikrometer og gjelder for alle paneler. (D) ble påvist noen effekt på Lamp2 farging, etter behandling med UA
(
10 mikrogram /ml, DMSO 0,2%) i 24 timer. Målestokken vist representerer 100 mikrometer og gjelder for alle paneler. (E) Et plasmid som uttrykker mRFP-GFP-LC3 ble transfektert inn i T47D-celler. Mangel på autophagolysosomal surgjøring ble observert etter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer ved påvisning av GFP distinkte puncta. Målestokken vist representerer 20 mikrometer, og gjelder for alle paneler.
Elektronmikros
Etter 24 timers inkubasjonstid på vanlige vilkår cellene ble høstet ved trypsinering og løst i 1 ml glutaraldehyd (Ted Pella Inc, 18426) løsning i 60 minutter ved romtemperatur, deretter sentrifugert og lagret ved 0-5 ° C i 24 timer. Etter fjerning av glutaraldehyd, ble to dråper av en 2% gelatinoppløsning (Ted Pella Inc, 19225) i destillert vann tilsettes til cellepelleten, omhyggelig blandet og lagret ved 0-5 ° C i 24 timer. Prøvene ble deretter vasket to ganger med PBS og osmiumtetroksyd (Ted Pella Inc, 18463) tilsatt til hver prøve i en time og vasket på ny med PBS. Prøvene ble kuttet til 2-5 mm stykker under en macroscope bruker barberblader. Stykkene ble dehydratisert under anvendelse av etanol (Merck, 64271D) ved økende konsentrasjoner under rotasjon. Epoksy-harpiks (Ted Pella Inc, 18300) ble tilsatt, først på 01:01 (vol: vol) med 99% etanol (Merck, 64 271) i en time, deretter to ganger harpiks bare i én time hver gang. Formene ble deretter plassert i en ovn ved 70 ° C i 24 timer. Harpiksen ble deretter oppskåret med en glasskniv (tykkelse ca. 0,5 mm) og farget med toluidinblått for utvalg av prøver for seksjonering med en diamantkniv (70-100 nm tykkelse). Prøvene ble plassert på en kobberramme før farging med en 0,06 g /ml bly-citrat-løsning (Ted Pella Inc, 19314) og ble visualisert ved hjelp av et Philips EM300 elektronmikroskop. Bilder fra prosjekterte ble utviklet ved hjelp av standard prosedyrer for å fotografere. Den utviklede filmen ble skannet inn i en datamaskin med en Nikon Coolscan V ED
(A) En reduksjon i p-P70S6K ble oppdaget, ved immunoperoksidasefarging, etter behandling med UA (10 mikrogram /ml,. DMSO 0,2% ) i 24 timer. Målestokken vist representerer 100 mikrometer og gjelder for begge paneler. (B) En økning i p-eIF2α ble oppdaget, etter behandling med UA (10 mikrogram /ml, DMSO 0,2%). 6 timer
Immunocytochemistry
For immunfluorescens farging, cellene ble høstet og fiksert i 4% paraformaldehyde (Sigma, P6148) og farget med anti-cytokrom
c, etter mus IgG2a monoklonalt antistoff (Abcam, ab110325), kløyvde caspase-3, kanin polyklonale antistoff (Cell Signaling, 9661) eller LAMP2, mus IgG1 monoklonalt antistoff (H4b4, hentet fra University School of Medicine, Baltimore), etterfulgt av Alexa Fluor rød 546 geit anti-kanin IgG antistoff (Invitrogen, A11010), Alexa Fluor grønn 488 geit anti-kanin IgG antistoff (Invitrogen, A11070) eller Alexa Fluor rød 546 geit-anti-mus-IgG
2a antistoff (Molecular Probes, A11018) For nukleær farging TO-PRO-3-jodid (Invitrogen, T3605) ble anvendt. For LC3 påvisning ble cellene fiksert med metanol (Sigma, 34 860) i 10 minutter ved -20 ° C og farget med anti-LC3B (D11), kanin-IgG-monoklonalt antistoff (Sigma, L7543) etterfulgt av Alexa Fluor grønn 488 geit-anti -kaninIgG antistoff (Invitrogen, A11070). De fargede celler ble visualisert og fotografert under et konfokal mikroskop (Zeiss, LSM 5 Pascal). For immunoperoksidasefarging celler ble fiksert med metanol (Sigma, 34 860) i 5 min ved -20 ° C og farget med anti-fosfo-kinase p70S6 (Thr389; 108D2), kanin-IgG-monoklonalt antistoff (Cell Signaling, 9234), anti -LC3B (D11), kanin-IgG-monoklonalt antistoff (Sigma, L7543) og anti-p62 (SQSTM1), kanin polyklonalt antistoff (Enzo, PW9860) etterfulgt av inkubering med monoklonalt mus anti-kanin immunoglobuliner IgG1κ (Dako, M0737), polyklonalt kanin anti-mus immunglobuliner IgG (Dako, Z0259), PAP, pepperrot peroksidase og mus monoklonale anti-pepperrot immunkomplekser, IgG1 (Dako, P850) og DAB-tabletter, kromogen (Dako, S3000). De fargede celler ble visualisert og fotografert under et henhold lysmikroskop (Leica DMI 3000B).
Western Blot analyse
Celler ble høstet og lysert med RIPA buffer. Proteininnhold ble kvantifisert spektrometrisk ved hjelp av Bradford-reagens (Sigma, B6916). Proteinene ble separert på NuPAGE 10% Bis-Tris Mini geler og overført til 0,2 pM polyvinylidendifluorid (PVDF) membran ved elektroblotting. Membraner ble probet med anti-fosfor-AMPKα (Thr172) kanin IgG monoklonale antistoffer (Cell Signaling, 4188), anti-p62 (SQSTM1), kanin polyklonale antistoff (Enzo, PW9860), anti-LC3B (D11), kanin IgG monoklonalt antistoff (Sigma, L7543), anti-fosfo-eIF2α (Ser51) kanin-polyklonalt antistoff (Cell Signaling, 9721) eller anti-G3PDH kanin-anti-humant polyklonalt antistoff (R 0,05 og p 0,001 kroner. Bilder og data som vises er representative for det som ble observert i minst tre separate forsøk.
Resultater og Diskusjon
Den indre vei av apoptose utløses ved åpning av porer i den ytre mitokondrielle membranen som fører til frigjøring av cytokrom
c
inn i cytosol og aktivering av caspase kaskade [26]. For å følge opp våre tidligere arbeid om effekten av UA på mitokondriemembranen potensielle [12] undersøkte vi cytokrom
c
lekkasje og kløyving av caspase-3 ved farging i brystkreftcellelinje T47D og bukspyttkjertelen cellelinje CAPAN-2. Ingen cytokrom
c
frigivelse eller spaltes caspase-3-produkter var detekterbare etter behandling med usnic syre (10 ug /ml) etter 24, 48 og 72 timer (data vist i 72 timer;. Fig. S1A og fig S1B ). Disse resultatene støtter vår tidligere data som UA forårsaker sent nekrose men ingen apoptose [12], og viser at selv om mitokondrie pH gradient blir forstyrret, mitokondriene selv er intakt.
Det har blitt rapportert at usnic syre årsaker frakopling av mitokondrier [27], hemmer mitokondriell respirasjon og fører til et fall i ATP-nivåer i murine hepatocytter [10]. Genuttrykk data fra mikromatriseanalyse har styrket forslaget om at usnic syre transporterer protoner mot gradienten skapt av den mitokondrielle elektrontransportsystem, da det fører til induksjon av gener assosiert med komplekser I-IV i elektrontransportkjeden [9]. For å undersøke dette nærmere, ble ATP nivåer evaluert og fosforylering av AMP kinase analysert i T47D celler. Resultatene tyder på at UA behandling fører til reduserte cellulære nivåer av ATP etter 24 timers behandling (5,0 mikrogram /ml p = 0,0523, 10 ug /ml p = 0,010). Som forventet, ble reduserte nivåer av ATP forbundet med økt fosforylering av AMP-kinase etter både 24 og 48 timers behandling (10 ug /ml) (fig. 1A og B).
Denne nedgang i cellulære energinivå og trigging av avlesningsmekanismen ville forventes å indusere autophagy. Elektronmikroskopi-analyse av T47D-celler behandlet med UA (2,5 og 5,0 pg /ml) i 24 timer som vises mer markert nærvær av autophagic vakuoler, med doble membraner er karakteristiske for autophagosomes, sammenlignet med kontrollen (Fig. 2). Disse resultatene ble fulgt opp av analyser for LC3 puncta ved immunfluorescens, og en estimering av overflod av autophagosomes, på ulike tidspunkter og behandlinger av tre celletyper (Fig. 3A, Fig. 3B og Fig. S2A-C). Ingen effekt ble observert etter behandling med UA (10 ug /ml) i 2 timer i en hvilken som helst av de tre cellelinjer, men en økning ble observert etter behandling med det anti-diabetisk legemiddel metformin i T47D brystkreftcellelinje som var ingen lenger er til stede etter langvarig behandling. Metformin har tidligere blitt vist å stimulere AMP kinase allerede etter en time [28]. Etter 24 timers behandling med UA (10 ug /ml), en betydelig økning i LC3 puncta ble tydelig sammenlignet med kontroller i de to brystcancercellelinjer. Immunoperoksidasefarging av T47D-celler viste også øket nærvær av LC3 puncta etter UA behandling (Fig. S2D). Disse funnene ble ytterligere bekreftet ved å observere en økning i LC3 I og II LC3 ved Western-blotting (fig. 3C). Virkningene på normal hud fibroblaster ble ikke merket. For sammenligning ble cellene sultet etter 40 minutters inkubering i nærings-fri Hanks balansert løsning. Selv om visuell inspeksjon antydet nærvær av autophagosome dannelse i sultet celler (fig. 3A), ble LC3 puncta vanskelig å telle, og dette hard behandling var ikke godt tolerert av cellene.
Etter å ha observert en økning i LC3 puncta etter behandlingen med UA, vi undersøkt om dannelse av autophagic vakuoler ble etterfulgt av autophagic forandring. Nivåene av autophagosomal last p62 ble evaluert etter eksponering for UA. Konsentrasjonen av p62 er blitt vist å avta hvis autophagic fluks økes som det er degradert i prosessen [29]. Dannelse av autophagosomes som et resultat av behandling med UA etter 24 timer (5,0 og 10 ug /ml) i T47D og MCF7 celler (Fig. 4A og S3 fig.) Ble ikke fulgt av nedbrytning av internalisert protein. Fraværet av p62 nedbrytning etter 24 timer antyder en forstyrrelse av lysosomale surgjøring og autophagolysosome modning som kan være forårsaket av den protonskyt egenskaper av usnic syre over lysosomale membranen, som vist i depolarisering av mitokondriene [9], [10].
for å vurdere videre effektene av UA på lysosomes vi brukte det lysosomale markør lysotracker i T47D celler som etiketter og sporer sure organeller i cellene. Resultatene viste veldig markert diffus økning i lysotracker flekker i T47D celler etter UA behandling for 24 og 72 timer (Fig. 4B og fig. 4C). Dette fargemønsteret har blitt tolket som lysosomal utvidelse som er forårsaket av behandling med klorokin, som akkumuleres inne lysosomer. I celler behandlet med klorokin, farging for lysosomal membranproteinet Lamp1 kopiert mønsteret oppnådd med lysotracker, noe som bekrefter lysosomal utvidelse [30]. I motsetning til dette, i våre eksperimenter, immunofluorescens farging for det lysosomale proteiner Lamp2 viste ingen morfologiske endringer og ble ikke observert noen forskjell mellom behandlede og ubehandlede celler (fig. 4D). Dette indikerer at lysotracker ble flekker utenfor lysosomet og kan forklares ved det faktum at retensjon av fargestoffet innsiden av lysosomer avhenger av sur pH-verdi [31]. Den diffuse lysotracker farving følgende UA behandling kan således være på grunn av protoner som blir transportert ut av lysosomet, på en lignende måte som skjer på tvers av mitokondriemembranen.
For å utforske autophagosome modning følgende UA behandling, benyttet vi en plasmidkonstruksjon , tfLC3 (mRFP-GFP-LC3 tandem-merket fluorescerende protein), som vi tilført de T47D celler. Denne metode har tidligere vært brukt for å følge den autophagic modningsprosess. GFP-LC3 mistet fluorescens på grunn av lysosomal surhet mens den mRFP fluorescens er stabil [23], [24]. Resultatene viste at i sultet celler GFP fluorescens ble svekket antyde sure forhold og nedbrytning av lysosomale hydrolaser, mens mRFP fluorescens holdt seg stabilt. Etter behandling med UA i 24 timer, ble GFP, samt mRFP fluorescens observert angir avbrudd av autophagolysosomal surgjøring og nedsatt nedbrytende betingelser etter behandling med UA (fig. 4E). Svikt i disse cellene til å fullføre autofagi kan bidra til akkumulering av autophagic vakuoler og oppbevaring av nedbrutt p62.
En av de adaptive trekk ved de fleste kreftformer er feilregulert pH. I normale celler intracellulær pH-verdi er lavere enn den ekstracellulære pH. I kreftceller gradient reverseres å skape et gunstig miljø for metastatisk progresjon. Høyere intracellulær pH blir opprettholdt på grunn av økt H
+ effluks grunn av endringer i ekspresjon og /eller aktivitet av plasmamembranpumper og transportører [32]. PH-gradienten i tumorceller er fordelaktig for den cellulære akkumulering av svake syrer, så som usnic syre, forårsaker svake syrer for å være hovedsakelig nøytral ved lav pH og lette deres transport gjennom membranen. Behandling med UA viser signifikant induksjon av gener som er koblet til kompleksene I til IV av elektrontransportkjeden, som kan være en kompenseringsmekanisme for å bevare den proton gradient over mitokondriemembranen indre [9], [32].
studier av flere arvelige syndromer som disponerer for ulike typer svulster og karsinomer har ført til identifisering av mTOR veien som en regulator av autofagi. Blant nedstrøms mål for mTORC1 er p70S6K, og 4EBP1, som har en viktig rolle i celle-sykluskontroll og proliferasjon [33], [34]. På fig. 1B viser vi at UA aktiverer AMP-kinase, som signaliserer til mTORC1 komplekse. For å utforske nedstrøms mål for mTORC1 vi analysert effektene i UA-behandlede celler på fosforylert p70S6K av immunoperoksidasefarging. Resultatene viste en markert reduksjon i farging etter behandling for (5a Fig.) 24 timer. Celler reagerer på næringsmangel ved å indusere autofagi men denne fremgangsmåten kan også bli utløst ved cellulært stress [19]. For å undersøke om UA kunne utløse autofagi ved en annen mekanisme vi undersøkt for tegn på cellulært stress i T47D-celler etter behandling med UA (10 ug /ml) i 6 timer. Økt fosforylering av eIF2α, som er en av de anerkjente tegn på ER stress, ble påvist (Fig. 5B).
Virkningene av usnic syre på autofagi kan sammenlignes med de som er beskrevet for anti-malaria medikament klorokin som nå er i kliniske studier i kombinasjon med anticancer regimer [19]. Klorokin er en svak base (p
K
en 8,5) og akkumulerer inne lysosomer som blir oppblåst og dysfunksjonelle, blokkerer autophagic flux [19]. I motsetning til dette, er usnic syre en svak syre som transporterer protoner på tvers av membraner, og dermed øke lysosomal pH-verdi, som vist ved retensjon av GFP signal, men lysosomal formen ble ikke påvirket (LAMP2 farging). ER stress er indusert av proteasomhemmingen og ER-forbundet autofagi er derfor spesielt relevant for kreftbehandling med proteasomhemmere. Det har vist seg at å kombinere klorokin med proteasominhibitor bortezomib øker tumor celledød
in vitro Hotell og
in vivo product: [35]. Cellulært opptak og intracellulær fordeling av medikamenter påvirkes av pH-[32], [36]. Klorokin kan f.eks forhindrer intracellulær lagring i lysosomer [36], men har ingen effekt på mitokondrie akkumulering av daunorubicin, noe som tyder på at forbindelsen ikke påvirker mitokondriell pH [37]. Som usnic syre påvirker pH i lysosomer og mitokondrier Det er spådd å påvirke intracellulære narkotikadistribusjon.
I konklusjonen, har vår tidligere studie vist at UA fører til tap av mitokondriemembranen potensial. I denne studien har vi vist at dette ikke fører til frigjøring av cytokrom
c Hotell og aktivering av apoptose. H
+ skyt effekten av UA opererer med to organeller, mitokondrier og lysosomer og dens effekt på autophagosome formasjonen er sannsynlig å være utløst av både ernæring uttømming og spenningstilstander. Autophagic fluks er imidlertid ufullstendig og nedbrytning av autophagosomal innhold forekommer ikke. Våre funn har implikasjoner for terapeutisk manipulering av autofagi og pH bestemt narkotikadistribusjon.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
UA ikke forårsaker apoptose. (A) Cytokrom c lekkasje var ikke påvisbart ved immunofluorescense i T47D og CAPAN-2-celler etter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24, 48 og 72 timer. (B) Det spaltningsproduktene av Caspase-3 ble påvisbare etter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) etter 24, 48 og 72 timer. Målestokken vist representerer 20 mikrometer, og gjelder for alle paneler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0051296.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
UA induserer dannelsen av autophagosome vakuoler. LC3 puncta per celle ble talt og kvantifisert ved ImageJ og data presentert som 95% familie-messig sikkerhetsnivå. (A) T47D-celler behandlet med UA i 2 og 24 timer. (B) MCF7-celler behandlet med UA i 2 og 24 timer. (C) Normale humane fibroblaster behandlet med UA i 2 og 24 timer. (D) En økning i LC3 immunoperoksidasefarging ble påvist, i T47D-celler etter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer. Målestokken vist representerer 100 mikrometer og gjelder både paneler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0051296.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
UA ikke fører til nedbrytning av p62. Ingen reduksjon i p62 immunoperoksidasefarging ble påvist, i T47D-celler etter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer. Målestokken vist representerer 100 mikrometer og gjelder både paneler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0051296.s003 plakater (TIF)
Takk
Vi er takknemlige for medlemmer av Biomedical Center, University of Iceland, Jóhann Arnfinnsson for hjelp med elektronmikroskopi og Jenny Björk Thorsteinsdóttir for teknisk assistanse. Vi takker Anna Helga Jónsdóttir for å få hjelp med statistikk.
