Abstract
Kreft oppstår gjennom en flertrinnsprosess der normale celler utvikle seg til ondartede svulster via utviklingen av deres genomer som et resultat av oppkjøpet av mutasjoner i kreft driver gener. Antallet, identitet og virkningsmåte av kreft driver gener, og hvordan de bidrar til tumorutvikling er stort sett ukjent. Denne studien utplassert Mouse brysttumor Virus (MMTV) som en insertional mutagen å finne både sjåføren gener og nettverkene der de fungerer. Ved hjelp av dype innstikkstedet sekvense vi identifisert rundt 31 000 retrovirale integrerings nettsteder i 604 MMTV-indusert mammary svulster fra mus med melkekjertlene spesifikke sletting av
Trp53
,
PTEN
heterozygote knockout mus eller villtype stammer . Vi identifiserte 18 kjente vanlige integrerings nettsteder (Ciss) og 12 tidligere ukjente Ciss merking nye kandidat kreftgener. Medlemmer av
Wnt
,
FGF
,
FGFr
,
RSPO Hotell og
PDGFR
genfamiliene ble oftest mutert i en gjensidig eksklusiv mote. Sekvensen data genererte vi ga også informasjon om klonalitet av innsettinger i enkelte svulster, slik at vi kan utvikle en datadrevet modell av MMTV-indusert tumorutvikling. Insertional mutasjoner i nærheten
Wnt Hotell og
FGF
gener markere tidligste «initierende» hendelser i MMTV indusert tumordannelse, mens
FGFr
gener er målrettet senere under tumorprogresjon. Våre data viser at insertional mutagenese kan brukes til å oppdage mutasjons nettverk, timingen av mutasjoner, og genene som setter i gang og kjøre svulst evolusjon
Citation. Klijn C, Koudijs MJ, Kool J, ti Hoeve J , Boer M, de Moes J et al. (2013) Analyse av Tumor Heterogenitet og kreft Gene nettverk ved hjelp av Deep Sekvensering av MMTV-indusert Mouse Bryst Svulster. PLoS ONE 8 (5): e62113. doi: 10,1371 /journal.pone.0062113
Redaktør: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, USA
mottatt: 9 februar 2013; Godkjent: 25 februar 2013; Publisert: 14. mai 2013
Copyright: © 2013 Klijn et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansielt støttet av den nederlandske Cancer Society (tilskudd 2001-2489 til JH), Association for International Cancer Research (AICR gi 07-585 til JJ), Nederland Genomics Initiative /nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NGI /NWO Program stipend 050 -10 til 008 til MVL, NGI /NWO Horizon Gjennombrudd stipend 40-41009-98-9109 og NGI /NWO Horizon Zenith gi 40-41009-98-11097 til JJ), Nederland Consortium for Systems Biology (NCSB), Kreft Genomics Centre (CGC), og Kreft Systems Biology Senter (CSBC). D.J.A. er finansiert av Cancer Research-UK og Wellcome Trust (76943). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
med bruk av neste generasjons DNA-sekvense teknologier mutasjons landskapet i flere krefttyper er definert avslører at det er mange genetiske veier til malignitet [1]. Tumor heterogenitet bidrar ytterligere til denne kompleksiteten [2], [3], noe som kompliserer vår evne til å skille driver mutasjoner fra passasjerer. Musetumormodeller presentere en ren, reproduserbar
in vivo
system for å studere bidrag driver gener til tumorigenesis og til å definere sine underliggende biologiske virkningsmekanismer [4].
Insertional mutagenese (IM) anvendelse av retrovirus eller transposoner har vært et av de viktigste verktøy for indusering av svulster i mus [5] – [8]. Mus brysttumor Virus (MMTV) er en slow-transformere retrovirus som har blitt brukt til å studere bryst tumorigenesis hos mus. Dette viruset forårsaker brysttumorer ved integrering av dens proviralt DNA i eller i nærheten av kreftgener. Gjentatte sykluser av insertional mutasjon og klonal ekspansjon fører til svulster på melkekjertler som frakter flere klonale og sub-klonal MMTV integrasjoner, inkludert mutasjoner knyttet til både sjåfør gener samt passasjer mutasjoner.
Molekylær kloning av provirale innsettinger i MMTV- induserte svulster på melkekjertler førte til oppdagelsen av den første MMTV Common innstikkstedet (CIS) og den tilhørende genet
Wnt1 plakater (opprinnelig kalt
int1
) i 1982 [9]. Det ble funnet at MMTV innsett nær
Wnt1
genet fremmet brysttumor utvikling via aktivering av Wnt1, den grunnleggerne av Wnt signalveien. Kort tid etter oppdagelsen av
Wnt1
annen onkogen,
Fgf3 plakater (opprinnelig kalt
INT2
) ble identifisert. Ytterligere undersøkelser viste at dette medlem av fibroblast vekstfaktor genfamilien samarbeider effektivt med
Wnt1
i tumordannelse [10]. Etter løftet om disse tidlige studiene, den økende populariteten til MMTV som en screening system resulterte i funn av flere andre gener involvert i kreftutvikling [11] – [17]
heterogenitet og progresjon av MMTV-. induserte tumorer kan bli vurdert ved å analysere den relative overflod ( «klonalitet») av individuelle innsetninger i en gitt prøve. Meget rikelig innsett indikere tidlig, initiere innsetting hendelser og ydmyk rikelig innsett indikerer hendelser som oppstår senere under svulst utvikling, analoge til nyere studier av single nucleotide mutasjoner i humane tumorer [2], [3]. Tidligere brukte PCR-baserte metoder ikke klarer å pålitelig kvantifisere klonalitet av innstikk grunn sekvens forsterkning skjevheter. Vi utviklet derfor en metode for samtidig identifikasjon og kvantitativ vurdering av klonalitet av insertional mutasjoner som heter Skjær-Splink [18]. Vi brukte denne metoden for å analysere et stort sett med MMTV-induserte svulster fra to musestammer villtype (BALB /c og FVB /N) og to genmanipulerte mus (GEM) modeller av brystkreft:
PTEN
+/-
belastning [19] og
K14Cre; Trp53
modell [20]. Vi brukte den resulterende datasettet for å ta fire sentrale spørsmål: For det første kan vi identifisere roman MMTV Ciss og dermed forlenge repertoar av kandidatkreftgener assosiert med disse modellene? For det andre kan vi identifisere genotypespesifikke driver gener i hver av de genetiske bakgrunn? For det tredje kan vi identifisere co-forekommende eller gjensidig utelukkende relasjoner mellom Ciss og dermed definere funksjonelle relasjoner mellom de tilhørende driver gener? Endelig kan vi generere en tumorprogresjon modell fra klonalitet informasjon avledet fra sekvensen lesninger av de enkelte innsett? En slik modell vil spesifisere rekkefølgen av hendelser basert på innsetting profil og belyse funksjonelle sammenhenger mellom gener involvert i MMTV-indusert melke tumorigenesis.
Materialer og metoder
musemodeller brukes for MMTV infeksjon
Newborn BALB /c /Han /A (betegnet BALB /c) mus ble infisert med MMTV av fosterhjem sykepleier på C3H /A kvinner skjuler melk overføres MMTV [21]. Infiserte BALB /c hunnmus utvikle svulster på melkekjertler med høy forekomst ( 95% før fylte ett år). Virus-infiserte dyr ble betegnet BALB /c
+ mus. I denne studien brukte vi to transgene mus linjer og deres villtype kontroller: en strekk betinget mangel for
Trp53
i mammary epitelvev på en BALB /c bakgrunn (Balb /c
K14Cre; Trp53
F /F
) og en bakterie-line heterozygot knockout for
PTEN
på en FVB /N bakgrunn
BALB /c
K14Cre;. Trp53
F /F
mus belastningen ble generert av ni sammenhengende tilbakekrysninger av
K14Cre; Trp53
F /F
dyr på en blandet 129P2 /Ola og FVB /N bakgrunn [22] til BALB /c mus. Den resulterende Balb /c
K14Cre; Trp53
F /F
belastning viste bare en lav brysttumor forekomst før fylte 300 dager. Disse betinget
Trp53
knockout mus ble smittet av MMTV gjennom fosterhjem pleie av BALB /c
+ kvinner.
For sammenligning av MMTV indusert tumordannelse mellom villtype og
PTEN
+/- mus, den betingede
PTEN
knockout allel [23] ble brukt til å generere
PTEN
+/- FVB /N mus.
PTEN
+/- mus ble krysset med FVB /N villtype mus. De kvinnelige kullsøsken i avkommet, både villtype og heterozygot for
PTEN
, ble smittet med MMTV av fosterhjem sykepleier på BALB /c
+ kvinner skjuler melken overføres MMTV.
alle MMTV-infiserte dyr ble overvåket for utvikling av brystsvulster, som ble isolert ved omtrent 1 cm i diameter. Denne studien ble utført i henhold til den nederlandske anbefalingen for forskning med Forsøksdyr i Cancer Research. Protokollen ble godkjent av den lokale eksperimentelle dyreetikk komité (DEC) (Permit Numbers: 04065, 08061, 03008) og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Alle mus ble avlivet når tumoren nådde 1 cm
3 (endepunktet) av karbondioksyd. Kaplan-Meier plott av mus levetid ble plottet og log-rank tester ble beregnet ved bruk av overlevelsespakke som implementert i den statistiske programmeringsspråk R.
Cre mediert sletting av floxed
Trp53
alleler i svulster fra
K14Cre; Trp53
F /F
mus ble vurdert ved Southern blot-analyse som beskrevet tidligere 2001 [24]. I korthet, ble høy molekylvekt genomisk DNA fra MMTV-induserte tumorer spaltet med Bglll. DNA-fragmenter ble separert på 0,6% agarosegeler og blottet på nitrocellulosefiltere til. En PCR merket 700 nt XbaI fragment som tilsvarer ekson 11 av
Trp53
ble brukt som probe for å oppdage slettede og ikke-slettede alleler. Cre mediert sletting av exon 2-10 av floxed
Trp53
allel kan vurderes på grunnlag av en mobilitet forskyvning av
Bgl
II DNA fragment. Omtrent 50% av svulstene viste bi-allel tap av floxed eksoner. Bare de svulster ble brukt for IM analyse.
Shear-Splink metode for innstikkstedet kartlegging
For å sekvensere de innstikk i svulster vi brukte Shear-Splink protokoll som tidligere beskrevet [18]. Kort fortalt DNA ble skåret til 100-1000 bp fragmenter, som ble butte ender og ligert til splinkerette adaptere. En primær PCR ble utført for å spesifikt forsterke viral-til-vert sammenbindingsfragmenter. En andre PCR ble utført for å innføre strekkodesekvenser og adaptere som trengs for 454 sekvensering. Disse PCR-produkter ble slått sammen og sekvensert ved 454 sekvensering. Rå sekvense data er deponert på Sequence Les Arkiv under tilgjengelighetsnummeret ERP002483.
Dataanalyse
Data analysemetoder er detaljert i den bærende metoder (Tekst S1).
RNA sekvense
RNA ble ekstrahert fra 4 svulster som frakter
Hbegf
innsettinger, og 4 tilfeller bærer en
Myb
innsetting. Vi er fast bestemt FPKMs for både
Hbegf Hotell og
Myb
bruker mansjettknapper [25] etter justering ved hjelp BWA [26]
Resultater
MMTV insertional mutagenese i vill -type og Trp53 eller PTEN mutante mus
for å kunne vurdere svulst heterogenitet og identifisere kreft genet nettverk MMTV-indusert mus mammary svulster, vi utført en høy gjennomstrømming, storskala Insertional Mutagenese studie i kombinasjon med dyp sekvensering i en stor kohort av mus fra 4 forskjellige genetiske bakgrunner. En skjematisk oversikt over vår tilnærming er avbildet i figur S1. Vi analyserte kullene av mus med to forskjellige genetiske bakgrunner: FVB /N (heretter referert til som FVB) og BALB /c. For hver genetisk bakgrunn vi ervervet svulster fra både vill-type-stammen og fra spesifikke genetisk konstruert mus (GEM) modeller. Innenfor FVB bakgrunn, ble brystkjerteltumorer høstet fra MMTV-infiserte villtype mus og
PTEN
+/-
heterozygote knockout mus. Innenfor BALB /c bakgrunn MMTV-induserte svulster ble hentet fra vill-type dyr og
K14cre; Trp53
F /F
mus med epitel spesifikke sletting av p53. Som det kan ses i figur 1a, er det en levetid forskjell mellom de villtype-kontroller og de samsvar GEM modeller, noe som indikerer en interaksjon mellom MMTV-indusert tumorigenesis og genetisk konstruert mutasjonen. Interessant nok var median ventetid på MMTV-indusert tumorutvikling redusert i
PTEN
+/-
årsklasse, men økte i
K14cre; Trp53
F /F
kohort når sammenlignet med deres villtype-kontroller. Denne observasjonen førte oss til hypoteser om at MMTV innsett kan treffe gener som samarbeider med
PTEN
haploinsufficiency i
PTEN
+/-
mus. I kontrast, kan MMTV smitte negativt påvirke malign transformasjon av
Trp53
– /-
mammary epitelceller eller vice versa. Det er også en stor forskjell i levetid mellom MMTV-infisert villtype FVB /N og BALB /c mus (Figur 1b). Dette kan simpelthen at viruset har langsommere replikasjon i den FVB belastning sammenlignet med BALB /c-stamme, eller det kan indikere tilstedeværelse av BALB /c-alleler som fremmer MMTV-indusert tumorigenesis. Til støtte for den sistnevnte, BALB /c mus inneholder en hypomorphic allel av
Cdk2na
tumorsuppressorgenet [27].
Hver graf representerer en sammenligning mellom to kohorter. En parvis log-rank test ble utført for alle grafer for å fastslå om det er betydelige levetids forskjeller mellom kohorter plottet i hver graf. P-verdiene er vist i øverste høyre hjørne. A. Innenfor hver enkelt mus bakgrunn stamme (FVB eller BALB /c +) vi sammenlignet MMTV-infiserte villtype kohort med infisert genmodifisert linjen (enten
PTEN
heterozygot for FVB kohort eller
Trp53
mangel for BALB /c + kohort). B. Forskjellen i levetid mellom de to villtype stammer er vist her.
For å kartlegge MMTV innstikk vi brukte vår Shear-Splink protokollen [18] for å trekke ut og forsterke virus vert DNA sammenbindingsfragmenter inneholdende MMTV 5 «LTR så vel som de tilstøtende musegenomisk sekvens. Vi strekkode fragmentene tillater oss å samle opp til 48 individuelle svulster og sekvensere dem på 454 Genome Sequencer FLX system. Rå sekvenser ble preprocessed hjelp av tilpassede Perl-skript. Vi identifiserte den genomiske sekvensen fra leser og tilordnet dem til C57BL /6J (MGSC37) referanse genom. For hver leser vi bekreftet tilstedeværelsen av den 5»-ende av viral sekvens, så vel som tilstedeværelse av DNA-strekkoden til de-Slør bassengene i individuelle tumordata. En av de unike aspektene ved vår tilnærming er at vi er i stand til å kvantifisere klonalitet av innsettinger ved å telle antall unike tumor-verts DNA krysset fragmenter preget av unike Rings poeng (LPS) mellom musen genomisk sekvens og splinkerette adapter. Siden antallet av unike LP svarer til antallet av celler som bærer det tilsvarende MMTV innsetting, kan LP telling brukes som et mål for den relative klonalitet av individuelle MMTV innsettinger innenfor hver tumor [18].
Flere ytterligere filtreringstrinn ble utført som beskrevet i metodedelen og som er avbildet i figur S1 før dataene ble lagt inn i Insertional Mutagenese Database (IMDB; https://imdb.nki.nl). Etter filtrering ble vi igjen med 30942 integrasjoner i 604 svulster. Eventuelle innsett som har
n
unike LPer er garantert å ha vært til stede i minst
n
uavhengige celler. For å anrike for innføyelser som var integrert i mer enn en tumorcelle, sett bort vi innsettinger med bare en LP. Ved hjelp av dette filteret vi redusert dataene til 6605 unike innsett i 600 svulster (4 svulster gjennomført bare innsett med en LP). Dette er en reduksjon på 78% i det totale antall innstikk, men den utgjør bare en reduksjon på 21% i det totale antall lyder, noe som tyder på at filtreringen mot innsetting med enkle LP effektivt reduserer antallet bakgrunns mutasjoner i våre data.
CIS analyse av MMTV integrasjonssider
Vi er fast bestemt global Ciss for alle svulster i datasettet. For å finne ut betydelig Ciss vi brukte Gaussian Kernel Convolution rammeverk [28] implementert i IMDb. Mesteparten av svulstene fra villtype mus bidrar i det minste en innsetting i et CIS (tabell 1). Denne prosentandelen er lavere for de som er disponert bakgrunn. Dette er mest sannsynlig på grunn av det faktum at noen av de
K14Cre; Trp53
F /F Hotell og
PTEN
+/-
mus utvikler svulster på melkekjertler som ikke er drevet av MMTV insertional mutagenese. Til sammen har vi funnet 30 signifikant ciss, hvorav 18 var allerede kjent og 12 var ny (tabell 2). Alle innsett assosiert med CIS er tilgjengelig via IMDb. Vi tildelt mulige målgener manuelt til disse Ciss. Som en illustrasjon viser vi de to mest hyppig roman ciss og kartlegging av MMTV innsettinger i disse ciss i forhold til målgenet i figur 2. Både
Hbegf
og
Myb
er meget sannsynlig kandidat målgener som de MMTV integrasjoner er meget sannsynlig for å forbedre ekspresjonen (oppstrøms og nedstrøms integrasjoner) eller stabilisere mRNA ved for tidlig transkripsjonsterminering og samtidig fjerning av mRNA destabiliserende motiver på grunn av integrasjoner i den 3 «UTR (i tilfelle av
Hbegf
). Videre begge
Hbegf product: [29], [30] og
Myb product: [31] har tidligere blitt innblandet i kreft. Endelig er det uttrykk for både Hbegf og Myb høy i prøver som bærer integrasjon, som viser at disse genene er direkte mål for viral integrering (fig S2).
Det antatte mål-genet er vist med pilen som indikerer transkripsjonsretningen. Pilspisser angir den genomiske plasseringen av de virale integrasjoner, med den retning som pilen angir den virale transkripsjonen retning. Fargene indikerer kohort hvorfra integrasjoner ble gjenvunnet.
Mange av Ciss vi kommet til hektene er kanoniske Ciss for MMTV insertional mutagenese. I MMTV-induserte brysttumorer er provirale innsett ofte funnet i nærheten av
Wnt
genet familiemedlemmer (
Wnt1
,
Wnt3 Hotell og
Wnt3a
), vekst faktorrelaterte gener (
FGF Hotell og
FGFr
gener,
PDGFR
gener og
Igf2
), R-spondin genet familiemedlemmer (
Rspo1
,
Rspo2 Hotell og
Rspo3
) og mitogen signalveien gener (
Eras Hotell og
Map3k8
) [11]. Vi identifiserte flere romanen Ciss i disse familiene som ikke tidligere er identifisert:
Hbegf
,
Rspo1 Hotell og
FGFR3
. Disse nye målene kan bare utvinnes i en stor studie, siden de forekommer langt sjeldnere i forhold til de tidligere identifiserte familiemedlemmer. Vi har også gjenopprettet flere sjeldne Ciss som er sannsynlig å være sant MMTV treffer fordi kandidaten målgener tilhører genfamiliene som også inkluderer medlemmer som er hyppige MMTV mål. Dette funnet støtter gyldigheten av andre sjeldne, men signifikant roman Ciss vi identifisert i vår skjerm, slik som
Sfi1
,
Dock5 Hotell og
Fezf1
. Faktisk, den menneskelige homolog av
Fezf1 plakater (kjent som
ZNF312B
) har blitt beskrevet som et onkogen i magekreft [32]. Videre ble flere kjente og nye mål gener funnet å være recurrently forsterkes i et panel av over 700 mennesker kreftcellelinjer (https://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/conan/search.cgi ) eller oppført som mutasjons mål i den kosmiske database (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). Dette viser at gener assosiert med Ciss i MMTV-induserte brysttumorer kan også være aktuelt i menneskelig kreft.
Genotype spesifikke Ciss
I tillegg til å finne roman MMTV Ciss vi var interessert i å finne genotype-spesifikk innsett. MMTV smittet
PTEN
+/- mus utvikler svulster på melkekjertler raskere enn sine vill type kontroller, noe som tyder på at MMTV innsett kan mutere kreftrelevante gener som samarbeider med PTEN haploinsufficiency i bryst tumorigenesis. Hvis dette er tilfelle vi forventer å finne berikelse for spesifikk Ciss i MMTV-indusert
PTEN
+/-
mammary svulster, sammenlignet med kontroll svulster. Men vi kunne ikke finne noen signifikant sammenheng med enten bakgrunn i vår studie (tabell 2). Dette tyder på at MMTV integrasjoner oppstår i eller i nærheten av de samme kreft driver gener, uavhengig av
Trp53
eller
PTEN
status. Det var også en stor forskjell i levetid mellom MMTV-smittet FVB og BALB /c villtype mus (Figur 1b). Også her, vi kunne ikke finne noen signifikant sammenheng mellom Ciss og belastning bakgrunn. Selv om vi har observert insersjoner i nærheten av
Hbegf
bare i FVB bakgrunnen (figur 2), denne forskjellen ikke var statistisk signifikant, sannsynligvis på grunn av den lave forekomst av innsetninger i nærheten av dette genet. Det har imidlertid antyde mot muligheten for at aktivering av
Hbegf
kan være onkogene i FVB mus, men ikke BALB /c mus.
Co-forekomst og gjensidig eksklusivitet mellom Ciss
vår analyse av felles innstikk gitt flere roman, men sjelden merket loci. Vi analyserte innførings mønstre for alle Ciss tvers av alle svulster å etablere relasjoner mellom innsetting mønstre i disse Ciss. Innsett kan fremvise en gjensidig utelukkende integrasjon mønster, noe som kan bety funksjonell redundans mellom målgener som har vist seg for
Myc Kjøpe og dens paralog
N-myc product: [33]. Omvendt kan samtidig forekommende innsetting observeres i de tilfeller hvor den oncogene effekt av begge innsettinger er synergistisk. For å identifisere slike funksjonelle relasjoner, bestemt vi co-forekomst og gjensidig eksklusivitet mellom statistisk signifikant Ciss i vår studie som beskrevet i metodedelen (figur 3).
Ciss angis ved hjelp av manuelt kuratert målet genet. Røde kanter tyder på en co-forekomst forhold, mens grønne kanter tyder på en gjensidig utelukkende forhold. Tallet i parentes og størrelsen av nodene angir antall tumorer med en viral innsetting i de aktuelle CIS. Tykkelsen av kantene er et mål på betydningen av forholdet mellom nodene.
Flere observasjoner kan gjøres fra denne analysen. For det første oppstår betydelig co-forekomst i hovedsak mellom sjeldne innsettinger og gjensidig eksklusivitet i hovedsak mellom svært hyppige innsettinger. Denne forspenningen er mest sannsynlig på grunn av den måte å teste, som er underpowered for lave frekvenser innsetting. Sjeldne, gjensidig utelukkende innsett trenger et større utvalg til å bli betydelig, mens sjeldne, co-forekommende innsett raskt kan bli betydelige.
For det andre interessante relasjoner ble funnet mellom medlemmene av
FGF
ligand familie og deres reseptorer, de
FGFr
gener. For eksempel ligander den FGFR FGF8 og FGF3 synes å ha en gjensidig preferanse for reseptoren FGFR1, siden
Fgf3
innsett er gjensidig utelukkende med
Fgfr1
innsett mens
Fgf8
innsett betydelig co-skje med
Fgfr1
innsettinger. Dette kan tyde på fortrinnsbindingspartnere for de ulike ligandene og en selektiv fordel for oppregulering av både liganden og dens matchet reseptor.
Til slutt, observerte vi gjensidig eksklusivitet mellom medlemmer av de enkelte genfamilier (for eksempel
wnt
gener og
FGF-Hbegf
gener). Plotting av kumulative innsetting mønstre for fem ulike familier av CIS-gener (
Wnt
,
FGF /Egf
,
FGFr
,
RSPO Hotell og
PDGFR
) viste en typisk gjensidig utelukkende integreringsmønster for gener innenfor hver familie (figur 4), som viser at MMTV infiserte celler får liten eller ingen selektiv fordel fra MMTV insersjoner i nærheten av flere medlemmer av den samme genfamilie. Basert på disse resultatene vi besluttet å se etter sammenhenger mellom CIS genfamiliene i stedet for enkelt CIS gener.
For hver av fem familier søylene angir hvilke svulster inneholdt en innføring for den spesifikke medlem av en familie. Rader indikere spesifikke svulster.
Modell for MMTV tumorprogresjon
Våre data viser at MMTV fortrinnsvis rettet mot en ganske begrenset gruppe av gener og familier. Hvis vi begrenser oss til SUS gener og CIS familier som er berørt av MMTV innsettinger i ti eller flere svulster, sitter vi igjen med bare 11 grupper av CIS-gener (tabell 2). Vi var interessert i å se om vi kunne finne en forskjell i klonalitet mellom disse gen-gruppene. Når man sammenligner innsetting i nærheten av to medlemmer av disse gruppene innenfor en svulst, vil den med flere klonale innsett også ha en høyere klonalitet poengsum basert på de unike LPS teller. Dette kan tyde på en tidligere hendelse og /eller et mer potent hit resulterer i sterkere positiv utvelgelse. Vi testet for alle 11 grupper av CIS gener alle par av innsettinger som skjedde i samme svulst for å teste om medlemmer av en gruppe har en gjennomgående høyere klonalitet score enn medlemmer av en annen gruppe, da co-mutert i samme tumor (se metoder for detaljer).
Figur 5a viser en heatmap med SUS-genet /familie parene som hadde en betydelig klonalitet forhold i henhold til binominal test. Denne analysen viser signifikante sammenhenger mellom
Wnt /FGF
genfamiliene (høyere klonalitet) og
RSPO
,
Sfmbt2
,
PDGFR
,
FGFr
,
Irs4
,
Eras Hotell og
Map3k8 plakater (lavere klonalitet). I figur 5b visualisert vi bare disse signifikante sammenhenger sammen med sin retningen. Fra dette datadrevet modell kan vi formulere en enkel progresjon modell for MMTV-indusert mus mammary tumorigenesis. Tumor-initiere MMTV integrasjoner er mest sannsynlig skje i nærheten av en
FGF
eller
Wnt
genet, mens innsett nærheten andre CIS-gener er sekundære hendelser. For alle andre forbindelser testet er det heller ingen klar klonalitet forbindelse eller det ikke er noen tumorer som de er ko-mutert. I alle 47 svulster som viste co-mutasjon av
FGF Hotell og dens reseptor
FGFr
,
FGF
innsetting var mer klonal, som viser at FGF liganden er alltid aktivert tidligere enn FGF-reseptoren under MMTV tumorprogresjon.
A. En heatmap av alle kombinasjoner av genet familier og enkeltgener ikke tildelt en familie. Signifikant forskjell i klonalitet for hver familie er beregnet med en binominal test for alle prøvene som er co-satt inn i det bestemte genet (familie) par. Blå firkanter indikerer en betydelig klonal forhold fra gruppen som er angitt på Y-aksen til gruppen som er angitt på X-aksen. Gule firkanter angir en signifikant klonal forhold fra X-aksen til Y-aksen. Svarte firkantene viser ingen signifikant sammenheng. B. Et nettverk visning av heatmap i A. viser bare signifikant (P 0,05) klonalitet relasjoner. En kant poeng fra mer klonal genet (familie) til mindre klonal genet (familie). Tykkelsen av en kant er et mål på betydningen av klonalitet forhold. For den fraksjon som vises på kantene, representerer telleren antall ganger foreldrenoden hadde en høyere klonalitet poengsum mens nevneren angir antall ganger den barnenode hadde en høyere klonalitet poengsum, i en svulst som inneholdt innsettinger i begge nodene.
Diskusjoner
Nyere studier har dykket ned i heterogen make-up av humane tumorer [2], [3] som viser at en jevn akkumulering av bakgrunns mutasjoner dekker det faktum at bare en håndfull av kjøre mutasjoner fører til onkogen differensiering. Ved hjelp av musen system, vi var i stand til å klart definere driver gener for MMTV-indusert brystsvulster og i hvilken rekkefølge de blir deregulert.
MMTV insertional mutagenese
I denne studien analyserte vi en stor kohort av mus som utviklet svulster gjennom MMTV insertional mutagenese. Innenfor et datasett fra 6600 ikke-bakgrunns MMTV innsett fra 600 svulster, identifiserte vi 30 vanlige innstikk omfatter 1271 av de 6600 innsett (19,3%). Vi brukte dette datasettet for å korrigere flere spørsmål om MMTV-indusert mus mammary tumorigenesis. For det første ønsket vi å se om vi kunne identifisere roman MMTV Ciss i denne store datasett ved hjelp av vår høy gjennomstrømming Shear-Splink tilnærming. Vi fant at 30 MMTV Ciss målrette et begrenset antall veldefinerte genet familier og svært få andre gener. Totalt har 53 MMTV Ciss tidligere blitt identifisert (tabell S1). Overlappingen mellom denne listen over kjente MMTV CISS og vår liste er bare 18 Ciss. Dette betyr at 66% av den tidligere funnet ciss ikke kunne bekreftes i denne studien. Selv om det er mulig at Ciss med svært subclonal innsett ikke oppdaget av vår Shear-Splink metoden, mener vi at vår studie er både mindre partisk (ved bruk av DNA-skjæring i stedet for restriksjonsenzymet cleavage) og mer robust (siden vi måle mange lesninger av den samme innførings) enn eldre undersøkelser basert på isolering og Sanger-sekvensering av de enkelte MMTV innstikk. Dessuten er bruken av LP-stillingen for å filtrere bakgrunnsinnsettinger fra data en kraftig metode for å begrense falske positive resultater. Mens det er mulig at vår fremgangsmåte produserer falske-negative, er det kanskje mer sannsynlig at noen av de tidligere identifiserte ciss er passasjerer eller tilfeldig integrering områder. Våre data antyder at MMTV-induced mammary tumorigenesis er en meget spesifikk sykdom som involverer et begrenset antall cellulære målgener som kan fremme spredning, overlevelse og /eller selvfornyelse av MMTV-infiserte mammary epitelceller. Som sådan, er MMTV ikke en veldig fleksibel insertional mutagenese system og derfor trolig ikke den beste tilnærmingen til å identifisere nye kandidatbrystkreftgener i villtype mus eller tumor disponert GEM-modeller. Denne oppfatningen støttes av det faktum at vi ikke kan finne spesifikke MMTV innsettinger i brysttumor utsatt mus med heterozygot
PTEN
sletting eller vev-spesifikk tap av
Trp53
, selv om MMTV-smittet
PTEN
heterozygote mus utviklet svulster på melkekjertler raskere enn sine vill type kolleger. MMTV-indusert tumordannelse tilsynelatende tjener på haploinsufficiency for
PTEN
men mutasjon av konkrete samarbeidspartnere er ikke nødvendig for denne tilstanden. Våre resultater utelukker ikke at MMTV kan vise et annet innsetting mønster i mus med melkekjertlene spesifikke over-uttrykk for en sterk onkogen.
Til tross for sterk favorisering av MMTV mot aktivering av Wnt /FGF familiemedlemmer, vi fortsatt kunne identifisere flere ny ciss for MMTV grunn av det store antall prøver vi inngår i vår analyse. Noen av de nye ciss faller innenfor de fastsatte mål-genfamilier, som viser at vår fremgangsmåte er i stand til å identifisere sanne positive, selv om de bare forekommer i mindre enn 1% av prøvene, slik tilfellet er med
FGFR3
. Det kan forventes at ytterligere sjelden MMTV ciss kan identifiseres ved ytterligere økning av sample-størrelsen av studien.
