Abstract
For å realisere det fulle potensialet av kreft selvmord genterapi som tillater presise uttrykk for selvmord genet i kreftceller, anvendte vi en vevsspesifikk epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) promoter (EGP-2) som styrer transgenet Herpes simplex virus-tymidinkinase (HSV-TK) ekspresjon fortrinnsvis i EpCAM overuttrykker kreftceller. EpCAM nivåene er betydelig høyere i retinoblastom (RB), en barndom øye kreft med begrenset uttrykk i normale celler. Bruk av miRNA regulering, i tilknytning til bruken av vevsspesifikk promoter, ville tilveiebringe det andre lag av kontrollen til den transgene ekspresjon bare i tumorcellene mens sparsom de normale celler. For å teste denne hypotesen vi klonet la-7b miRNA mål i 3’UTR regionen HSV-TK selvmord genet drevet av EpCAM promoter fordi la-syv familie mirnas, inkludert la-7b, ble funnet å være nedregulert i RB svulster og cellelinjer. Vi brukte EpCAM løpet uttrykke og la-7 nedregulert RB cellelinjer Y79, WERI-RB1 (EpCAM
+ ve /la-7b
nedregulert), EpCAM nedregulert, la-7 over uttrykke normal retinal Müller glial cellelinje MIO-M1 (EpCAM
ve /la-7b
oppregulert), og EpCAM opp regulert, la-7b oppregulert normal skjoldbruskcellelinje N-Thy-Ori-3.1 (EpCAM
+ ve /la-7b
oppregulert) i studien. Den celleformering ble målt ved MTT-analyse, Apoptose ble målt ved å måle spaltes Caspase3, ble EpCAM og TK ekspresjon kvantifisert ved hjelp av Western blot. Våre resultater viste at EGP2-promoteren HSV-TK (EGP2-TK) konstruere med 2 eller 4 kopier av la-7B miRNA mål uttrykkes TK-genet bare i Y79, WERI-Rb-1, mens den TK-genet ikke uttrykte i MIO -M1. I sammendraget, har vi utviklet en vev-spesifikk, miRNA-regulert dobbel kontroll vektor, som selektivt uttrykker selvmords genet i EpCAM løpet uttrykke celler
Citation. Danda R, Krishnan G, Ganapathy K, Krishnan UM, Vikas K, Elchuri S, et al. (2013) Målrettet Expression of Suicide Gene av Tissue-promoter og mikroRNA forordning for Cancer Gene Therapy. PLoS ONE 8 (12): e83398. doi: 10,1371 /journal.pone.0083398
Redaktør: Rajiv R. Mohan, University of Missouri-Columbia, USA
mottatt: 27 juni 2013; Godkjent: 05.11.2013; Publisert: 31.12.2013
Copyright: © 2013 Danda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av det indiske rådet for medisinsk forskning, Grant ingen 35/6 /2010 /-BMS Nano for å utføre kloning, transfeksjon, og funksjonell analyse. I del dette arbeidet ble støttet av Institutt for bioteknologi, Government of India, Grant ingen BT /01 /CE1B /11 /V /16 for å utføre la-7miRNA familieprofil. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Vanlige behandlinger som kjemoterapi, radioterapi og kirurgi er den mest effektive måten å behandle kreftpasienter [1]. Basert på sykdomsstadier, aktuelle behandlingsmetoder for retinoblastom (RB) den hyppigste svulst i øyet i barndommen, omfatter intensiv kjemoterapi, stråling, konsolidering med autolog stamcelle redning og kirurgisk reseksjon. Men pasienter med glass frø, sub retinal frø, og bilaterale avanserte multifokale sykdommer er en stor utfordring med dagens behandlingsalternativer [2], [3]. Nylige oppdagelsen av kreft stamceller, en undergruppe av kreftceller med stamcelle-lignende egenskaper som er delvis, ansvarlig for tumorvekst med forskjellige egenskaper sammenlignet med differensierte tumorceller øker kompleksiteten ved kreftbehandling [1]. Derfor er nye behandlingsmetoder for å kjempe mot kreft. Blant forskjellige fremgangsmåter, kan selvmord genterapi være et lovende alternativ strategi siden selvmordsgen ekspresjon kan reguleres til et bestemt vev [4], [5]. Selvmord genterapi involverer intracellulær avlevering av et gen som koder for et enzym som transformerer et promedikament til et cytotoksisk produkt [6], [7]. Den mest brukte selvmordsgen er herpes simplex virus type I tymidinkinase (HSV-TK). Forskjellige studier hadde brukt HSV-TK selvmord genterapi for å behandle RB og andre kreftformer [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Ikke-spesifikk ekspresjon av selvmordsgenet i normale celler er en alvorlig begrensning i den eksisterende selvmordsgen strategier for kreftterapi.
For effektivt å styre den transgene ekspresjon bare i målceller, har forskjellige studier benyttet forskjellige vev-spesifikke promotorer [15], [16], [17], [18], [19], [20]. En slik promotor er epitelial glykoprotein-2 /EpCAM /17-1A (EGP2) promoter som selektivt dreper EpCAM spissen uttrykkende celler i mange kreftformer av begrenset ekspresjon av TK (tymidin kinase), etterfulgt av ganciclovir (GCV) behandling [21], [ ,,,0],22]. EpCAM /CD326 er et type I transmembran-glykoprotein som uttrykkes i apikale membran av kreftceller og viser baso-lateral ekspresjon i normale epitelceller. Det har blitt rapportert å være spesifikt uttrykkes i epitelvev, og over uttrykkes i flertall av humane epitel-karsinomer, inkludert kolorektal, bryst, prostata, hode og nakke, hepatiske karsinomer og retinoblastom [23], [24]. Kontrollert genekspresjon i målvev er avgjørende for genterapi spesielt i sammenheng med kreft selvmord genterapi. Selv om vevsspesifikke promotor drevet selvmord genterapi viste lovende resultater, utett ekspresjon av de vevsspesifikke promotorer i ikke målrettede celler er blitt rapportert [21]. Derfor alternative strategier er viktig i tillegg til den vevsspesifikke promotoren regulering av selvmords genterapi
microRNAs (mirnas) er en klasse av små, ikke-kodende RNA. ( 1000 i pattedyrceller) som regulerer ulike cellulære funksjoner som spenner fra celledeling, signaltransduksjon og metabolisme. Den posttranskripsjonelt regulering av genekspresjon via miRNA-mediert RNA interferens (RNAi) er godt kjent [25]. mirnas er kjent for å blokkere mRNA oversettelse eller redusere mRNA stabilitet etter perfekt binding av føringsstrengen til de miRNA-gjenkjenningselementer (mres) innenfor 3
luntranslated region (UTR) av målgener [26], [27], [28], [29]. la-7 er en klasse av mirnas som er involvert i celleregulering og tumor suppresjon. Tidligere studier på prostata, lunge og brystkreft, viste nedregulering av utleid-7 familie mirnas [30], [31]. Nylig, glial fibrillært surt protein (GFAP) promoter-drevet vev bestemt gen ekspresjonsvektorer sammen med målsekvenser for en deregulering miRNA (mir122a, mir31, mir127, mir143) ble innført i 3’UTR region av transgenet [32], [ ,,,0],33], [34], [35], [36]. Denne fremgangsmåten hadde latt den transgene ekspresjon bare i målrettede glioblastom kreftceller uten ekspresjon i normale astrocytter celler av samme avstamning [34].
I denne studien, konstruerte vi en pattedyrcelle ekspresjonsvektor, som havner EpCAM-promoteren (EGP2) drevet selvmord genet HSV-TK regulert av uttrykk for de deregulerte miRNA nivåer. Det tas sikte på å uttrykke den selvmordsgen bare i EpCAM
+ ve-celler med minimal eller ingen ekspresjon i normale celler av samme avstamning. Den la-7b miRNA er under uttrykt i Y79, WERI-Rb-1 kreft cellelinjer. Vi gjorde EGP2-TK konstruere med 2 og 4 kopier av la-7b miRNA mål sekvenser. Ekspresjonen av TK-genet er begrenset til cancercellelinjer, så som Y79, WERI-Rb-1, MDA-MB-453, MCF-7 og TK mens genekspresjon er minimal i MIO-M1-cellelinjen. Vi demonstrerte for første gang bruken av EpCAM-promoteren drevet miRNA regulert TK selvmordsgen i EpCAM positiv og la-7 ned regulerte celler. Denne strategien har en to lags nivå kontroll av transgenet som kan føre til en selektiv transgene uttrykk i kreftcellene uten uttrykk i normale celler.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
retinoblastomtumorer prøver ble samlet inn fra utskrapte øye baller som en del av behandlingen, og brukes til forskningsformål, ble en skriftlig generelt samtykke innhentes fra foreldre /foresatte til pasienten gjennomgår enucleation. Studien ble gjennomført etter å ha innhentet godkjenning fra Etikk Sub-Committee (Institutional Review Board) av Sankara Nethralaya øye sykehus [Etisk klarering no: 147 (A) -2009-P].
tumorprøver og patologiske detaljer
for denne studien 10 friske retinoblastomtumorer ble brukt, Clinocopathological detaljer for svulstene var basert på internasjonal retinoblastom iscenesettelse arbeidsgruppe (IRSWG) [37], [38] og ble gitt i tabell S1. Felles voksen retina 50-55 (n = 3) år ble brukt som en kontroll og ble hentet fra avdød øynene donert til CU Shah Eye Bank, Sankara Nethralaya.
Cell kultur
retinoblastom cellelinje Y79, WERI-RB1, og brystkreft cellelinjer MDA-MB-453, MCF-7 ble oppnådd fra (Japan) Riken Bio Resource Centre. Menneskelig Netthinne Müller glial cellelinje MIO-M1 avledet fra det nevrale netthinnen var begavet fra G.A. Limb, UCL Institute of Ophthalmology, London, England [39]. Menneskelig skjoldbruskkjertelen follicular epitel cellelinje Nthy-ori 3-1 var begavet fra Dr.Omer Ugur, Hacettepe Institute of Oncology [40], [41]. MIO-M1, MDA-MB-453, MCF-7 ble dyrket i Dulbeccos modifikasjon av Eagles medier (DMEM) inneholdende glutamin, supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 IU /ml) og streptomycin (100 IU /ml). Nthy-ori 3-1 og Y79, WERI-RB1 ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, og 4,5% dekstrose og dyrket i suspensjon ved 37 ° C i en 5% CO
2-fuktet inkubator.
in vitro
transgene uttrykk analyse
(EGP2-TK) ble vennlig levert av Dr. MG Rots, Department of Therapeutic Gene Modulation, Universitetets senter for farmasi, Universitetet i Groningen, Nederland. Den pUT649 ekspresjonsvektor som inneholder en Zeocin resistent gen og bærer HSV-TK-genet under kontroll av human cytomegalovirus-promoteren (CMV-TK) [genereres av professor G.Tiraby (University of Toulouse), Cayla, Frankrike] ble transient transfektert inn i Y79 , WERI-RB1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1 bruker Lipofectamine TM 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Kloning av miRNA mål i EGP2-TK plasmid
for å konstruere plasmider med la-7 miRNA mål sekvenser, ble EGP2-TK brukes som en ryggrad som inneholder HSV-TK i nedstrøms EGP2 promoter. For å konstruere miRNA mål, ble oligonukleotider utformet med la-7b mål (perfekt komplement sekvens av la-7b miRNA ble tatt fra miRBase tiltredelse no-MIMAT0000063) etterfulgt av
KpnI
som er utpekt som T1A (har mål perfekte reversere komplementær til den la-7b miRNA) og T1B (perfekt komplementær til T1A) ble glødet og ligert mellom
NotI Hotell og
BstBI
restriksjonssetene resulterer i EGP2-TK-2T ha 2 kopier av de la-7b mål.
KpnI Twitter /
BstBI
fragment ble kuttet med respektive enzymer og ligert med oligonukleotider har to kopier av la-7b målsekvenser. Som er utpekt som T2A (har mål perfekt komplementær til la-7b miRNA) og T2B (perfekt komplementær til T2A) hhv. Disse ble glødet og ligert resulterer i EGP2-TK-4T ha 4 kopier av la-7b målsekvenser. Kontroll mål C1A, C1b og C2A, C2B ble generert ved å ta det perfekte omvendt utfyllende av la-7b miRNA mål. Gjennom manuskriptet EGP2-TK med 2 eksemplarer av la-7b målene vil bli nevnt som EGP2-TK-2T og 4 kopier av la-7b mål som EGP2-TK-4T. På samme måte EGP2-TK med 2 kopier av la-7b styresekvens vil bli referert som EGP2-TK-2C og 4 kopier av styresekvens vil bli betegnet som EGP-TK-4C. De plasmidkonstruksjoner for luciferase (luc) reporter analysen ble generert ved å erstatte HSV-TK genet med
Guassia luciferase
genet. Luciferase konstruksjonene ble navngitt som nevnt ovenfor erstatte TK med Luc. Tabell 1 viser oligonukleotider brukt i studien.
miRNA uttrykket analyse
TaqMan® mikroRNA Reverse Transcription Kit og TaqMan® Universal PCR Master Mix uten Amperase® UNG fra Applied Biosystems (CA, USA) ble brukt for påvisning og kvantifisering av modne miRNA. Kvantifisering ble gjort i henhold til produsentens protokollen med en mikrogram total RNA prøven. Vi brukte RNU6 miRNA (assay-ID, 001 093) som en kontroll. TheTaqMan® mikroRNA (Applied Biosystems) individuelle analyser ble benyttet til følgende miRNA overslag: HSA-la-7a (analyse ID, 000377), HSA-la-7b (analyse ID, 2619), HSA-la-7c (analyse ID, 000379), HSA-la-7d (analyse ID, 002283), HSA-la-7e (analyse ID, 2406), HSA-la-7F (analyse ID, 000382), og HSA-la-7g (analyse ID, 0002282 ) og HSA-la-7i (analyse ID, 002221). Data ble normalisert ved hjelp av Ct-verdiene for vaktmester-genet U6 i hver prøve. For å beregne relative mengder av miRNA, ble den gjennomsnittlige Ct verdien av U6 RNA subtrahert fra den til målet miRNA for å oppnå endring i Ct verdi. Den ganger endring i gen-ekspresjon ble deretter bestemt som log2 relative enheter. PCR-produktene ble detektert med en ABI PRISM 7500 sekvens deteksjonssystem og analysert med ABI PRISM 7500 SDS-programvare (Applied Biosystems).
reportergen assay
Vi brukte luciferasereportergenet assay for promoteren styrke analyse og studere miRNA forskrift om transgene uttrykk. pGluc plasmid inneholdende CMV-promoteren drevet -luciferase konstruksjon ble kjøpt fra (New England Biolabs, MA, USA). Den EGP2 promoteren ble klonet foran et luciferase-gen (EGP2-luc) erstatter CMV-promoteren. De 2 og 4 kopier av la-7b mål sekvenser ble klonet ved 3’UTR regionen i konstruksjonen (EGP2-Luc). Transfeksjon ble gjort midlertidig med følgende plasmider CMV-Luc, EGP2-Luc, EGP2-luc-2T, EGP2-luc-4T, EGP2-luc-2C og EGP2-luc-4C. Etter 48 timer av transfeksjon med luciferase-konstruksjon, ble cellene vasket med PBS, og dyrket i friskt medium i ytterligere 24 timer. Cellene ble høstet og analysert for luciferase og β-galaktosidase virksomhet i samsvar med produsentens protokoller (New England Biolabs).
Western blot analyse
For å analysere uttrykk for TK og EpCAM proteiner, totale celleekstrakter ble fremstilt ved å lysere cellene i lyseringsbuffer [10 mM Tris-HCl pH 7,2, 2% SDS, 10 mM ditiotreitol, 1% protease og fosfatase-inhibitorer cocktail (Sigma Aldrich, MO, USA)]. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Lowry-metoden. Cellelysatene ble blandet med 5 x Laemmli-lastebuffer og kokt i 5 minutter. Like mengder (50 pg) protein ble underkastet elektroforese på en 12% SDS-polyakrylamid-gel og elektro-blottet til nitrocellulosemembranen. Membranblottene ble blokkert i 1 time med 5% skummet melk i TBS inneholdende 0,1% Tween-20, og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff. HSV-TK (levert av Dr. William C. Summers, Yale University) og EpCAM (cellesignalisering, MA, USA) antistoffer ble anvendt ved fortynningen av 1:100 og 1:150, respektivt. Blottene ble vasket og inkubert med passende pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff (anti-kanin 1:5000, anti-mus 1:2000 (celle signalisering) i 3 timer ved værelsestemperatur og visualisert med tetrametylbenzidin /Hydrogenperoksyd (TMB /H
2o
2, Bangalore Genei, India) reagens i henhold til produsentens instruksjoner. Membraner ble strippet med 100 mM glysin, pH 2, i 40 minutter, blokkert, og re-analysert for β-aktin (Sigma). Blottene ble skannet med et UVP BioDoc-IT-avbildningssystem (CA, USA) og Densitometrisk analyse av digitaliserte bilder ble utført med ImageJ programvare (NIH). intensiteten for hvert bånd var normalisert til intensiteten av den tilsvarende β-actin bandet etter bakgrunnen normalisering.
Måling av følsomhet overfor ganciklovir (GCV)
Y79, WERI-RB1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1cells ble sådd i en 96 brønners plate 24 timer før transfeksjonen ved en tetthet på 10.000 celler per brønn for å bestemme cellenes levedyktighet. den transfeksjon ble utført transient med plasmider inneholdende CMV-TK, EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-tk 2C, EGP2-TK-4C og inkubert i 48 timer. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (1, 10, 50,100 um) med GCV i 24 timer. Sensitiviteten til GCV ble evaluert ved å bruke kolorimetrisk MTT-assay. En multi-brønn scanner (BioTek, VT, USA) ble anvendt for å måle absorbansen ved 570 nm bølgelengde. De ikke-transfekterte ubehandlede kontroller ble gitt en verdi på 100%. Celle overlevelse ble beregnet ved ligningen. Test OD /kontroll OD X 100%
Immunofluorscence
Følgende transfekterte cellelinjer MIO-M1, Nthy-ori-3-1, WERI-RB1 , Y79-celler ble vasket med 1 x PBS og fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur og deretter permeabilised med 0,25% Triton X-100 i 5 minutter. Cellene ble blokkert med 5% føtalt bovint serum i 30 minutter, inkubert med anti-spaltede kaspase 3 (celle signalisering) og anti-BCL2 antistoff (cellesignalisering) i 3 timer og deretter med FITC (grønn) og TRITC (rød) konjugert sekundære antistoffer (Jackson Immunoresearch, PA, USA) i 2 timer. Cellene farging ble visualisert ved hjelp av en zesis Axio vison invertert system mikroskop med 10X objektiv. For å sikre spesifisitet farging ble bildene innhentet ved hjelp av innstillingene som ingen fluorescens var påvisbare negative kontroller med sekundære antistoffer alene (data ikke vist).
Statistisk analyse
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av 3 forsøk med hvert eksperiment utført i tre paralleller. Statistisk signifikans ble beregnet med Student t test og ap verdi ≤ 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Begrenset TK uttrykk ved EGP2 promoter
Vi analyserte den selektive uttrykk av transgenet ved EGP2 promoter i Y79, WERI-RB1, Nthy-ori 3-1 cellelinjer. Western blot analyse viste EpCAM protein ekspresjon i Y79, WERI-RB1, Nthy-ori-3-1 celler og dets ekspresjon ikke ble observert i MIO-MI cellelinje (Figure1A). Derfor Y79, WERI-RB1, Nthy-ori 3-1cells ble ansett som EpCAM positive (EpCAM
+ ve) og MIO-MI som EpCAM negative (EpCAM
ve) for EpCAM protein uttrykk. For å evaluere EGP-2 promoter for sin evne til å regulere HSV-TK uttrykk i EpCAM uttrykke celler, vi transient transfektert cellene med EGP2 promoter drevet HSV-TK konstruksjon (EGP2-TK). CMV-promoter-drevet HSV-TK (CMV-TK)-konstruksjonen ble anvendt som en positiv kontroll. I CMV-TK forbigående transfekterte celler, ble TK protein uttrykt i alle cellelinjer (Nthy-ori 3-1, Y79, WERI-RB1 og MIO-M1) (figur 1B). I EGP2-TK forbigående transfekterte celler, ble TK uttrykk sett i Nthy-ori 3-1, Y79 og WERI-RB1 celler. Videre TK proteinekspresjon var lav i MIO-M1-celler (figur 1C). Dette kan være på grunn av leakiness av EGP2 promoteren som rapportert tidligere i andre promotorer [34], [35]. I sanntid PCR eksperimenter CMV arrangøren drevet TK genet viste konsekvent uttrykk i alle de 4 cellelinjer (figur 1D). EGP2-TK transfektert Nthy-ori 3-1, Y79 og WERI-RB1 cellelinjer viste signifikant høyere TK uttrykk i forhold til CMV-TK transfekterte cellelinjer. Imidlertid EpCAM-promoteren betydelig redusert TK-gen-ekspresjon i MIO-MI-cellelinjen (figur 1D). Reporter gene assay viste at CMV-Luc transfeksjon, viste en betydelig høyere genekspresjon i forhold til de ikke-transfekterte celler. Den EGP2-luc transfeksjon inn i de Nthy-ori 3-1, Y79, og WERI-RB1 cellelinjer viste signifikant høyere luciferase-ekspresjon i forhold til CMV-Luc transfekterte celler unntatt i MIO-M1 hvor luciferase-ekspresjon er signifikant lavere i EGP2- luc transfeksjon (figur 1E). Disse resultater viser at EpCAM-promoteren blir selektivt aktivert i EpCAM positive cellelinjer Y79, WERI-RB1, Nthy-ori 3-1, og ikke i EpCAM negativ cellelinje MIO-M1.
EpCAM-ekspresjon ble undersøkt ved western blot-analyse og β-aktin ble benyttet som en laste kontroll (A). Den transgene ekspresjon drevet av EGP2 og CMV-promoter ble evaluert ved forbigående transfeksjon av CMV-TK, EGP2-TK, CMV-Luc, og EGP2-luc. Etter 2 dager med transfeksjon TK protein ekspresjon drevet av CMV-promotoren ble undersøkt ved western blot-analyse, og resultatene ble normalisert mot β-aktin (B). TK-protein ekspresjon drevet av EGP2 promotoren ble undersøkt ved western blot-analyse, og resultatene ble normalisert mot β-aktin (C). Protein kvantifisering ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvare og protein ekspresjon ble uttrykt i relative signalintensitetsverdier. TK mRNA nivåer ble kvantifisert ved Real-time PCR, mRNA nivåene var normalisert mot GAPDH og ble uttrykt i relative fold endrer enheter (D). Luciferaseekspresjon analyse ble utført ved å tallfeste det utskilte Gaussia luciferase. Resultatene ble normalisert mot un-transfekterte celler og ble uttrykt i relative lysenheter (E). Normaliserte nivå av luciferase-ekspresjon i prosent er vist som gjennomsnitt ± S.D (n = 3). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 vs. Control, + p 0,05, ++ p 0,01, +++ p. 0,001 vs. CMV-luc
EGP-2 promoter styrer selektiv celledreping av begrenset ekspresjon av TK
for å evaluere de funksjonelle aspektene ved TK genekspresjon, forskjellige konsentrasjoner (1, 10, 50, 100 uM) av GCV behandlings ble utført i 24 timer på CMV-TK eller EGP2-TK transient transfekterte cellelinjer så som Y79, WERI-RB1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1. Den 10 mm konsentrasjon av GCV behandling viste nesten 50-60% celleviabilitet i hele CMV-TK transfekterte cellelinjer undersøkt. Prosentandelen av cellelevedyktighet ble redusert med økende konsentrasjon av GCV i Nthy-ori 3-1, Y79, og WERI-RB1-celler (figur 2A, 2C, 2D). I disse cellelinjene, ble cellelevedyktigheten ble redusert under EpCAM-promoteren reguleres TK i forhold til den av CMV-promoteren regulert TK i EpCAM
+ ve celler. I MIO-MI-celler, er det cellenes levedyktighet hastighet omtrent 60% i henhold til CMV-promotoren regulering av TK /GCV (figur 2B) og 90% under EpCAM-promoteren regulering av genet. Videre cellenes levedyktighet betydelig redusert under EpCAM-promoteren regulert TK i Y79, WERI-RB1, Nthy-ori-3-1-celler. Disse resultatene tyder på EGP2 promoter uttrykker TK-genet i EpCAM
+ ve og ikke i EpCAM
ve cellelinjer.
Celleviabilitet assay ved MTT ble evaluert ved å transfektere den EGP2-TK og CMV -TK plasmider inn i cellelinjer. Nthy-ori-3-1 (A), MIO-M1 (B), Y79 (C), WERI-RB1 (D). Etter 48 timers transfeksjon, etterfulgt av GCV behandling ved forskjellige konsentrasjoner (1, 10, 50, 100 uM) i 24 timer. Resultatene ble normalisert mot un-transfekterte celler og ble uttrykt i prosent av celle-levedyktighet. Celleviabilitet ble vist som prosentvis gjennomsnitt ± SD (n = 3).
Tilstedeværelse av la-7 familie miRNA i Retinoblastoma av real-time kvantitativ PCR
Det har blitt rapportert at , la-syv familie mirnas er apoptotiske og høyt konservert over arter i rekkefølge og funksjon og deregulering av la-7 familie fører til kreft [25]. Vi analyserte uttrykket profilen til la-7 familie i (n = 10) primær retinoblastomtumorer og Y79, WER-RB1, MIO-M1, Nthy-ori 3-1 cellelinjer (figur 3). Den la-7 familie ble nedregulert i primære tumorer sammenlignet med den for normal voksen hinnen. la-7a ble sterkt nedregulert blant brev 7 familiemedlemmer i primærsvulster (figur 3A, B). la-7c og 7d-la var sterkt nedregulert i Y79 og WERI-RB1 respektivt, når sammenlignet med MIO-M1cell linje (figur 3C). I Nthy-ori 3-1 cellelinje, ble alle miRNA opp reguleres i forhold til MIO-M1 (Figur 3C). La videre-7b viste konsistent nedregulering i begge retinoblastom-cellelinjene når sammenlignet med andre la-7 familiemedlemmer, og viste høy oppregulering i Nthy-ori 3-1. Derfor var dette (la-7b) valgt å klone miRNA mål sekvenser i våre plasmid konstruksjoner.
uttrykk for skuffelse 7 mirnas ble kvantifisert ved hjelp av sanntids PCR. Uttrykket analyse av la-syv familie mirnas ble evaluert i retinoblastom primære svulster. Resultatene ble normalisert mot normal voksen retina og ble uttrykt i brette endre verdier i forhold til normal voksen netthinnen (A, B). Uttrykket analyse av la-7 familien mirnas ble evaluert i retinoblastom-cellelinjer. Resultatene ble normalisert mot MIO-M1 og ble uttrykt i brette endre verdier i forhold til MIO-M1 (C). miRNA ganger endring ble beregnet ved hjelp av to
-▵▵CT metode.
In vitro
luciferase assay formidlet av pCMV /EGP2-
luc
vektorer
transfeksjon av EGP2-TK og EGP2-Luc konstruksjoner i EpCAM negativ cellelinje viste signifikant uttrykk for TK og luciferase gener (Figur 1 C, E). En signifikant cytotoksisitet på GCV behandling observert i EpCAM negativ cellelinje MIO-M1 på EGP2-TK transfeksjon med GCV behandling (fig. 2B) kan være på grunn av utett ekspresjon av EGP2 promoter i EpCAM negative cellelinjer. En lignende utett ekspresjon av GFAP-promoteren ble observert hos normale astrocytter [34]. For å regulere ikke-spesifikke uttrykk for transgen drevet av EGP2 promoter, klonet vi la-7b mål på 3’UTR regionen EGP2-luc konstruksjon (figur 4A). Cellene ble transfektert med EGP2-luc, EGP2-luc-2T EGP2-luc-4T, EGP2-luc-2C, EGP2-luc-4C plasmid konstruerer og luciferase genekspresjon ble analysert etter 24 timer. En betydelig reduksjon i luciferase-aktivitet ble observert med EGP2-luc-2T og EGP2-luc-4T i forhold til EGP2-luc in MIO-M1 (EpCAM
ve /la-7b
opp regulert) og Nthy -ori 3-1 (EpCAM
+ ve /la-7b
oppregulert) celler (figur 4B). En ytterligere betydelig reduksjon i luciferaseaktivitet i EGP2-luc-2T i forhold til EGP2-luc-4T ble observert i MIO-M1-celler. Men i Y79 og WERI-RB1 (EpCAM
+ ve /let7
nedregulert) celler, kan vi ikke observere betydelig reduksjon i luciferase aktiviteten EGP2-luc-2T og EGP2-luc-4T forhold til den EGP2-luc (figur 4B). Disse resultatene understreker behovet for miRNA regulering av transgenet uttrykk sammen med den vevsspesifikke promotoren for målrettet ekspresjonen av transgenet.
miRNA målsekvenser to kopier eller fire eksemplarer, som beskrevet i tabell 1. luciferase-rapportørgenet etter CMV promoter ble klonet i EpCAM-TK konstruere ved å fjerne TK genet og sette luciferase genet. miRNA mål ble klonet inn i 3 «UTR-regionen til ekspresjonsvektor inneholdende Gluc-genet under EpCAM promoter (A). Luciferase-ekspresjon ble kvantifisert ved utskilt Gaussia luciferase. Plasmidet konstruerer EGP2-luc, ble EGP2-luc-2T, EGP2-luc-4T, EGP2-luc-2C, og EGP2-luc-4C transfektert inn i MIO-M1, Nthy-ori 3-1, Y79, WERI-Rb1 cellelinjer. Etter inkubering i 48 timer var resultatene normalisert til un-transfekterte celler og ble uttrykt i relative lysenheter (B). Luciferase nivåer er uttrykt som prosent gjennomsnitt ± S.D (n = 3). * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001 vs EGP-to-luc-2T
Cell spesifikk cytotoksisitet av dobbel kontroll vektor transfeksjon med GCV behandling var høyere enn ETK alene
Vi har evaluert målrettet cytotoksisitet indusert av GCV behandling på EGP2-TK-2T og EGP2-TK-4T transfeksjon forhold til kontrollene EGP2-TK, EGP2-TK-2C og EGP2-TK-4C i alt 4 cellelinjer. Den normale cellelinjer Nthy-ori 3-1 (figur 5A) og MIO-M1 (figur 5B) transfektert med EGP2-TK-2T og EGP2-TK-4T-konstruksjoner med GCV behandlingen resulterte i betydelig lavere celledød i forhold til EGP2- TK. Disse cellelinjene viste signifikant mindre cytotoksisitet mediert av EGP2-TK-2T i forhold til EGP2-TK-4T-konstruksjonen. I retinoblastom cellelinjer Y79 (figur 5C), WERI-Rb-1 (figur 5D) transfektert med EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK-2C og EGP2-TK-4C konstruerer, etterfulgt av behandling GCV viste ingen signifikant forskjell i celledød. Disse resultater viser at cellespesifikk cytotoksisitet mediert av HSV-TK ved behandling med GCV medikament ble regulert av la-7b miRNA mål i de normale cellelinjer.
Celleviabilitet assay ved MTT ble evaluert ved å transfektere den EGP2-TK , EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK-2C, plasmider EGP2-TK-4C inn i de cellelinjene, Nthy-ori-3-1 (A), MIO-M1 (B), Y79 ( C), WERI-RB1 (D). Etter 48 timers transfeksjon, etterfulgt av GCV behandling ved forskjellige konsentrasjoner (1, 10, 50, 100 uM) i 24 timer, avlesninger ble målt ved 570 nm ved hjelp av spektrofotometer. Resultatene ble normalisert til ikke-transfekterte celler. Cellelevedyktigheten ble vist som prosent gjennomsnitt ± S.D (n = 3). * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001 vs. kontroll
EpCAM promoter og la-7b målsekvens medierer uttrykk for apoptotisk markør i retinoblastomceller
for å kontrollere rapporterte lekk uttrykk for TK-genet i de ikke-målrettede normale celler (figur 1 2), transfektert vi EGP2-TK, EGP2-TK-2T, konstruerer EGP2-TK-2C inn i følgende cellelinjer : N-Thy-Ori-3.1, MIO-M1, Y79 og WERI-Rb-1. Siden observerte vi EGP2-TK-2T viste signifikant effekt i å kontrollere transgene uttrykk, velger vi kun EGP2-TK-2T for å analysere apoptose markører etter GCV behandling. Den EGP2-TK-konstruksjonen ble sterkt uttrykt i EpCAM
+ ve cellelinjer, Nthy-ori 3-1 (figur 6A, spor 1), Y79 (figur 6A, spor 3), WERI-Rb-1 (figur 6A, spor 4), sammenlignet med EpCAM
ve-MIO-M1cell linje (figur 6A, spor 2). Transfeksjon av EGP2-TK-2T-konstruksjon begrenset TK ekspresjon bare i retinoblastom-cellelinjer (figur 6B, felt 3, 4) og ikke i normale cellelinjer så som MIO-M1 og Nthy-ori 3-1 til og med i nærvær av EpCAM protein. De EGP2-TK-2T transfektert retinoblastom-cellelinjene som ble behandlet med GCV medikament viste apoptotisk markør, aktivert Caspase3 og nekrotisk markør PARP-1-ekspresjonen (figur 6C, sporene 3, 4), men ikke i normale cellelinjer (figur 6C, banene 1, 2). For ytterligere å validere apoptotiske markører uttrykk, utførte vi immunofluroscence forsøk hvor lignende resultater ble observert, som støtter den apoptotiske markør uttrykk på western blot (figur S1). I stedet for PARP brukte vi Bcl-2, som er et anti apoptotisk markør.
Western blot-analyse ble utført i nærvær av TK-protein, ble EGP2-TK transfektert inn i Nthy-ori-3-1, MIO-M1 , Y79 og WERI-Rb-1-cellelinjer (A).
