Abstract
fokal adhesjonskinase (FAK) er et cytoplasmatisk tyrosinkinase som er forhøyet i en rekke humane krefttyper. Mens FAK er innblandet i mange cellulære prosesser som er gjennomtrengt på kreft, som proliferasjon, aktin og heft dynamikk, polarisering og invasjon, det er bare noe begrenset informasjon om rollen til FAK i strålings overlevelse. Vi har undersøkt hvorvidt FAK er en generell radio-allergifremkallende mål, slik det er foreslått av tidligere rapporter. Vi brukte en ren genetisk system i hvilket FAK ble slettet fra mus squamous cellekreft (SCC) celler (FAK – /-), og rekonstituert med eksogen FAK villtype (wt). Overraskende, ble fravær av FAK assosiert med øket radio-motstand i avanserte SCC-celler. FAK re-ekspresjon inhibert p53-mediert transkripsjonen oppregulering av P21, og en sub-sett av andre p53 målgener som er involvert i DNA-reparasjon, etter behandling med ioniserende stråling. Videre p21 uttømming fremmet radio-allergi, noe som tyder på at FAK-mediert hemming av p21 induksjon er ansvarlig for den relative radio-følsomheten FAK-dyktigere SCC celler. Vårt arbeid legger til en voksende mengde bevis for at det er en nær funksjonell sammenheng mellom inte /FAK signalering og p53 /p21 vei, men viser at FAK rolle i overlevelse etter stress er kontekstavhengig, i hvert fall i kreftceller. Vi foreslår at det bør være forsiktig når du vurderer å hemme FAK i kombinasjon med stråling, da dette kan ikke alltid være klinisk fordel
Citation. Graham K, Moran-Jones K, Sansom OJ, Brunton VG, Frame MC ( 2011) FAK Sletting Fremmer p53-mediert Induksjon av p21, DNA-Skade Responses og Radio-Resistance in Advanced Squamous kreftceller. PLoS ONE 6 (12): e27806. doi: 10,1371 /journal.pone.0027806
Redaktør: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasil
mottatt: 27 juni 2011; Godkjent: 25 oktober 2011; Publisert: 14.12.2011
Copyright: © 2011 Graham et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Cancer Research UK Program Grant (C157 /A9148). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Strålebehandling er en bærebjelke i kreftbehandling i flere sykdoms sammenhenger, men behandlingen er ikke alltid kurativ. En stor innsats er rettet ikke bare mot å forbedre levering av strålebehandling av stadig mer sofistikerte romlige og dosimetriske metoder, og også for å identifisere kombinasjon strategier for å forbedre strålings svar. Med hensyn til det sistnevnte, ioniserende stråling kan fremme aktivering av reseptor og ikke-reseptor-tyrosin-kinaser (TKs), og modulering av cellebeskyttende påvirkninger, for eksempel økt DNA-reparasjon, proliferasjon og redusert apoptose [1], [2], [3] , [4], [5], [6], [7]. Siden disse svarene bidra til mobilnettet radio-motstand, noe som selvsagt kan begrense effektiviteten av strålebehandling i kreftbehandling, forstå bidraget fra TKs kan gi nye molekylære mål for radio-overfølsomhet, og potensielt øke tumorrespons. Et eksempel er epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), som er den nåværende mest omfattende studert TK i denne sammenheng. Sterk preklinisk dokumentasjon innebærer en kapasitet på EGFR hemming for å forbedre anti-tumor effekter av ioniserende stråling, og dette har ført til klinisk setting basert på resultater fra en fase III studie i hode- og halskreft [8], [9]. Dette viser viktigheten av robuste intervensjon strategier for å fastslå om bestemte TKs bidra til mobilnettet radio-følsomhet, eller til radio-motstand.
I motsetning til den nye bevis for EGFR, rollen til andre TKs, spesielt ikke- reseptor TKs, er mer uklart. Focal Adhesjon Kinase (FAK) er plassert på steder av integrin vedheft fra der det transduces signaler inn i celler som styrer flere cancerassosierte egenskaper, inkludert adhesjons- og aktin dynamikk, migrasjon, invasjon, angiogenese, beskyttelse av celler fra suspensjon-indusert celledød ( noen ganger betegnet anoikis) og proliferasjon i 3-dimensjoner [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. FAK er ofte over-uttrykkes i human kreft [18], [19], [20], [21], og spiller en rolle i tumorgenese, som demonstrert i flere typer vev
in vivo product: [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28]. Vi viste tidligere at FAK sletting hemmer mus hudkreft utvikling og ondartet progresjon, og at FAK sletting fremmer apoptotisk død av normal hud keratinocytter i kultur [25]. Mer nylig har vi også gjort bruk av K14-Cre-ER
T2 /f
lox
-FAK mus system for å utlede plateepitel kreftceller (SCC) fra kjemisk indusert svulster [29], [ ,,,0],30]. FAK delesjon forårsaker flere mangler, blant annet svekket polarisering og responser til retningsbestemte signaler, slik som kjemotaktisk invasjon, så vel som nedsatt vekst i 3-dimensjoner (selv om vekst på 2-D plast er upåvirket) og forsinket vekst som xenotransplantater
in vivo product: [29], [30].
FAK-formidlede pro-overlevelse funksjoner er antatt å spille en viktig rolle i kreftcelleoverlevelse, og at dette sannsynligvis innebærer p53 veien [31]. Dessuten inneholder den FAK-promotoren p53-responsive elementer og kan bli nedregulert ved DNA-skade i et p53-avhengig måte, mens FAK-ekspresjon korrelerer med mutant p53 i brystkreft [32], [33], [34]. Det er også
in vitro Hotell og
in vivo
dokumentasjon som viser at FAK knock-down kan sensitiv celler til cytostatika [2], [35], [36], [37], [ ,,,0],38], [39], [40], [41]. I motsetning til dette, er det relativt få studier på rollen til FAK i strålefølsomhet. FAKfosforylering induseres etter eksponering for ioniserende stråling
in vitro product: [42], selv om dette kan bare ha vært en forbigående stressrespons som FAK rolle ble ikke utforske. Det er imidlertid en rapport som siRNA-mediert FAK knock-down fremmer radio-sensibilisering i kreft i bukspyttkjertelen celler [43], selv om den underliggende mekanisme er uklar. I tillegg, over-ekspresjon av FAK i HL-60-celler overfører markert resistens mot en rekke apoptotiske stimuli, inkludert ioniserende stråling, [44], alt tyder på at inhibering av signalisering gjennom FAK er egnet til å fremme radio-følsomhet. Her har vi brukt en ren genetisk sletting /tilberedning system for å teste FAK rolle i cellulære stråling svar
in vitro Hotell og
in vivo
, spesielt i FAK-mangel SCC celler (og deres FAK-uttrykke kolleger), og begynner å dissekere ut den underliggende mekanismen.
Resultater
Vi avledet SCC celler fra kjemisk indusert plateepitelkreft kreft i mus som uttrykte en
floxed
form av ATP-bindende kodende ekson av
fak
under kontroll av hud-spesifikke (K14)
Cre rekombinase
fusjonert til østrogen-reseptor [25]. Eksisjon av
floxed
–
fak
ved en enkelt behandling med 4-hydroksy-tamoxifen (4-OHT) resulterte i fullstendig FAK protein deficiency [29], [30] (se også fig. 1C og 2B), som vi kunne snu ved å re-uttrykke vekt FAK, slik at vi kan studere hvordan kreftceller takle alvorlig forstyrrelse av den inte /FAK signalveien. For å vurdere radio-følsomhet, ble en begrensende fortynning klonogene-målingen ble utført som sammenligner FAK – /- med FAK WT celler ved økende doser av stråling opp til 10 Gy. Dette viste at fullstendig fravær av FAK i disse cellene var assosiert med økt radio-motstand
in vitro plakater (Fig. 1a). En statistisk signifikant forskjell i overlevende fraksjon ble sett ved doser på 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy og 10 Gy (p-verdier på 0,0136 henholdsvis 0,0097, 0,0045 og 0,0036, analysert ved studentens uparet t-test, n = 9).
(A) Subkonfluente populasjoner av FAK – /- og FAK-wT celler ble trypsinisert og fortynnet i dyrkningsmedium til en endelig konsentrasjon som ville tillate enkel koloni vekst. 100 ul av denne suspensjonen ble tilsatt til hver brønn av en 96 brønns plate. Etter inkubering i 6 timer for å tillate cellefesting platene ble bestrålt med 0, 2, 4, 6, 8 eller 10 Gy. Cellene ble analysert i triplikat for hver enkelt stråledose. Etter 7 dager ble antall kolonier per plate tellet, og de overlevende fraksjon beregnet. Den grafiske fremstilling vist representerer middelverdien ± SEM fra tre separate eksperimenter. Overlevende fraksjoner på hver dose av strålings ble sammenlignet med u-bestrålte celler ved studentens uparet t-test, n = 9 (B) 2 x 10
5 FAK – /- og FAK-WT celler ble injisert subkutant i høyre flanke av kvinnelige nakne mus. Xenotransplantater fikk lov til å nå ca 150 mm
3. Dyrene ble deretter bestrålt med 5 Gy bestråling av hele kroppen eller mock bestrålt. Etter 7 dager ble xenotransplantater ble målt og musene ble avlivet. De gjennomsnittlige xenograft volumer ± SEM før stråling (øvre paneler) og etter stråling (nedre paneler) er vist. Statistisk analyse av modellen bestrålt versus bestrålte volum på 7 dager ble bedømt ved studentens uparet t-test, * angir p 0,05, n = 10. (C) Proteinekstrakter ble fremstilt fra de xenotransplantater, separert ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose og blottet med anti-FAK (øvre) og anti-β-aktin (lavere) antistoffer. En prøve av fem forskjellige ekstrakter fra hver gruppe er vist. En positiv kontroll (FAK vekt- celleekstrakt) ble tilsatt til den endelige kjørefelt av FAK – /-. Xenograft prøver
(A) FAK – /- og FAK WT-celler ble bestrålt med 5 Gy ved 70% samløpet og lysatene forberedt på angitte tidspunkter. Immunoblotting ble deretter utført med anti-p21 (øvre panel), og anti-β-aktin (nedre panel). (B) Proteinekstrakter ble fremstilt fra Subkonfluente FAK – /- og FAK vekt- cellepopulasjoner, separert ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose, og blottet med anti-FAK (øvre panel), anti-p21 (midtre panel) og anti- β-aktin (nedre panel) antistoffer. (C) RNA ble ekstrahert fra Subkonfluente FAK – /- og FAK-WT celler, PCR utført og produktet analysert. p-aktin lasting er også vist (nedre panel). (D) Proteinekstrakter ble fremstilt fra FAK – /- og FAK vekt- cellepopulasjoner på nivå med konfluens angitt. Immunoblotting ble deretter utført med anti-p21 (øvre panel) og anti-β-aktin (nedre panel) antistoffer.
Vi har også testet om FAK påvirket radio-følsomhet
in vivo
ved sammenligning FAK – /- og FAK vekt- SCC-xenografter. 2 x 10
5-celler ble injisert subkutant inn i høyre flanke av kvinnelige nakne mus og dyrene var enten bestrålt med 5 Gy (i form av bestråling av hele kroppen) eller mock bestrålt når xenotransplantater nådde omtrent 150 mm
3. Denne størrelsen ble valgt som FAK – /- svulster hadde overvunnet en innledende forsinkelse i deres vekst
in vivo
, og deres rate spredning på dette punktet var ikke signifikant forskjellig fra sine FAK wt kolleger. Tidligere undersøkelser viste at CD1 stammen av nakne mus kunne tolerere 5 Gy total kroppsdose i 10-14 dager. Etter 7 dager ble xenotransplantater målt, og dyrene ble avlivet. Tumorvolumene ble beregnet før og etter 5 Gy bestråling eller mock bestråling, og analysert ved hjelp av studentens uparet t-test. En statistisk signifikant reduksjon i tumorvolum ble observert i de bestrålte FAK wt xenotransplantater sammenlignet med modell bestrålte kontroller (p = 0,0030, n = 10), men dette ble ikke replikert i FAK – /- xenotransplantater (p = 0,3300, n = 10) (fig. 1B). Proteinekstrakter ble fremstilt fra 5 mus i hver gruppe og underkastet Western-blotting for å bekrefte graden av FAK-ekspresjon i FAK – /- og FAK vekt- tumorer (Fig. 1C). De lave nivåer av FAK-liggende fra FAK – /- tumor-avledede materiale er sannsynlig fra den lille mengden av stromal eller immun infiltrat (figur 1C.)
SCC-celler som vi anvendte, her uttrykt vill-type p53 (bekreftet. ved sekvensering (ikke vist)), og vi identifisert en FAK-avhengig forskjell i induksjon av p53 target-genet, p21, etter bestråling (figur 2, jf. også senere). Nærmere bestemt, induksjon av p21 var tydelig etter 2 timer etter behandling av FAK – /- celler med 5 Gy bestråling; I motsetning til dette ble p21 ikke indusert når FAK var til stede (fig. 2A). Interessant, basale nivåer av p21-protein og mRNA i sub-konfluente populasjoner av begge FAK – /- og FAK WT-celler var lik (Fig 2B og 2C, respektive.), Mens p21-nivåer ble forhøyet i begge cellelinjer med økende sammenflytning (Fig . 2D). Dette var i tråd med en vidt akseptert rolle for p21 i kontakt-indusert cellesyklus-stans (fig. 2D), og viste at en annen stimulans var i stand til å øke p21 nivåer uavhengig av FAK status. For å sikre at avvik i induksjon av p21 etter eksponering for ioniserende stråling var ikke relatert til forskjeller i celletetthet, omsorg ble tatt i alle eksperimenter for å sikre at cellene ble bestrålt ved sammenlign konfluens, typisk 70%.
FAK Avhengigheten av p21 forskriften ble gjengitt
in vivo
. Nærmere bestemt ble nakne mus injisert subkutant med 2,5 x 10
5 FAK – /- eller FAK WT-celler, xenotransplantater ble tillatt å etablere, og dyrene ble deretter bestrålt med 5 Gy bestråling når tumorene nådde ca 500 mm
3 i volum. Mus ble ofret på 0, 2 timer, 6 timer og 24 timer etter bestråling (n = 3 pr gruppe) og p21 nivåer ble vurdert av både western blotting av tumorlysatene og immunhistokjemi (IHC) farging av parafin innebygd vev. De FAK – /- xenografter viser en økning i p21 protein nivå så tidlig som 2 timer etter bestråling (figur 3A, venstre panel.); p21 nivåer dukket maksimal rundt denne tiden. Økningen i p21 var også synlig ved IHC (fig. 3A, høyre panel). Mean p21 positivitet (basert på scoring av 20 felt) ble analysert på tvers av alle tidspunkter og denne viste en signifikant forskjell i p21 nivåer i svulstene av bestrålt
versus
un-bestrålt dyr (Kruskal-Wallis, p = 0,038, n = 3). Videre individuell sammenligning av de separate tidspunkter illustrert en statistisk signifikant økning i p21 score sammenlignet med basislinjenivåer (Mann Whitney, p = 0,0404, n = 3). I motsetning til dette ble det av FAK wt xenotransplantater ikke påvise noen konsekvent økning i p21 nivåer på noen av de undersøkte tidspunkter. Western blotting av FAK wt-uttrykkende tumor lysater bekreftet tilstedeværelsen av FAK, men det var ingen nevneverdig økning i p21-proteinnivåer (Fig. 3B). Videre analyser av IHC (Fig. 3B, høyre panel) bekreftet at det var ingen signifikant økning i p21 uttrykk på 2 timer (p = 0,6625), 6 timer (p = 0,6625), eller 24 timer (p = 0,3827) (Mann Whitney, . n = 3), sammenlignet med kontroller
(A) FAK – /- SCC-celler, eller (B) FAK vekt- SCC-celler, ble injisert subkutant inn i høyre flanke av kvinnelige nakne mus. Når xenografter nådde ca 500 mm
3, mus ble bestrålt med 5 Gy og ofret på 0, 2 timer, 6 timer og 24 timer (n = 3 per gruppe). Halvparten av xenograft ble fiksert i formalin og deretter innstøpt i parafin, og den andre halvparten ble hurtigfrosset i flytende nitrogen. Proteinekstrakter ble fremstilt fra de frosne seksjoner, atskilt ved hjelp av SDS-PAGE, overført til nitrocellulose, og blottet med anti-FAK (øvre blot panel), anti-p21 (midtre blot panel), og anti-β-aktin (lavere blot panel ). Parafininnebygd seksjonene ble farget med p21 og p21-positive celler visualisert ved IHC (høyre panel). Representative lyse felt bilder av p21 farget vev ved 0, 2 timer, 6 timer og 24 timer poste stråling vises (skala bar, 0,1 mm).
Vi hentet RNA fra sub-konfluente bestander av FAK – /- og FAK-wT celler ved forskjellige tidspunkter etter 5 Gy bestråling, og QRT-PCR ble utført ved anvendelse av primere for endogen p21. Det var en bifasisk økning i p21 mRNA nivåer, med en topp på 2 timer og 6 timer etter bestråling i FAK – /- celler; I motsetning til p21 mRNA-nivåer ikke ble indusert i FAK wt-cellelinjen etter bestråling (Fig. 4A). RNA ble også utvunnet fra begge cellelinjene 2 timer etter en rekke stråledoser (0, 2, 5, 10, 20, og 30 Gy) og analysert ved hjelp av QRT-PCR. Vi har funnet at p21 mRNA-nivåer økte i FAK – /- SCC-celler på en doseavhengig måte (området fra 2 til 10 Gy Gy); ytterligere doseøkning ikke føre til ytterligere økt p21 mRNA. Den doseavhengige økning i p21-transkripsjon ble svekket ved re-ekspresjon av FAK wt i FAK-mangel SCC-celler (Fig. 4B). I parallelle forsøk, fant vi at økt stabile nivåer av p21 protein var tydelig etter bestrålingen på ulike doser i FAK – /- SCC celler, og at dette ble svekket da FAK uttrykk ble restaurert (Fig. 4C, sammenligne venstre og høyre panel) . For å komplettere den genetiske delesjon av FAK, vi brukte også en FAK-kinase inhibitor (PF-562 271; [45]), i en dose på 0,5 uM (som er optimal for inhibering av FAK-kinase-aktivitet i disse celler (ikke vist)) for to timer før bestråling, og som er samlet proteinlysatene for immunblotting på 0, 2, 4 og 6 timer etter 5 Gy. p21 nivåene ble synlig øket ved 2 timer etter bestråling i 0,5 uM PF-562 271 behandlede FAK vekt- celler når sammenlignet med ubehandlede celler (figur 4D.)
(A) RNA ble ekstrahert fra Subkonfluente FAK -. /- og FAK wt cellepopulasjoner ved forskjellige tidspunkter etter 5 Gy bestråling. QRT-PCR-analyse ble så utført i tre eksemplarer. Ganger økning i p21 mRNA nivåer ble beregnet ved hjelp av DDC (t) metode med β-actin som en lasting kontroll. Grafisk representasjon av kombinert gjennomsnitt ± SEM fra tre eksperimenter er vist. (B) RNA ble ekstrahert fra sub-konfluente FAK – /- og FAK vekt- cellepopulasjoner 2 timer etter 0, 2, 5, 10, 20, og 30 Gy bestråling. cDNA ble deretter generert og QRT-PCR for p21 utført som beskrevet ovenfor. (C) Proteinekstrakter ble fremstilt fra FAK – /- og FAK wt cellepopulasjoner 2,5 timer etter eksponering for forskjellige doser av stråling. Ekstraktene ble separert ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose, og blottet med anti-p21 (øvre panel) og anti-β-aktin (nedre paneler). (D) FAK-WT celler ble inkubert i 2 timer med enten den FAK-inhibitoren PF-562271 0.5 uM, eller 0,1% DMSO bare, så bestrålt med 5 Gy. Proteinekstrakter ble fremstilt ved 0, 2, 4 og 6 timer og immunoblot probet med anti-p21 (øvre panel), og anti-β-aktin (nedre paneler). Representative immunoblotter fra 0,1% DMSO (til venstre) og 0,5 mikrometer narkotika behandlet (høyre) cellepopulasjoner blir vist.
Som forventet, p21 steady state nivåer i SCC cellene var minst delvis avhengig av p53, og stråling-indusert p21 i SCC celler ble hemmet av knock-down av p53 ved hjelp av siRNA (fig. 5A-C). Men vi også bemerkes at p53 induksjon etter bestråling var ikke særlig sterkt og var lik i begge FAK – /- og FAK vekt- SCC-celler (figur 5D.), Noe som indikerer at tilstedeværelse av FAK ble fører til noen frakopling av p53 og p21 induksjon og følsomhet for bestråling i disse kreftceller. Densitometry ble gjennomført for å kvantifisere fold endringer i p21 og p53 protein nivåer etter bestråling av FAK-dyktige og FAK-mangel SCC celler (Figur S1). Disse funnene antyder at betydelig økt transkripsjon og ekspresjon av p21-protein forekommer i FAK – /- celler etter klinisk relevante doser av ioniserende stråling, og at denne responsen blir sløvt av tilstedeværelsen av FAK. Derfor, for å FAK-funksjoner i disse avanserte kreftcellene undertrykke p53-avhengig transkripsjon av p21 etter bestråling. Dette er ikke synlig knyttet til differensial induksjon av cellesyklus-stans (figur S3 (bestemt som beskrevet i Methods S1)) eller apoptose, noe som er vanskelig å oppdage etter SCC celle bestråling som bedømt ved mangel på sub-G1 DNA-innhold (ikke vist) . Dette er til tross for differensial regulering av ekspresjon av p53-genet target Puma (figur S4) som kan være forbundet med apoptose
(A) FAK -. /–Celler ble transfektert med 100 nM siRNA (enten kryptert basseng eller p53 siRNA) ved 50% konfluens. Etter 24 timer, proteinekstrakter ble fremstilt og immunoblot probet med anti-p53 (øvre panel), anti-p21 (midtre panel) og anti-β-aktin (nedre panel). (B) Densitometry sammenligne p21 nivåer i FAK – /- proteinekstrakter behandlet med enten en egge pool av siRNA eller p53 siRNA ble utført. De p21 proteinnivåer ble normalisert til p-aktin og resultatene som er vist er representative for ett av tre separate forsøk. (C) FAK – /- celler ved 50% konfluens ble transfektert med enten 100 nM kryptert siRNA eller 100 nM p53 siRNA, inkubert i 24 timer, deretter bestrålt med 5 Gy. Lysates ble samlet på tidspunkter som er angitt og immunoblotter probet med anti-p53 (øvre panel), anti-p21 (midtre panelet) og anti-β-aktin (nedre panel). (D) Proteinekstrakter ble fremstilt fra FAK – /- og FAK-WT celler 2 timer etter eksponering for forskjellige doser av stråling (0-30 Gy). Ekstraktene ble separert ved SDS-PAGE og immunoblot probet med anti-p53 (øvre panel) og anti-β-aktin (nedre paneler). Den høyre kjørefelt i hver gel inneholder proteinekstrakter fra FAK – /- eller FAK WT celler eksponert for natten behandling med 0,1 mikrometer av actinomycin D.
Tidligere arbeid har etablert klare sammenhenger mellom FAK og p53 som fremmer overlevelse etter stressinduserte signalering (i celler som mangler p21),
via
FAK FERM domene binding til p53 i kjernen, tilrettelegging p53 degradering og overlevelse [46]. Derfor immunutfelt vi FAK fra lysater av wt FAK SCC-celler før og etter 5 Gy bestråling, og immunoblottet for p53 og for Src (som en positiv kontroll). Som forventet, ble Src bundet til FAK, og dette var uforandret ved bestråling (fig S2A (bestemt som beskrevet i Methods S1)). Men vi fant ut at FAK ikke samhandle med p53 (Fig. S2A). Lysates ble analysert for FAK, Src og p53 for å sikre lik belastning (Fig. S2B). Vi fant også at p53 var effektivt translokert til kjernen i begge FAK – /-. Og FAK-WT celler etter bestråling (ikke vist)
Siden p21 har vært forbundet med både motstand og følsomhet for DNA-ødeleggende midler, inkludert ioniserende stråling, vi neste utarmet p21 hjelp siRNA. Vi oppnådde rundt 90% knock-down av p21 i SCC celler (Fig. 6A og 6B). Clonogenicity ble så vurdert på 0, 4 og 8 Gy og sammenligning mellom celle populasjoner transfektert med p21 siRNA, egge siRNA eller kontroll cellepopulasjoner som hadde vært mock transfekterte. Vi har funnet en signifikant forskjell i overlevende fraksjon ved 8 Gy (p = 0,0129) mellom det forvrengte siRNA- og p21 siRNA-behandlede celler, slik at p21 fremmet radio-motstand i SCC-celler (fig. 5C). Det er derfor en sterk sammenheng mellom stråling-indusert p21 i FAK-mangel celler (men ikke i sine FAK-uttrykke kolleger) og funn som FAK tap induserer radio-motstand der p21 har en kausal rolle i SCC cellene.
(A) FAK – /- SCC-celler ble transfektert med 100 nM siRNA (enten en kryptert basseng eller p21 siRNA) ved 50% konfluens. Etter inkubering i 24 timer, ble proteinekstrakter immunoblottet og probet med anti-p21 (øvre panel) og anti-β-aktin (nedre panel). (B) Densitometry sammenligne p21 nivåer i FAK – /- proteinekstrakter behandlet med enten en egge pool av siRNA eller p21 siRNA ble utført. De p21 proteinnivåer ble normalisert til p-aktin nivå, og resultatene som er vist er representative for ett av tre separate forsøk. (C) FAK – /- celler som var narretransfekterte eller transfektert med 100 nM av enten en kryptert siRNA basseng eller p21 siRNA ved 50% konfluens. Etter 24 timer ble cellepopulasjoner ble trypsinisert og fortynnet i dyrkningsmedium til en endelig konsentrasjon som ville tillate enkel koloni vekst. 100 ul av denne suspensjonen ble deretter tilsatt til hver brønn av en 96 brønns plate. Etter inkubering i 6 timer for å tillate cellefesting platene ble bestrålt med 0, 4, 8 eller Gy. Platene ble satt opp i triplikat for hver stråledose. Etter 7 dager ble antall kolonier per plate ble tellet, og de overlevende fraksjon beregnet. Grafen viser gjennomsnitt ± SEM fra tre separate eksperimenter. Overlevende fraksjoner av p21 siRNA behandlede celler ble sammenlignet med egge siRNA behandlede celler ved hver dose av stråling og statistisk signifikans bestemt ved studentens uparet t-test, * angir p 0,05, n = 9.
Endelig , vurderte vi om FAK-mangel påvirket mer generelle funksjoner knyttet til DNA-skader. Vi fant at mRNA nivåer av en rekke p53 målgener som er involvert i reparasjon følgende ioniserende stråling, nemlig
gadd45
,
p53R2 Hotell og
ddb2
, og er kjent å bli nedregulert ved c-Myc [47], ble stimulert i FAK – /- SCC-celler, men gjennomgående i mindre grad i deres FAK-uttrykkende motstykker (fig 7.). Dette gjaldt særlig for
ddb2
2 timers tidspunkt, for
gadd45
på senere tidspunkter, og for
p53R2
gjennom 0-24 timer etter bestråling ( fig. 7A, B og C). Siden vi viste at FAK er nødvendig for c-Myc oppregulering nedstrøms
APC
delesjon i mus tarmen [22], kan det være at FAK svekker strålings-indusert ekspresjon av genomet integritet vedlikeholds gener i celler SCC
via
c-myc-mediert undertrykkelse. Imidlertid bemerkes vi at BRCA1 gir et eksempel på en DNA-skade responsive genet som bare minimalt påvirket av FAK tap; ja, er BRCA1 uttrykk trykt av FAK mangel på senere tidspunkt etter bestråling (Fig. 7D). De konkluderer dermed med at strålings-indusert transkripsjon av et sub-sett av p53-responsive gener moduleres av nærvær eller fravær av FAK, og det er ikke bare på grunn av generell p53 dysfunksjon.
RNA ble ekstrahert fra Subkonfluente FAK – /- og FAK vekt cellepopulasjoner på ulike tidspunkter etter 5 Gy bestråling. QRT-PCR analyse ble utført ved hjelp av primere rettet mot Ddb2 (A), gadd45 (B), p53R2 (C) og BRCA1 (D), og disse var normalisert p-aktin.
Som nevnt, var det ikke mulig å påvise apoptose eller differensial cellesyklus-stans som kan tilbakeføres til FAK status. Derfor, vi neste undersøkt fosforylering av serin 139 av Histone γH2AX som oppstår som respons på ioniserende stråling [48] og er ansett for å være en pålitelig surrogat av dobbeltstrenget brudd reparasjon. Kvantifisering av andelen av kjerner som inneholder mindre enn 5 eller ≥ 5 γH2AX foci viste at begge FAK – /- og FAK wt populasjoner hadde ≥5 γH2AX foci i praktisk talt alle celler en time etter bestråling med 5 Gy (Fig 8A.). Men FAK – /- cellene begynte å fjerne disse brennpunkter innen 6 timer og disse returnerte til baseline nivå innen 24 timer; i motsetning FAK re-ekspresjon i FAK WT-celler førte til en langsommere brennpunktene clearance (sammenlign 6 og 24 timers tidspunkter, (figur 8A) Dette er i overensstemmelse med mer effektiv DNA-reparasjonsaktivitet i FAK -.. /- celler, og langsomt reparasjon når FAK er tilstede Representative bilder av γH2AX immunfluorescens i FAK -. /- celler (før og en time etter 5 Gy bestråling) er vist (fig 8B.) Vi fant også at FAK -. /- SCC celler dukket å ha generelt høyere nivåer av γH2AX foci i henhold til kontrollbetingelser (0 timer) enn sine FAK-uttrykkende motstykker (bilder ikke vist), med mest FAK – /- celler som viser flere brennpunkter og omkring 10-15% som viser ≥5 foci (fig. . 8A, 0 timer) dette tyder på at FAK-manglende SCC-celler kan ha større genetisk ustabilitet enn deres FAK wt motstykker, minst ser det ut til at FAK – /- SCC-celler har generelt forbedrede DNA-reparasjonsfunksjoner, og dette korrelerer med radio-motstand . Interessant, vi fant ikke noen forskjell i FAK avhengig regulering av stråling-indusert fosforylering av enten p53 eller Chk2 (fig. S5)
(A) FAK -. /- Og FAK-WT celler ble sådd ut ved lav tetthet på dekkglass, inkuberes i 24 timer og bestrålet med 5 Gy. På forskjellige tidspunkter ble cellene fiksert, permeabilised, farget med anti-fosfo-γH2AX (serin 139) og visualisert ved hjelp av konfokal mikroskopi. Antallet foki pr kjerne (mindre enn 5 foci eller ≥5 foci) ble dokumentert i minst 100 celler. Resultatene som er vist er representative for ett av to separate eksperimenter. (B) Representative bilder demonstrere un-bestrålt og bestrålt FAK – /- celler i en time etter 5 Gy vises, grønn – fosfor-γH2AX og blå – DAPI (skala bar, 20 mikrometer), pil i øvre høyre boksen viser på en kjerne med. 5 foci og brutt pilen i nedre høyre boksen peker på en kjerne med ≥ 5 foci
Diskusjoner
Vi her viser at, i sterk kontrast til en forrige rapport hvor FAK knock-down lysfølsomt kreft i bukspyttkjertelen celler til ioniserende stråling [43], FAK sletting (og en FAK kinase inhibitor) kan undertrykke aliserte til stråling-indusert, p53-mediert induksjon av p21, og dette er knyttet til radio- motstand i avanserte SCC celler. Vi tror det er viktig å registrere at FAK rolle i cellulære responser til ioniserende stråling, og kanskje pro-overlevelse signalering generelt, kan være kontekstavhengig, og at det må være forsiktig når du vurderer terapeutiske kombinasjoner av FAK-hemmere og strålebehandling, da dette kan ikke alltid være klinisk gunstig.
i arbeidet er beskrevet her, viser vi at du sletter FAK (eller hemme kinase aktivitet) kan slippe begrensninger FAK steder på signalering fra p53 til induksjon av flere mål gener, nemlig p21 og i det minste en delmengde av p53-regulerte gener involvert i DNA-reparasjon i SCC-celler. Videre FAK – /- SCC-celler synes å være mer effektiv ved reparasjon etter strålings-induserte DNA-skade. Men i disse cellene vi ikke fant noen signifikant effekt av FAK sletting på p53 protein stabilitet (enten som svar på bestråling eller DNA-skade narkotika), p53 fosforylering eller evne til p53 til translocate til kjernen, og vi kunne ikke finne bevis av et FAK /p53-kompleks som har blitt rapportert å operere i andre sammenhenger. Dermed vårt arbeid legger til en voksende mengde bevis for at det er funksjonelt krysstale mellom FAK og p53 signalveier, men viser at det er flere måter dette kan skje. Selv om vi ikke fullt ut forstår mekanismen, fant vi at i SCC celler som vi kunne slette FAK ved rekombinasjon, FAK funksjoner for å undertrykke stråling-indusert DNA reparasjons funksjoner av p53 ved å blokkere induksjon av p21, og at dette er knyttet
