Abstract
Bakgrunn
Nuclear faktor kB (NFkB) spiller en sentral rolle i reguleringen av apoptose. Funksjonen av NFkB inhiberes ved binding til NFkB inhibitor (IkB), og forstyrrelse av balansen av NFkB og IkB er relatert til utvikling av mange sykdommer, inkludert tumorer. Derfor har vi en hypotese om at
NFκB1 (-94del /insATTG) Hotell og
NFκBIA plakater (2758 A G). Polymorfismer ble assosiert med tykk- og endetarmskreft (CRC) mottakelighet
metoder
i en sykehusbasert case-control studie av 1001 CRC pasienter og 1005 kreftfrie kontroller frekvens matchet etter alder og kjønn, genotypet vi polymorfismer ved hjelp av polymerase chain reaction-rflp (PCR-RFLP) metode og utført luciferasepreparater analyser og Western blotting-analyse for å finne ut om genetiske varianter i
NFκBIA
endre sine genekspresjon og funksjoner og dermed risikoen for kreft.
Resultater
Vi fant at begge
NFκB1-94 ins /delATTG Hotell og
NFκBIA 2758 A G
polymorfismer ble korrelert med CRC risiko (OR = 1,47; 95% CI = 1,14 til 1,86, og OR = 1,38; 95% CI = 1,14 til 1,66, henholdsvis). Videre, når evaluert disse to polymorfismer sammen, de kombinerte genotyper med 2-variant (risiko) alleler (
2758GG Hotell og
-94ins /ins + del /ins
) var assosiert med økt risiko for CRC (OR = 1,71; 95% CI = 1,23 til 2,38) sammenlignet med 0-varianten, og den betydelige utviklingen for to variant (risiko) alleler var mer uttalt blant undergrupper av alderen 60 år, kvinner, aldri drikker, som aldri har røykt, personer med en normal BMI og de med en familie historie av kreft (
P
trend
0,01). Videre luciferase analysene viste at G-allelet i 3’UTR betydelig redusert
NFκBIA
mRNA stabilitet og
En
allel regulering av
miRNA449a in vitro Hotell og at NFκBIA protein expression nivåer av
AA + AG: variant bærere var signifikant høyere i peritumoral vev enn de av
2758GG
genotype.
Konklusjon
NFκB1 Hotell og
NFκBIA
polymorfismer ser ut til å i fellesskap bidra til risiko for CRC. Disse to variantene kan være en genetisk modifier for CRC mottakelighet i denne sørlige kinesiske befolkningen
Citation. Song S, Chen D, Lu J, Liao J, Luo Y, Yang Z, et al. (2011)
NFκB1 Hotell og
NFκBIA
Polymorfisme er assosiert med økt risiko for Sporadisk tykktarmskreft i en Southern kinesiske befolkningen. PLoS ONE seks (6): e21726. doi: 10,1371 /journal.pone.0021726
Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge
mottatt: 23 mars 2011; Godkjent: 06.06.2011; Publisert: 30 juni 2011
Copyright: © 2011 Song et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Scientific Foundation of China tilskudd [81072042 Lei Wang, 81072366 til Jiachun Lu og 81001108 til Yisheng Wei], Guangdong Provincial vitenskapelige stipend~~POS=HEADCOMP [8151008901000059, 10251008901000008 til Lei Wang], det Gongdong provinsen regjeringen, Education Department av kinesiske regjeringen, vitenskap og teknologi Institutt for kinesiske regjeringen [00590101220610034 til Jianping Wang], og Forskningsfondet for doktorgradsutdanning av høyere utdanning i Kina [200805580074 å Jianping Wang] og Yat-Sen Innovative Talenter Dyrking Program for Excellent Lærere [88000 -3126201 til Dianke Chen og Lei Wang] og støttet av de grunnleggende forskning Midler til de sentrale universiteter. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen hos menn og den nest vanligste kreftformen hos kvinner rundt om i verden, og det er anslått at det var om lag 1,2 millioner nydiagnostiserte CRC tilfeller og 608,700 relaterte dødsfall i 2008 [1]. Poster fra den kommunale død registret av byen Guangzhou, Guangdong, Kina, tyder på at CRC er den femte vanligste kreftformen. Dødeligheten ble dramatisk økt fra 4,33 /10
5 personer i 1970 til 12,13 /10
5 personer fra 2000-tallet [2]. Flertallet av CRC tilfeller (ca. 80%) er sporadisk [3], men en arvelig predisposisjon er til stede på 20-35% av pasientene, noe som tyder på at både genetiske og miljømessige faktorer bidrar til CRC utvikling [4]. Drikking av alkohol og tobakksbruk [5], [6], kosttilskudd og livsstilsfaktorer [7], og inflammatorisk tarmsykdom så som ulcerøs kolitt [8], [9] har vist seg å være forbundet med risiko CRC. Selv om mange mennesker er utsatt for disse risikofaktorene, bare noen av de eksponerte individer utvikler CRC, noe som indikerer at genetiske variasjonen delvis bestemmer individuell mottakelighet for tykktarms tumorigenesis.
apoptose, en svært regulert cellulære prosessen, deltar i utvikling, vev homeostase vedlikehold og eliminering av uønskede celler [10]. Feilregulering i denne prosess er egnet til å bidra til tumorgenese [11]. De biokjemiske mekanismer av apoptose er komplisert og avhenger ikke bare cellene, men også de som induserer apoptose. Betydelig bevis tyder på at forekomst og utvikling av kreft er forbundet med både forlenget celleoverlevelse og suspendert apoptose i forstadier til kreft, og følgelig kan avvikende apoptose tillate ukontrollert cellevekst [12].
nukleær faktor kappa B ( NFkB) er en viktig regulator transkripsjon av immunresponsen, celleadhesjon, differensiering, proliferasjon, apoptose og [13]. Fem medlemmer (P50 /P105, p65 /RELA, c-Rel, relB, og P52 /P100) i NFkB familien har blitt identifisert, og dimer form av NFκB1 p50 /RELA er den viktigste formen [14]. I hvile cellen, NFKB inaktivert i cytoplasma gjennom assosiasjon med en kompleksdannende inhiberende protein, IκBα, β eller γ, og den mest vanlige proteinet av denne familien er den NFkB inhibitor α (NFκBIA) [15]. I den klassiske reaksjonsveien aktiverings, fosforylering og degradering av de inhiberende proteiner føre til NFkB NFkB dissosiasjon fra komplekset og translokasjon til kjernen, hvor det kan aktivere transkripsjon av et stort antall gener [16]. Som et viktig transkripsjonsfaktor, medierer NFkB overlevelsen responsen ved å inhibere p53-avhengig apoptose og opp-regulerer anti-apoptotiske medlemmer av Bcl-2-familien og kaspaseinhibitorer [17], [18]. I kontrast er NFkB også aktiveres av både ytre og indre apoptotiske stimuli og formidler oppregulering av pro-apoptotiske gener som
TRAIL R2 /DR5
,
Fas
, og
Fas
ligand [19], [20]. En upassende aktivering av NFkB kunne forstyrre vev homeostase og føre til dysregulerte apoptose. Videre er aktiviteten av NFkB har blitt observert i flere typer kreft, inkludert CRC [21], [22], indikerer at det kan spille en viktig rolle i tumorgenese [23], [24].
NFκB1 product: (koding for NFkB) maps til kromosom 4q23-Q24 og består av 24 eksoner [25], [26], og dens hemmende gen
NFκBIA plakater (koding for IKB) er 3,5 kb lang, med seks eksoner, og er lokalisert på kromosom 14q13 [27], [28]. Genetiske studier har identifisert enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) i
NFκB1 Hotell og
NFκBIA product: [29], [30]. Nylig har en felles innsetting /sletting (-94 innsetting /deletionATTG rs28362491) polymorfisme i
NFκB1
promoter-regionen og en 3 «utranslaterte regionen (3’UTR) polymorfisme 2758A G (rs696) i
NFκBIA
ble observert å være signifikant korrelert med inflammatorisk tarmsykdom [31], [32] og cancere [33], [34], [35]. Epidemiologiske studier har også undersøkt sammenhengen mellom
NFκB1
polymorfismer og risiko for CRC i tyskere og
NFκBIA
polymorfi og risiko for CRC i det svenske med motstridende resultater [36], [37].
det har ikke vært tidligere rapport om sammenhengen mellom
NFκB1 Hotell og
NFκBIA
polymorfismer og CRC risiko. Som NFkB /IKB system spiller en viktig regulerende rolle i apoptotiske sti og feilregulert uttrykk for
NFκB1 Hotell og
NFκBIA
har blitt observert i CRC, hypotese vi at kombinert
NFκB1
og
NFκBIA
polymorfismer kan være forbundet med økt risiko for CRC. For å teste denne hypotesen, vi genotypede
NFκB1-94 innsetting /deletionATTG Hotell og
NFκBIA 2758A G
polymorfismer i vår pågående sykehusbasert case-control studie av CRC i sørlige kinesiske befolkningen, og videre utført luciferasepreparater analyser og Western blotting-analyse for å finne ut om genetiske varianter i
NFκBIA
endre sine genekspresjon og funksjoner og dermed risikoen for kreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studien protokollen ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene i Sun Yat-Sen University. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver deltaker etter en fullstendig forklaring av studien.
Studie fag og prøvetaking
Fra juli 2002 til april 2010, totalt 1001 pasienter med histopathologically bekreftede og ubehandlet sporadisk CRC ble prospektivt rekruttert fra den første og sjette Affiliated Hospital (Gastrointestinal Anal Hospital) og Cancer Center of Sun Yat-Sen University, Guangzhou, Kina, Affiliated Tumor Hospital i Guangzhou Medical College, Guangzhou, Kina, Guangdong Provincial Folkets Hospital, Guangzhou, Kina, og Panyu Folkets sykehus, Guangzhou, Kina. Alle disse fagene var genetisk urelaterte etniske Han-kinesere og var fra byen Guangzhou og omkringliggende områder i det sørlige Kina. Av de 1001 sakene som inngår i denne studien, var det 169 (16,9%) tilfeller av retten tykktarmskreft, 309 (30,9%) tilfeller av venstre tykktarmskreft, og 523 (52,2%) endetarmskreft. Ifølge amerikanske Joint Committee on Cancer staging Manual, var det 171 (17,1%) tilfeller av stadium I, 320 (31,9%) stadium II, 345 (34,5%) fase III, og 165 (16,5%) stadium IV. I mellomtiden ble totalt 1005 kreftfrie kontroller tilfeldig valgt fra en gjenstand pool av mer enn 10.000 personer som deltok i helsesjekk-up programmer hos kommunens helsestasjoner i Guangzhou, Kina.
Undersøkelsen deltakerne ble intervjuet og data om røykestatus, alkoholbruk og andre faktorer, inkludert familiehistorie med kreft ble oppnådd ved hjelp av et strukturert spørreskjema. Røykestatus, alkoholbruk og familiehistorie med kreft ble definert som beskrevet tidligere [38]. Temaer som kroppsmasseindeks (BMI) var mindre enn 18,5 kg /m
2 ble kategorisert som å være undervektig, fag som BMI var fra 18,5 til 24,0 kg /m
2 var normal kroppsvekt, de som har en BMI 24,0 kg /m
2 var overvektige [39]. Saker som tilhører familiær adenomatøs polypose og de tilfellene som oppfylte kriteriene for Amsterdam for arvelig nonpolyposis CRC ble ekskludert.
Genotyping
Fem ml blod ble samlet inn fra hver deltaker og genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Genotyping ble utført ved polymerase-kjedereaksjonen-rflp (PCR-RFLP) -metoden. For bestemmelse av
NFκB1
promoter (rs28362491) polymorfisme ble SNP-holdige fragment forsterket ved hjelp av følgende primere: 5′-TGGGCACAAGTCGTTTATGA-3 «(fremover) og 5′-CTGGAGCCGGTAGGGAAG-3» (bakover) . PCR ble kjørt ved 94 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 56 ° C i 30 s, og 72 ° C i 60 s med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min. PCR-produkter (281/285 bp i størrelse) ble fordøyd med
PFI
MI (Fermentas, Vilnius, Litauen) ved 37 ° C over natten, etterfulgt av 2% agarosegel-elektroforese. For bestemmelse av
NFκBIA plakater (rs696) polymorfisme, ble SNP-holdige fragment den forsterkede ved hjelp av følgende primere: 5′-GGCTGAAAGAACATGGACTTG-3 «(fremover) og 5′-GTACACCATTTACAGGAGGG -3» (bakover). PCR ble kjørt ved 94 ° C i 5 minutter etterfulgt av 32 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 54,3 ° C i 45 s og 72 ° C i 60 s med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min. De forsterkede fragmenter ble fordøyd med
Hae
III (Fermentas, Vilnius, Litauen) over natten ved 37 ° C, etterfulgt av 2% agarosegel-elektroforese.
Genotype analyse ble gjort av to forskere uavhengig som var blindet til status av fagene som pasient eller kontroll. For ytterligere å validere genotyping resultatene, vi tilfeldig valgt 10% prøver for hver av de 2 SNPs til å utføre gjentatte analyser, og resultatene var 100% konkordant. I tillegg ble 5% av PCR produktene for hvert mål genotype renset og bekreftet ved direkte sekvensering (figur S1 og Figur S2).
Bioinformatikk analyse
For å undersøke om genetiske varianter av
NFκBIA
kan binde seg til microRNAs (miRNA), søkte vi etter målet microRNAs av genetiske varianter av
NFκBIA
bruker algoritmen programmer (https://www.targetscan.org og http: //microrna.sanger .ac.uk /cgi-bin /mål /v5 /search.pl).
Cell kultur
Tre menneskelige kolorektal adenokarsinom cellelinjer, HCT116, HT29 og SW480 ble kjøpt fra Culture Collection of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og rutinemessig dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium eller RPMI 1640-medium supplert med 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS). Cellene ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO2 i en fuktet inkubator.
RNA interferens, forbigående transfections og luciferase analysene
MiR-449a
ligner målretting
NFκBIA
, 5′-UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU-3 «(sense) og 5′-CAGCUAACAAUACACUGCCAUU-3» (anti-sense),
MIR-449a
inhibitor, 5′-ACCAGCUAACAAUACACUGCCA-3 «, MIR -34b ligner målretting
NFκBIA
, 5′-CAAUCACUAACUCCACUGCCAU-3 «(fornuft) og 5′-GGCAGUGGAGUUAGUGAUUGUU-3» (anti-sense), og
Mir-34b
inhibitor, 5 « -AUGGCAGUGGAGUUAGUGAUUG-3 «ble syntetisert ved GenePharma Co (Shanghai, Kina). I tillegg 3’UTR av
NFκBIA 2758A
allel (2575-2955 bp i forhold til oversettelse start stedet) som inneholder
MIR-449a Hotell og
Mir-34b
bindingssetet ble amplifisert ved hjelp av de følgende to primere, 5′-CCGCTCGAGCAAAGGGGCTGAAAGAA-3 «(sense) og 5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAATGTGGTCCTTCCATGA-3» (anti-sense). De forsterkede fragmenter ble begrenset med
Xho
jeg og
Ikke
I (New England Biolabs, Ipswich, MA) og deretter ligert inn i
Xho
jeg og
Ikke
restriksjonssete av dual-luciferase plasmid, psiCHECK ™ -2 (Promega, Madison, WI). I tillegg 3′-UTR av
NFκBIA 2758G
allele, som inneholdt en mutert mRNA-bindingssetet, ble forsterket ved hjelp av PCR seterettet mutagenese og klonet inn psiCHECK ™ -2. For transfeksjon ble cellene sådd ut på 24-brønners plater med 1 x 10
5-celler /brønn og etter en inkubasjon over natten, ble cellene ko-transfektert med reporter plasmid (2758G eller 2758A-allel) og MIR etterligner eller inhibitorer bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) etter produsentens protokoll. Celler ble lysert 48 timer etter transfeksjon, og luciferaseaktiviteten ble målt ved bruk av en dual-luciferase reporter Assay System (Promega, Madison, WI). Hvert forsøk ble gjort i tre eksemplarer og minst tre ganger uavhengig
Western blotting-analyse
For å analysere sammenhengen mellom
NFκBIA
polymorfismer i sin 3’UTR (2758A . G ) og NFκBIA protein uttrykk nivåer i vev, 32 sammen svulsten og peritumoral vev ble oppnådd fra sporadiske CRC pasienter resected på sjette Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen universitetet og arkivert i svulsten banken. Alle vev prøver ble histologisk bekreftet. Immunoblotting ble utført som tidligere beskrevet [38] og antistoffer mot NFκBIA og β-aktin (Precision Task Group, Chicago, USA) ble anvendt for prosedyren. Protein densitometry ble utført ved hjelp av Gel-Pro Analyzer 4.0-programvaren (Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD) og NFκBIA uttrykk ble normalisert mot β-actin.
Statistisk analyse
Tosidig chi-kvadrat tester ble brukt for å vurdere forskjeller i fordelingen av alder, kjønn, røykestatus, alkoholbruk, BMI, menstruasjon historie, og familiehistorie med kreft mellom saker og kontroller. Hardy-Weinberg likevekt (HWE) ble testet av en godhet-of-fit chi-kvadrat test for å sammenligne de forventede genotypefrekvensene med observerte genotypefrekvensene (P2 + 2PQ + Q2 = 1) i kreftfrie kontroller. Sammenhengen mellom case-control status og hver SNP, målt ved odds ratio (OR) og den tilsvarende 95% konfidensintervall (CI), ble beregnet ved hjelp av en ubetinget logistisk regresjonsmodell, med og uten justering for alder, kjønn, røykestatus , alkohol drikking status, BMI, tumorlokalisering, og familiehistorie med kreft. Nylige studier tyder på at en analyse av de kombinerte genotyper kan være mer vitenskapelig betydning enn en analyse av en enkelt polymorfisme i å forutsi sykdoms assosiasjoner. Derfor kombin genotypen data ble ytterligere stratifisert etter alder, kjønn og røykestatus, alkohol drikking status, BMI, tumorlokalisering, og familiehistorie med kreft. Logistisk regresjon modellering ble også brukt til trenden test. Student t-testen ble utført for å undersøke forskjellen i nivået av luciferase-rapportør genekspresjon mellom ulike konstruksjoner. Kruskal-Wallis enveis ANOVA tester ble anvendt for å analysere NFκBIA protein ekspresjon i peritumoral vev av forskjellige genotyper. Alle testene var tosidige ved hjelp av SAS (versjon 9.1, SAS Institute, Cary, NC).
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Kjennetegn på studiepopulasjonen
Fordelingen av demografiske kjennetegn ved de 1001 sporadiske CRC tilfeller og 1005 kreftfrie kontroller er vist i tabell 1. Totalt ingen statistisk signifikant forskjell ble observert i alder, kjønn og røykestatus mellom sakene og kontroller (
P
0,05 i det hele tatt). Sammenlignet med kontroller, det var flere ever drinkers (tilfeller vs kontroller, 45,5% vs. 23,6%) (
P
0,01) i kohort av CRC tilfeller. Dessuten, sammenlignet med kontroller, CRC tilfellene var mer sannsynlig å ha en familiehistorie med kreft eller en høyere BMI (
P
0,05 i begge). Følgelig er det disse variablene ble ytterligere justert for i multivariate logistisk regresjonsmodell for å unngå mulige konfunderende på de viktigste effektene av SNPs som studeres. De ble også brukt i den påfølgende stratifisering og gen-miljø interaksjon analyse.
PCR-RFLP studie av
NFκB1
promoter-regionen og
NFκBIA
3 « UTR omegn
Vi har gjennomført analyser av
NFκB1
promoter-regionen ved hjelp av PCR-RFLP-metoden. To ATTG gjentar er til stede på
NFκB1
promoter-regionen, og ett allel som har en ATTG innsetting (ins) ble spaltet i en 45-bp og 240 bp fragment etter fordøyelse med
PFI
MI mens den andre delesjon allelet (del) som har bare en ATTG ved sin promotor ikke ble spaltet (figur 1.a). Videre, etter fordøyelse med
Hae
III,
2758GG
genotype produsert en 316-bp og 108 bp bandet mens 2758AA genotype produsert en eneste 424-bp band, og heterozygoter vises alle 3 band (figur 1.b).
(a)
PFI
MI fordøyelsen bandet profil av
NFκB1
genet på 2% agarosegel. Lane en Gene Ruler 100 bp Low Range Ladder, Lanes 2 og 7 del /ins heterozygot genotype, Lanes 4 og 6
ins /ins
genotype, Lanes3, 5
del /del
genotype. (B)
Hae
III fordøyelsen bandet profilen til
NFκBIA
på 2% agarosegel. Lane en Gene Ruler 100 bp Low Range Ladder, Lanes 3, 5 homozygot G /G genotype, Lanes 2 og 6 homozygot A /A genotype, Lanes 4, 7 heterozygote A /G genotype.
The
NFκB1-94ins /delATTG plakater (rs28362491) og
NFκBIA 2758A G plakater (rs696) polymorfismer er forbundet med risiko for sporadisk CRC
genotype og allel fordelinger av
NFκB1-94ins /delATTG plakater (rs28362491) og
NFκBIA 2758A G plakater (rs696) polymorfismer blant sakene og kontrollene er oppsummert i tabell 2. Den observerte genotypefrekvensene av disse to polymorfismer var alle i samråd med Hardy-Weinberg likevekt i kontrollpersoner (
P
0,05). Som vist i tabell 2, for rs28362491, fordeling av co-dominant genetisk modell (del /del vs. ins /ins vs. del /ins), og den dominerende modellen (ins /ins + del /ins vs. del /del) var signifikant forskjellig mellom CRC tilfeller og kontroller (moduler /moduler: OR = 1,70; 95% CI = 1.29 til 2.25;
P
0,01; del /moduler: OR = 1,33; 95% CI = 1,03 -1,74;
P
0,01; ins /ins + del /moduler: OR = 1,47; 95% CI = 1,14 til 1,86;
P
0,01, henholdsvis). For rs696, var det en signifikant forskjell i fordelingen av rs696 genotyper mellom CRC saker og kontroller (
P
0,01). Signifikante forskjeller ble også bemerket i fordelingen av recessive modell av rs696 (GG versus AA + AG) mellom CRC tilfeller og kontroller (OR = 1,38; 95% CI = 1,14 til 1,66;
P
0,05) . Konsekvent, ble signifikant sammenheng funnet mellom de to SNPs og risiko for sporadisk CRC.
Stratifisering analyse av foreningen av kombin
NFκB1 Kjøpe og
NFκBIA
polymorfismer med risiko for CRC
Vi videre analysert den kombinerte genotyper av
NFκB1 Hotell og
NFκBIA
polymorfismer ved å undersøke alder, kjønn, røyking, drikking, BMI, tumorlokalisering, og familie historie av kreft ved logistisk regresjon. Vi har kombinert den
NFκB1 Hotell og
NFκBIA
polymorfismer basert på antall variant (risiko) alleler (dvs.
2758GG Hotell og
-94ins /ins + del /ins
). Som vist i tabell 3, sammenlignet med
NFκB1-94 del /del Hotell og
NFκB1IA 2758AA + AG: genotype, en variant kombinert genotype bærere som var 60 år hadde en høyere risiko for CRC (OR = 1,57; 95% CI = 1,04 til 2,38) (
P
0,05). Ytterligere fordeling analyse viste at personer med to varianter hadde en betydelig høyere risiko for CRC blant undergrupper av pasienter i alderen 60 år (OR = 2,18; 95% CI = 1,37 til 3,44) (
P
0,01) , kvinner (OR = 2,36; 95% CI = 1,35 til 4,10) (
P
0,01), som aldri har røykt (OR = 2,05; 95% KI = 1.30 til 3.22) (
P
0,01), aldri drinkers (OR = 1,87; 95% CI = 1,23 til 2,84) (
P
0,01), personer med en normal BMI (OR = 1,80; 95% CI = 1.21- 2,69) (
P
0,01) og de med en familie historie av kreft (OR = 4,57; 95% CI = 1,34 til 15,6,
P
. 0,05)
MiR-449a
ligner trykkes aktivitetene til
NFκBIA
2758 A G polymorfisme
Vi analyserte 3’UTR videre
NFκBIA
2758 A G polymorfisme ved hjelp av en datamaskin algoritme og fant at polymorfisme kan påvirke miRNA bindende.
MiR-449a Hotell og
Mir-34b
, som er involvert i en rekke biologiske funksjoner, ble funnet å ha et bindingssete i 3′-UTR av
NFκBIA
2758 A G polymorfisme (figur 2a). For å bestemme allel-spesifikk effekt av
NFκBIA
2758 A G variant på aktiviteten i 3’UTR og om dette polymorfisme påvirket miRNA bindende, vi transfektert CRC cellelinjer SW480, HT29 og HCT116 med reporter plasmider som bærer på
2758G
eller
2758A
allel og Mir etterligner eller hemmere (figur 2a). Vi fant ut at, i fravær av MIR etterligner eller hemmere, sammenlignet med
2758A
allel,
2758G
allel utviste redusert luciferasepreparater aktiviteter (
P
0,05) (Figur 2b).
MiR-449a
ligner kunne redusere de relative luciferase aktivitetene til
2758A
allel mens
MIR-449a
hemmere betydelig opp-regulerer de relative luciferase aktivitetene til
2758A
allel i alle tre cellelinjene (
P
0,01 for HT29;
P
0,05 for SW480 og HCT116) (figur 2b). På den annen side,
Mir-34b
ligner ikke klarte å utøve noen merkbar effekt på de relative luciferase aktivitetene til
2758G
allel i disse cellelinjene (data ikke vist). Samlet utgjør disse resultatene viste at
2758G
allel i 3’UTR av
NFκBIA
redusert normalisert luciferase aktivitet sammenlignet med
2758A
allel, sannsynligvis tilsvarende redusert mRNA stabilitet eller translasjonsforskning effekt og at
MIR-449a
har evnen til å binde og delvis fortrenge luciferaseekspresjon via
NFκBIA
3’UTR segment når du bærer
2758A
allelet av
NFκBIA
2758 A . G polymorfisme
(a) en antatt målområde av
MIR-449a og Mir-34b
høyt konservert i
NFκBIA
mRNA 3’UTR. (B) psiCHECK-2 Dual Luciferase Assay i tre cellelinjer: SW480, HT29 og HCT116. Cellene ble transfektert med reporter plasmider alene eller co-transfektert med mikroRNA. Luciferaseekspresjon ble målt 48 timer etter transfeksjon. Luciferase-aktivitet av hver konstruksjon ble normalisert mot den interne kontroll av Renilla luciferase. Kolonner, mener fra tre uavhengige forsøk; barer, SD. *,
P
. 0,05 for alle sammenligninger av hver cellelinje mellom aktivitetene til reporter genkonstruksjoner
Association of
NFκBIA3’UTR
polymorfismer med NFκBIA protein uttrykk
Vi var også interessert i å undersøke om
NFκBIA3’UTR
polymorfismer (
2758A G
) var assosiert med økt eller redusert uttrykk for NFκBIA protein . Vi har samlet 32 paret svulst og peritumoral vev fra ubehandlede CRC pasienter av ulike genotyper. Immunoblotting analyse viste at nivåene av NFκBIA (NFκBIA /β-aktin protein ratio) i peritumoral vev av 12 tilfeller av
2758AA
genotype var 0,80 ± 0,09 og de av 8 tilfeller av
2758AG
genotype var 0,63 ± 0,11, som begge var betydelig høyere enn for de andre 12 tilfeller av
2758GG
genotype (0,47 ± 0,06) (variansanalyse test,
P
G
. De NFκBIA protein ekspresjonsnivåer ble normalisert til den for β-aktin ved å beregne de relative ekspresjonsnivåer. Individuell genotype betegnelse: For 2758A G, baner 1-3, 9-11, 17-20, 25-26, AA genotype (n = 12); baner 4-6,12-14, 21-24, 27-28, GG genotype (n = 12); baner 7-8, 15-16, 29-32, AG genotype (n = 8).
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi assosiasjoner til
NFκB1-94del /insATTG Hotell og
NFκB1IA 2758A G
polymorfismer med risiko for CRC i en sørlig Han kinesiske befolkningen. Vi fant at både
NFkB1-94del /ins ATTG Hotell og
NFkBIA 2758A G
polymorfismer var assosiert med økt risiko for CRC. For
NFkB1 Anmeldelser –
94del /insATTG
polymorfisme, med
-94del /del
som referanse, fant vi at
-94 (ins /ins + del /ins)
genotype ble forbundet med en statistisk signifikant økt risiko for CRC. For
NFKBIA 2758A G
polymorfisme, med
2758 (AA + GA)
som referanse, fant vi også at
2758GG
genotype ble forbundet med en statistisk betydelig økt risiko for CRC. Videre, når vi evaluert
NFkB1 Hotell og
NFKBIA
polymorfismer i kombinasjon, fant vi at den samlede
2758GG Hotell og
-94ins /ins + del /ins
genotype var assosiert med en betydelig økt risiko for CRC sammenlignet med de uten
2758GG Hotell og
-94ins /ins + del /ins
genotype, og denne økte risikoen var mer uttalt blant yngre enn 60 år, kvinner, aldri drikker, aldri-røykere, personer med en normal BMI og de med familie historie av kreft. I in vitro-undersøkelser, fant vi også at sammenlignet med
2758A
allel,
2758G
variant allel viste signifikant redusert mRNA stabilitet og /eller translasjonsforskning effekt. Videre fant vi at NFkBIA nivåer betydelig høyere i peritumoral vev fra pasienter på
2758AA + AG: genotyper enn de av
2758GG
genotyper, noe som tyder på at
2758A G
polymorfisme er potensielt funksjonell og polymorfisme
2758A G
3’UTR av
NFkBIA
kan påvirke genuttrykk. Så langt vi kjenner til, er dette den første studien å undersøke om
NFkB1 Hotell og
NFkBIA
polymorfisme og deres samlede polymorfisme var assosiert med risiko for CRC.
Det er flere linjer med bevis som støtter våre funn.
NFkB
1 pathways synes å spille en kritisk rolle i flere humane sykdomstilstander ved å regulere transkripsjon av gener som er involvert i immunresponsen, celleproliferasjon og apoptose [13]. Det er blitt vist at endringer av
NFkB
1-ekspresjon spiller en viktig rolle i beskyttelsen av celler fra apoptose [40].
NFkB
1-aktivitet har blitt observert i forskjellige typer av kreft [41], herunder brystkreft [42] og CRC [21], for å bidra til tumor angiogenese og progresjon [43]. Det er også mange eksperimentelle data tyder på at NFκB1 /IKB sti kan delta i tumorcelle invasjon samt [44]. Derfor varianter av
NFκB1 Hotell og
NFκBIA
gener, hvis funksjonell, kunne forventes å ha en effekt på celledød, og dermed kreftutvikling.
Flere forening studier har rapportert at
NFκB1 Hotell og
NFκBIA
polymorfismer er knyttet til utvikling av inflammatoriske og andre sykdommer, inkludert ulcerøs kolitt, Graves «sykdom, og diabetes mellitus, og mottakelighet for tumorer inkludert melanom, blærekreft og CRC i ulike etniske grupper [32], [36], [45], [46], [47], [48].
