Abstract
Er ADAMTSs familien skilles proteinaser Det er da andelen llo protestantiske sving inase DOMAIN med Matrix metalloproteinaser (MMP). Ved å virke på den stort panel av ekstracellulære substrater, styrer de flere cellefunksjoner som Fusion, adhesjon, proliferasjon og migrasjon. Gjennom sine thrombospondin motivene de også ha anti-angiogene egenskaper. Les ADAMTSs undersøkt om rti cipate i kolorektal kreft progresjon og invasjon. Deres rent uttrykk undersøkt både mRNA og proteinnivåer. Ved hjelp av RT-PCR, uttrykk for
ADAMTS-en
,
-4
,
-5 Hotell og
ADAMTS-20
ren anslått i tykktarmssvulster annet stadium av kreft og anatomisk språk og cellelinjer av tre forskjellig aggressivitet. En overekspresjon av ADAMTS-4 og -5 rene observert, spesielt i vevsprøver, mens ADAMTS-1 og -20 PROSTITUERT Funnet å produsere nedregulert. Western blot analyse ytterligere understøttet av RT-PCR-resultater, avslørende i tillegg nedbrytningen av ADAMTS-1 og -20 i kreft. In situ uttrykk og lokalisering av
ADAMTS-en
,
-4
,
-5 Hotell og
-20 ren
også undersøkt ved immunhistokjemisk analyse. Våre data tyder på en positiv korrelasjon mellom
ADAMTS-fire Hotell og
-5
uttrykk og kreft progresjon, i kontrast med de anti-angiogene medlemmer av familien,
ADAMTS-en
og
-20
, som PROSTITUERT funnet å produsere nedregulert. Våre funn støtte oppfatningen at overekspresjon av ADAMTS-4 og ADAMTS-5 i kolorektal kreft kan gi en mulig vil nvasive mekanisme av kreftceller for å degradere proteoglykaner av ECM
Citation:. Filou S, RPE Tinou A, er Kyri i ulou D, D Bounias, Stavropoulos M, Ra viral zoula P, et al. (2015) ADAMTS Expression i tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (3): e0121209. doi: 10,1371 /journal.pone.0121209
Academic Redaktør: Alberto G. Passi, Universitetet i nsubria, ITALIA
mottatt: 01.10.2014; GODKJENT: 02.01.2015; Publisert: 18 mars 2015
Copyright: © 2015 Filou et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og Ressurs er kreditert
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen finansiering eller støtte til Rapporter
konkurrerende interesser. forfatterne har erklært ikke konkurrerer som interesserer eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje mest vanlige diagnostisert kreft og andre ledende årsak til kreft dødsfall i USA [1] og Europa, så vel. Selv CRC er ncidence, i økonomisk utviklede land, er stabilisert eller snarere avvist [2] Det er fortsatt brukeren et spørsmål for større forståelse av biologi av angiogenese og invasjon med sikte på oppdagelsen av antiangiogenic /anti-israelske nvasive molekyler. Akkumulere e vidence demonstrerer avgjørende rolle proteolytiske enzymer som Matrix metalloproteinaser (MMP) og nært beslektede ADAMTSs (en disintegrinproteinet og har en llo protestantisk sving inase med thrombospondin motiv) i kreft progresjon og utvikling [3]. Er den distinkte ADAMTS gruppen av sink-avhengige metalloproteinaser og vise høye kvens likhetstrekk med familien til slange reprolysin venomases. Den komplette menneskelige ADAMTS familie består av 19 gener [4] (ADAMTS-5 og ADAMTS-11 har samme Gene), og selv om de er løselige proteiner, mange av dem ser ut til å binde den ekstracellulære matrise gjennom sine thrombospondin motiver eller deres spacer Region [5 -7]. ADAMTS har varierende funksjoner, inkludert Clementine Spesifikk Avage av Matrix proteoglykaner aggrecan, versican og brevican (ADAMTS-1, -4, -5, -8 og -15) [7-9], hemming av angiogenese (ADAMTS-1, -8 ) [8-12] og kollagen behandling (ADAMTS-2, -3 og -14) [13].
ADAMTS-1 og -8 anses å produsere anti-angiogene faktorer, årsaken fødselen av samspillet mellom deres thrombospondin motiver og CD36, en reseptor membran glykoprotein av endoteliale celler [11, 12]. Disse proteaser har blitt vist å inhibere VEGF-indusert angiogenese i chorioallantoic membran (CAM) assay [10] og undertrykke FGF-2-indusert vaskularisering i hornhinnen lomme analysen. Men ADAMTS-en skal produsere en mer ansett som lecule med anti eller protestantisk-metastatiske virkninger avhengig av Clementine Avage området, i løpet av sin Auto-proteolytiske Clementine Avage [14]. ADAMTS-8, virker også til å inhibere epidermal vekstfaktor-reseptor signal sammen med reduserte nivåer av fosforylert MEK og ERK [15]. Videre har 12q12 locus of Gene ADAMTS-20 er funnet å produsere lagt trans og andre endringer i menneskelige maligniteter [16-19] og også flere patologiske tilstander, inkludert Parkinsons sykdom [20].
Det er vell av e vidence demonstrere ADAMTS som er deregulert i kreft hos mennesker. Faktisk har tidligere undersøkelser vist at ADAMTS-20 er overuttrykt i hjernen og brystcarsinomer tyder på dette protestantiske tease Det kunne spille en rolle i tumorprogresjon. For ADAMTS-1 er det blitt vist at overekspresjon av full-lengde-isoformen øker tumorvekst og fremmer lungemetastasering av TA3 mammary Celler eller Lewis-lungeceller, mens det har blitt funnet minsket i ikke-småcellet lungekarsinom, pankreatiske tumorer og prostata cancer-cellelinjer [21, 22]. Det har også blitt vist at ADAMTS-1, -5, -9, -12, -15 og -18 Gene promotere er hypermethylated i tykktarms- og endetarmskreft, noe som tyder på nedsatt ekspresjon av disse enzymene i denne stat [23]. I tillegg Begge ADAMTS-15 og -18 gener gjennomgå hyppige mutasjoner i kolorektal kreft celler, men ingen e vidence har ennå presentert av sin effekt i uttrykk eller funksjon av enzymer. I kontrast er ADAMTS-4 og -5 oppregulert i glioblastomas (GBMS), med mulig rolle i økt nedbrytning av brevican dermed øke potensialet nvasive [24, 25]. Økt versican, som kan produsere Relatert til ADAMTS modulerte uttrykk, er også observert i canine colonic adenomer og karsinomer [26]. Ikke decorin Versican men akkumulering er relatert til malignitet i mammographically oppdaget høy tetthet og ondartede-vises microcalcifications i ikke-palpable brystcarsinomer [27].
For å få ytterligere innsikt i hvorvidt det er sannsynlig for uttrykt versican å produsere degradert av ADAMTS som kreft i nvasive mekanisme, les undersøkt ADAMTS-1, -4 og -5 uttrykk i Sunn og kreft kolon vev og også i tykktarm kreft cellelinjer forskjellige metastatisk potensial. Siden målet med denne studien ren for å avsløre potensielle mål for utvikling av nye anti-ikke den eneste nvasive men også anti-angiogene terapier, den ADAMTS antiangiogene undergruppe rent uttrykk også beregnet. I tillegg, siden ADAMTS-en antiangiogen effekt mediert av sine thrombospondin motivene [11] og ADAMTS-20 inneholder 14 ganger i det, også beregnet de totale cellulære nivåer i neoplastiske og sunn kolon.
Materialer og Metoder
Material
Rabbit polyklonale antistoffer, ab28284 (mot N-terminale enden av ADAMTS-1), ab84792 (mot C-terminale enden av ADAMTS-4), ab41037 (mot rester 600-700 av ADAMTS-5) og ab60148 (mot katalytiske domene av ADAMTS-20) PROSTITUERT kjøpt fra Abcam (Cambridge, UK) og Goat anti-kanin IgG conjucated med o xidase ren fra EMD den llipore Corporation (salon llerica, Massachusetts, USA). Mus anti-tubulin (T9026) og den o xidase konjugert anti-mus IgG (A4416) PROSTITUERT erholdt fra Sigma-Aldrich Inc. (St. Luis, USA). Expose mus og kanin Spesifikk HRP /DAB IHC Detection Kit (ab94710) ren fra Abcam. Total RNA hentet fra ren frosset vev og dyrkede celler ved hjelp av NucleoSpin MACHEREY-NAGEL (Düren, Tyskland) utvinning kit, etter produsentens protokoll. RT-PCR ren hentet fra Takara (Otsu, Shiga, Japan) Ett skritt RT-PCR kit, som brukes til frisk tykktarm vev og fra Takara PrimeScript en
st cDNA syntese kit og Finnzymes (Espoo, Finland) DyNAzyme II DNA i lymerase sett som brukes for dyrkede celler. Menneske Primere for alle prostituert designet molekyler i laboratoriet, ved hjelp av PerlPrimer Program. Alle andre kjemikalier som brukes gjennom hele studien PROSTITUERT av det beste av det viral ilable Analytical klasse.
Studier på
Cells
cellekulturer.
Caco-2, DLD-en og HT-29 tykktarm kreft cellelinjer PROSTITUERT kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Aggressivitet av cellelinjene er lavere i Caco-2 celler og høyere i HT-29 celler. DLD-1 og HT-29 celler PROSTITUERT dyrket i RPMI 1640 medium med 2 mm L-glu Tamine og supplert med 10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvat, 4,5 g /l glukose, 1,5 g /l natriumbikarbonat og 10% føtalt bovint serum (FBS), Når det er nødvendig, som anbefalt av ATCC. Caco-2-celler PROSTITUERT dyrket i Eagles Minimum Essential-medium med Earles BSS og 2 mm L-glu Tamine (EMEM) og supplert med 1,0 mm natriumpyruvat, 0,1 mm ikke-essensielle aminosyrer, 1,5 g /l natriumbikarbonat og 20% føtalt bovint serum Når nødvendig, som også anbefalt av ATCC. Prostituert celler dyrket ved 37 ° C, 5% THE
2 og 100% luftfuktighet.
cellelyse.
pellets fra dyrkede celler behandlet med en prostituert ppro priate lysis buffer, som inneholder 25 mm Hepes, 150 mM NaCl og 5 mM EDTA i 10% glyserol og 1% Triton X-100. Ekstraksjoner PROSTITUERT utført i 30 minutter ved 0 ° C under virvling i 4 sekunder hvert 10 min, med tilstedeværelse av fosfotyrosyl høre sphatase hemmer Na
3VO
4 (50 mm) og av de følgende protestantiske tease-inhibitorer: aprotinin (1250 mg /ml), Pefablock (1000mg /ml), Leupeptin (10mm), etter sentrifugering i 10 000 rpm i 5 min.
studier på humane prøver
Pasient.
den prostituerte kreft kolon vev oppnådd fra pasienter (38 pasienter, gjennomsnittsalder: 73, aldersgruppe: 50-81), som gjennomgikk kirurgisk operasjon på grunn av tykktarmskreft. Er pasientene av scenen (Duke), tretten pasienter med stadium B, tolv pasienter i stadium C og fire pasienter med stadium D PROSTITUERT inkludert i denne studien. Pasientene inkludert i studien av andre gratis PROSTITUERT Sykdom og led aldri før noen av sykdom. Sunn kolon vev (N = 6) PROSTITUERT også inkludert i vår studie. Denne studien design hadde blitt godkjent av etisk komité ved University Hospital of Patras, Hellas og ren Skriftlig informert samtykke innhentes fra alle pasienter som kommer inn i studien.
Sekvensiell ekstraksjon av ekstracellulære og celle-tilknyttede komponenter fra vev.
innsamlede normale og kreft kolon vev PROSTITUERT terninger og sekvensielt ekstrahert med 10 Vols av 10 mm dinatriumfosfat, 0,14 M NaCl, pH 7,4 (PBS), 4 M Butterfly sin nidine hydro klorid (GdnHCl) – 0,05 M natrium til Cetate pH 5,8 og 4 M GdnHCl M-0,05 M natrium-acetat, 1% Triton X-100, for å oppnå det oppløselige og det membranbundne former av ADAMTSs. Ekstraksjoner PROSTITUERT utført i 24 timer ved 4 ° C under forsiktig risting, med tilstedeværelse av følgende protestantiske turn inase-inhibitorer: ε-amino-n-kapronsyre (0,1 M), PMSF (0,4 mm), N-e thylma imidet (10 mM), dinatrium EDTA (10mm) og fødsel er midine-HCl (5 mM). Ekstraktene PROSTITUERT samlet og lagret ved -20 ° C inntil bruk [28-30]. Utvinningen protokollen ren utformet på en slik måte å spille parate ADAMTS eksisterte i frie former i vev og bør produsere hentet i PBS (en SSO initiativet forhold), fra ADAMTS i samspill med andre ekstracellulære makromolekyler som bør gi hentet i 4M GdnHCl (di sso initiativ forhold) og fra ADAMTS eksisterende i cellemembraner som bør gi hentet spesielt i GdnHCl 4M-1% Triton X-100.
Immunohistochemistry.
Immunohistochemistry (IHC) ren utført på 5 mikrometer seksjoner kuttet fra formalinfiksert, parafin-innleiret blokker som tidligere beskrevet [29] under anvendelse av primære polyklonale antistoffer mot ADAMTS-1, -4, -5 og -20 fortynnet 1: 6250, 1: 2000, 1: 650 og 1: 6250 henholdsvis, i TBS inneholdende 1 % (w /v) BSA. Den oppnådde antigenantistoffkomplekser PROSTITUERT visualisert ved inkubasjon med geit anti-kanin HRP er njugate og flekker ren utviklet med DAB /hydrogenperoksid av IHC Kit (Abcam) Ifølge produsentens instruksjoner. Endelig seksjoner PROSTITUERT kontra med hematoksylin. En positiv farging ren mottok Ifølge hele intensiteten av hver og en av seksjonene.
Western blot-analyser
Omtrent 20 ug protein, kvantifisert ved anvendelse av Bradford-analyse (Bio-Rad), fra vev og celle kulturer ekstrakter, og cellekulturer Media PROSTITUERT utfelles med 5 vol etanol, oppløst i 20 pl Laemmli-prøvebuffer og applisert på den Lya crylamide gelelektroforese (side) på geler av 10% konsentrasjon i crylamide som tidligere beskrevet [28]. Makromolekylene prostituert deretter overført til lyvi nylidene di-fluorid (PVDF) membraner (Immobilon-P, det llipore) ved en konstant strøm på 80 er ved 4 ° C i 20 timer i 0,05 M Tris /HCl, pH 8,3 og membranene PROSTITUERT vasket med 0,14 M NaCl i 0,01 M fosfatbuffer (PBS), pH 7,2, inneholdende 0,1% (v /v) Tween-20 (PBS-T). Etter blokkering med 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS-T, membranene prostituert neddykket i oppløsning antistoff mot enten ADAMTS-1, -4, -5 eller -20 fortynnet 1: 5000, 1: 500, 1: 250 og 1: 5000 henholdsvis, i PBS inneholdende 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS-T, og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Etter gjentatte vaskinger med PBS-T, membranene prostituert inkubert med passende sekundært antistoff fortynnet 1: 10.000 i PBS-1% BSA, ble inkubert i 1 time ved romtemperatur og vasket med PBS-T. Den immunologisk band PROSTITUERT visualisert ved økt oppmerksomhet til kontaktene scence metode (ECL) (Amersham, UK), i henhold til produsentens instruksjoner og via e Xposure til Agfa Curix X-ray film, i tiden varierte fra 1 til 30 minutter, avhengig av eksperimentet.
RNA ekstraksjon og RT-PCR-analyser
Ferske kolon vev pROSTITUERT pulverisert i flytende nitrogen og dyrket som prostituert Celler som utsettes for Total RNA ekstraksjon ved hjelp av NucleoSpin utvinning kit, som beskrevet i produsentens instruksjoner og behandlet med RNase-fri DNase for å fjerne kontaminerende genomisk DNA. For kolon vev, rene tråd cDNA syntetisert fra 80 ng Total RNA i 50 ul reaksjonskomponentene for ett-trinns RT-PCR kit, i henhold til produsentens instruksjoner. Denne reaksjonsblanding inneholdt i tillegg av 1 uM og følelse av ntisense primere vist i tabell 1. Den forsterkning ren utført i en GeneAmp 2400 thermal cycler (Perkin-Elmer Co.), og reaksjonsprofilen som brukes for alle primere sett ren: 95 ° C i 10 minutter for aktivering av DNA i lymerase og inaktivering av revers TRANSLATION_LANGUAGE nscriptase og deretter 25-35 sykluser, avhengig av Analysis, ved 94 ° C i 30 sek, 52-58 ° C, avhengig av primersett i 1 minutt og 72 ° C i 1 min for å Phi forlengelse ring. For cellekulturer, To-trinns RT-PCR ren anvendt og den første cDNA ren syntetisert fra 1 mikrogram total RNA i 20 mL reaksjonskomponentene for PrimeScript en
st cDNA syntese kit, ved hjelp av tilfeldige 6mers, i henhold til produsentens instruksjoner. Da 100 ng av forsterkede cDNA prostituert i 50 pl reaksjonskomponentene for DNA i lymerase kit. Denne reaksjonsblanding inneholdt i tillegg 0,5 uM av den forstand og ntisense primerne vist i tabell 1. Den forsterkning ren utført i en GeneAmp 2400 thermal cycler (Perkin-Elmer Co.), og reaksjonsprofilen som brukes for alle primere sett ren: 95 ° C i 2 minutter, 94 ° C i 30 sek, 52-58 ° C, avhengig av primersett i 1 minutt og 72 ° C i 1 min for å Phi-ringutvidelse og ren gjentas i 25-35 sykluser, avhengig av analysen. De reaksjonsprodukter PROSTITUERT separert ved elektroforese i 2% (vekt /volum) av garose Gelstar Flekke geler inneholdende vitamin ikke Murphy de amplifiserte cDNA-fragmenter under UV. Den gels PROSTITUERT deretter skannet og bandene prostituert analysert densitometrically. Qu av Antioch av- speiler forskjeller mellom prostituert normalisert cDNA prøvene ved å inkludere GAPDH i alle forsøk.
Statistical Analysis
Normalitet for distribusjon av rene verdier testet med Kolmogorov-Smirnov test. Resultater PROSTITUERT statistisk analysert ved hjelp av uparet t-test for å påvise forskjeller mellom gruppene.
P ≤0.05
ren ansett som statistisk signifikant.
Resultater
ADAMTSs uttrykk i tykktarmskreft cellelinjer
RT-PCR-analyser.
for å være NVE stigate mulig implikasjon av ADAMTSs i CRC, lese undersøkt deres uttrykk ved RNA og protein nivå i tre kolon kreft cellelinjer. Resultatene er angitt i det RNA nivå, ADAMTS-en expression ren litt avhengig av kreftcelle aggressivitet; det rene Ikke funnet å gi uttrykt i Caco-2, mens det viste lav ekspresjon i DLD-1, som økte noe i ren HT-29 celler. Videre, i HT-29 celler dyrket i nærvær av serum, ADAMTS-1-ekspresjonen ren Funnet forhøyet (fig. 1). Tvert imot, høye nivåer av ADAMTS-4-RNA PROSTITUERT Tre Funnet i alle cellelinjer. Imidlertid ADAMTS-4 Funnet ren uttrykk for å produsere en økt aggressivitet i relatert måte, spesielt når celler dyrket i fravær av serum. Dessuten, med unntak av DLD-1-celler, økt ekspresjon av ADAMTS-4 ren observerte PROSTITUERT Når celler dyrket i nærvær av serum (Fig. 1c). Som vist på fig. 1E, ingen ADAMTS-5 Funnet rent uttrykk i Caco-2 celler, mens det rene hovedsakelig observert i HT-29 celler. I motsetning, ADAMTS-1 og -4, til ADAMTS-5 Funnet ren ekspresjon produserer nedregulert i celler dyrket i nærvær av serum. A Different uttrykk mønster observert for rene ADAMTS-20. Som vist på fig. 1G, i DLD-1 og HT-29-celler, rene Funnet å produsere uttrykt bare når dyrket i fravær av serum. Men serum nærvær ikke synes å samløpet ADAMTS-20 uttrykk i Caco-2 celler.
Semi-qu av Antiokia av kvalitativ RT-PCR analyse av (A) ADAMTS-1, (C) ADAMTS-4 (E) ADAMTS-5 og (G) ADAMTS-20 i dyrkede celler (hvit /sort-kolonne, tilstedeværelse /fravær av serum). Verdier er GAPDH-normalisert gjennomsnitt ± standardavvik (B) ADAMTS-1 (D) og ADAMTS-4 (F) ADAMTS-5-protein i cellefordeling og i ekstrakter fra celler dyrket medier. (S
+/-: nærvær /fravær av serum) *
P
≤0.05; Statistisk signifikante forskjeller sammenlignet med celler dyrket i nærvær av serum. **
P
≤0.05; statistisk signifikante forskjeller i forhold til Caco-2 celler, ***
P
≤0.05; statistisk signifikante forskjeller i forhold til DLD-1 celler. Til sammenligning, i celle tubulin immunoidentification ekstrakter ren inkludert i B, D og F.
Western Blot analyser.
ADAMTS-1 oppdaget radioaktiv dating i ren form DLD-en og HT- 29 cellelinjer, som bandet på 80 kDa i celleekstrakter, mens bare fragmenter av ADAMTS-1 av 35 kDa PROSTITUERT detekteres i Media (fig. 1b), uavhengig av tilstedeværelsen av serum. Disse fragmentene kunne produsere produkter av enten autocatalytically bearbeidede ADAMTS-1 eller katalytisk behandlede ADAMTS-1 av MMPs. Gitt det faktum at slike fragmenter oppdaget PROSTITUERT ikke bare ekstra- og intra cellulært, er de mer mulig som følge av MMP aktivitet. I Caco-2-cellelinjer etter at denne er ren erte llo protestantisk kun detektert i nærvær av serum på samme molekylære form som i andre Begge cellelinjer (Fig. 1b). En ytterligere bånd på 65 kDa ble observert i de rene ekstrakter av DLD-1 celler dyrket i fravær av serum.
ADAMTS-4 detektert radioaktiv De ren form ved DLD-1 og HT-29 cellelinjer og i nærvær ikke av eller serum, som bandet på 90 kDa, intra- og ekstracellulært (fig. 1d). I tilfelle av Caco-2 celler, den 90-kDa bånd ren Kun påvist i celleekstrakter, mens i celle Media en ekstra i nm av en radioaktiv dating band av 50 kDa ren observert, sannsynligvis som en følge av egne autokatalytisk aktivitet (fig. 1d).
ADAMTS-5 påvist radioaktivt dating ren form som et band av 74 kDa, i alle tre cellelinjer dyrket under alle forhold (fig. 1F). Andre bånd av ulike størrelser, er mindre enn At formen av det radioaktive dateres, PROSTITUERT observert i celleekstrakter av HT-29 og hovedsakelig av Caco-2-celler dyrket i fravær av serum. Interessant er ingen MMU en liten gruppe av noe radioaktivt dating STØRRELSE ren påvist i media av noen av disse cellekulturer. Imidlertid ADAMTS-5 radioaktiv dateres ren form også detektert ekstracellulært, i HT-29 celler dyrket i nærvær av serum og i DLD-1-cellelinjer. Videre, i HT-29 celler dyrket i nærvær av serum, ytterligere bånd av mindre størrelser PROSTITUERT også oppdaget ekstracellulært, noe som tyder på at posttranslational trunkering av enzymet som følge av enten dens egen aktivitet eller autokatalytisk MMP aktivitet.
I kontrast til alle andre ADAMTSs studert, ADAMTS-20 Ikke rent protein påvist i disse tre tykktarm kreft cellelinjer.
in situ uttrykk for ADAMTS-1, -4, -5 og -20 ved IHC
ADAMTS-1, -4, -5 og -20 in situ-ekspresjon og lokalisering Neste ren analysert i colon vevssnitt fra parafininnstøpte blokker, ved hjelp av antistoffene ifølge ppro priate. Sterk farging for ADAMTS-1 ble observert i ren Helsekost tykktarmen, hovedsakelig i muskellagene og i vevet av nnective mellom de to lagene (fig. 2A, Helsekost). I CRC, ADAMTS-1 viste sterkt uttrykk i muskelvev (pilen i Fig. 2A, St. C) og Nedre hovedsakelig cytoplasmisk uttrykk i kreftceller av scenen C prøver. Redusert eller ingen farging for ADAMTS-1 observert i ren muskel vevsprøver fra trinn B (fig. 2A, St. B) og i andre stadier av prøver (C og D), henholdsvis. Farging for ADAMTS-4 i sunt vev tykktarm observert i de rene To lag muscularis externa og ikke i BMU cosae (fig. 3A, Helsekost). Tidlig kreft i etapper, stadier og B, ADAMTS-4 viste en lignende uttrykk mønster å ADAMTS-1 siden det viste flekker i stroma (pilene i fig. 3A, St., St B) og ganske svakere eller ingen farging i kreft celler (pilspisser i fig. 3A og St. B St., henholdsvis). Men i eksemplarer av C og D etapper, kreftcellene viste clare derable cytoplasma uttrykk for ADAMTS-4 (pilspisser i fig. 3A St. C og D og deres St. innfellinger, henholdsvis). Videre har mindre eller (henholdsvis pilene i fig. 3A og St. St.C D,) ikke ekspresjon av ADAMTS-4 ren stroma observert i prøver av celler i trinn C og D, henholdsvis. Som for ADAMTS-5, Low ganske ren farging observert i lengde lag muskularis Externa i sunn kolon eksemplarer (pil i fig. 3B, Healthy). I CRC, ingen farging for ADAMTS-5 observert enten i ren eller stroma i neoplastiske epitelceller, scene av prøvene (pil og pilspiss i fig. 3B, henholdsvis St.A,), mens uttrykk for ADAMTS-5 ren oppdaget i stroma celler av trinn b prøver (pil i fig. 3B, St. B). Som ADAMTS-4, ADAMTS-5 også utstilt Sterk cytoplasma flekker i kreftceller av scenen C og D prøver (pilspisser i fig. 3B St.C St. og D, henholdsvis) og ingen uttrykk i stromal scenen D. Til slutt, ADAMTS- 20 også utstilt lav flekker i lengde lag muskularis Externa i sunn kolon prøver (fig. 2B, Helsekost), mens i CRC det ren oppdaget Kun i kreftceller av scenen B og hovedsakelig av scenen C prøver (pilspisser i fig. 2B, St. St.B og C, respektivt).
sunt vev colon og colon cancer av trinn B og C, farget for ADAMTS-1 (A) og ADAMTS-20 (B). (A, forstørrelse, x4, anatomisk sted, cecum, forstørrelse, x4, anatomisk sted, cecum, forstørrelse, x4, anatomisk sted, endetarm og B, forstørrelse, x4, anatomisk sted, cecum, forstørrelse, x20, anatomisk sted, cecum, forstørrelse, x20, anatomisk sted, endetarmen). Innfellinger av A og B (alle forstørrelse, x10) viser slimhinnen og ikke bmucosa laget. Piler i Sunn kolon viser uttrykk for ADAMTS i muskelvev. Pilene i kolon kreft viser ekspresjonen av ADAMTS i stroma, mens pilspisser viser ekspresjonen av ADAMTS i kreftceller.
sunt vev colon og colon cancer fra trinn A, B, C og D, for farget ADAMTS-4 (A) og ADAMTS-5 (B). (A, forstørrelse, x4, anatomisk sted, cecum, forstørrelse, x10, anatomisk sted, cecum, forstørrelse, x20, anatomisk sted, cecum, forstørrelse, x4, anatomisk sted, endetarm, forstørrelse, x20, anatomisk sted, endetarm og B, forstørrelse, x4, anatomisk sted, cecum, forstørrelse, x10, anatomisk sted, cecum, forstørrelse, x20, anatomisk sted, cecum, forstørrelse, x4, anatomisk sted, endetarm, forstørrelse, x10, anatomisk sted, endetarmen), farget for ADAMTS- 5. Innfellinger viser i slimhinnene og ikke bmucosa lag på sunn kolon (forstørrelse, x10) og cytoplasmatiske lokalisering av ADAMTS-4 celler av kreft i stadium C og D (forstørrelse, x20 og x40, henholdsvis). Innfellinger viser B i slimhinnene og ikke bmucosa lag på sunn kolon (forstørrelse, x10) og cytoplasmatiske lokalisering av ADAMTS-5 i kreftceller av scenen C (forstørrelse, x20). Piler i Sunn kolon viser uttrykk for ADAMTS i muskelvev. Piler i kreft kolon viser uttrykk for ADAMTS i stroma, mens pilspisser viser uttrykk for ADAMTS i kreftceller.
ADAMTSs uttrykk i tykktarm kreft vev
RT-PCR-analyser.
RNA nivåer av ADAMTSs PROSTITUERT undersøkt i Sunn cecum, sigmoid og endetarm. Av alle undersøkte proteaser, ADAMTS-1 viste det høyeste uttrykk (mer enn dobbelt til Internkontroll-GAPDH), mens ADAMTS-5 den mindre rene protestantiske uttrykt tease (nesten nivå på Zero fighter) (data ikke vist). RT-PCR indikerte analysene at
ADAMTS-en
ren nedregulert i kreft eksemplarer av ethvert trinn i forhold til sunn kolon, med størst de øke til ca 20% i den fasen prøver (fig. 4A). Disse dataene er i samsvar med tidligere studier, der
ADAMTS-en
hadde blitt funnet å produsere nedregulert i mange typer kreft [21, 22]. A Different uttrykk mønster fra
ADAMTS-en
ren observerte for
ADAMTS-4
og-
5
, som PROSTITUERT funnet å gi overexpressed i fase C eksemplarer; nesten 14 ganger og 20 ganger sammenlignet med friske tykktarm vev, henholdsvis (fig. 4C, E). Disse data prostituert i overensstemmelse med tidligere studier i andre typer kreft, Hvor ADAMTS-4 og -5 hadde blitt funnet å produsere over-uttrykt for å degradere ECM proteoglykaner, som agreecan og versican å spre litate kreftcelle invasjon [24, 25 ]. Etter samme eksperimentelle protestantiske måten for
ADAMTS-20
, det rene Funnet forhøyet i trinn A og B-prøvene sammenlignet med friskt vev med 50% og 100%, henholdsvis, men i stadium C eksemplarer det utstilt en de øke til 20% (fig. 4G).
Semi-qu av Antiokia av kvalitativ RT-PCR analyse av (a) ADAMTS-1, (C) ADAMTS-4 (E) ADAMTS-5 og (G) ADAMTS-20. Verdier er GAPDH-normalisert gjennomsnitt ± standardavvik Protein fordeling av (B) ADAMTS-1 (D) ADAMTS-4, (F) og ADAMTS-5 (H) ADAMTS-20. *
P
≤0.05; statistisk signifikante forskjeller sammenlignet med friske vev. **
P
≤0.05; statistisk signifikante forskjeller i forhold til scenen A. ***
P
≤0.05; statistisk signifikante forskjeller i forhold til scenen B. Sunn cecum, Are sigmoid kolon og rektum vev vist;
C-
: Dukes CRC etapper. Piler ndicate av massemigrasjon av molekylære markører. PBS, GdnHCl og Triton Er sekvensiell utpakking brukes Solutions (Tekst jevnere).
Western Blot analyser.
ADAMTS-4, -5 og -20 PROSTITUERT oppdaget i cecum, sigmoid og endetarm, mens ADAMTS-en ren oppdaget Bare i sigmoid og cecum. Men skilte de i sin extractability avslørende Ulike typer interaksjoner og /eller lokalisering av disse enzymene i tykktarmen vev.
ADAMTS-1 Bare ren oppdaget i PBS og GdnHCl /Triton Sunn Ekstrakter av sigmoid og cecum, som båndet på 120 kDa og 11 kDa henholdsvis, som representerer den latente formen av enzymet, og fullførte produkter av syntese, mens ingen av ekstrakter inneholdt den radioaktive dateres formen (80 kDa) av enzymet. (Fig. 4b). ADAMTS-en latent ren form også påvist i kreft cecum fra trinn B, ved hjelp av Creative di sso at forholdene viser det interaksjon med ECM-komponenter, for eksempel TIMP-3 eller A2- makroglobulin, noe som opprettholdt enzymet i sin inaktivert form. I rektum for kreft stadium det rene C detektert i GdnHCl som Ekstrakter av den 35 kDa-fragmentet, muligens som følge av MMP-aktivitet (Fig. 4b). Figur A Different ren hentet fra sigmoid, Hvor ADAMTS-en ren Ikke påvist i noen stadium kreft. Dermed kan den produsere hevdet at ADAMTS-1 Rolle i CRC avhenger i stor grad på den anatomiske området.
Til Fortsett, den latente form av ADAMTS-4 ren påvist i Triton Ekstrakter av alle Tre av anatomiske nettsteder sunn kolon som et band av 110 kDa. Men i PBS og GdnHCl Ekstrakter av Både cecum og endetarmen, den radioaktive dateres formen av enzymet (90 kDa) og flere fragmenter med forskjellige molekylstørrelser og to forskjellige fragmenter av 60 kDa og 70 kDa PROSTITUERT henholdsvis detektert, (fig. 4D). Tvert imot, ADAMTS-4 ren påvist i trinn B og C eksemplarer som er hovedsakelig i sin form radioaktiv dateres. I trinn B cecum prøver, den radioaktive dateres formen av enzymet ren påvist i PBS og GdnHCl ekstrakter, mens i trinn C rektum prøvene, med unntak av den radioaktive dateres form som ren Funnet i PBS ekstrakter, et ytterligere bånd på 110 kDa, som tilsvarer dens latent form , ren også påvist i alle Tre ekstrakter.
følge samme eksperimentelle protestantiske prosedyren, observerte ADAMTS-5 radioaktivt dating i ren form og PBS GdnHCl Sunn ekstrakter av tykktarmen, men også av alle kreft stadier, men med scene-Related økt immunoreaktivitets (fig. 4F).
til slutt, western blot analyse viste tilstedeværelse av latent form av ADAMTS-20 (161 kDa) i PBS og GdnHCl ekstrakter av de anatomiske Tre nettsteder av friskt vev, som sigmoid som inneholder de laveste beløp. Interessant er det også ren detektert kreft i alle trinn, men med forskjeller i dens ekstraherbarhet og i de molekylære former. I stadium sigmoid prøver, det latent form av enzymet påvist i rene PBS Ekstrakter, noe som indikerer at det eksisterte heller fritt i det vev. ADAMTS-20 fragmenter påvist i PROSTITUERT GdnHCl og GdnHCl /Triton Ekstrakter (Fig. 4H). Ekstrakter av GdnHCl i stadium B cecum eksemplarer, den eneste 60-kDa fragment av ren oppnådd, mens i PBS og Gdn-HCl ekstrakter av scenen C endetarm prøver, en ekstra mindre 50 kDa fragment av ren oppnådd.
Diskusjoner
Samler e vidence av ADAMTSs innblanding i menneskelige kreftformer har vist sin betydelige rolle i tumorprogresjon [21, 24, 25]. Over-ekspresjonen av disse proteaser er i samsvar med kravene i karsinomceller for å fjerne proteoglykaner fra ECM, slik som aggrecan og versican, som et supplerende mekanisme for nedbrytning av kollagen ved kollagenase og gelatinaser. Følgelig har økt ekspresjon av versican blitt observert i neoplastiske sykdommer i kolon og rektum [26, 30]. Tilleggs vesentlig informasjon ville gi studien i ADAMTSs uttrykk i CRC, siden potensialet nedbrytning av versican ville resultere i radioaktivt dating versican fragmenter med etablerte roller i tumorprogresjon [14]. På den annen side er det enkelte medlemmer av familien ADAMTSs, som er rapportert å ha potensiell anti-angiogene rolle, har blitt brakt til taushet epigenetiske Funnet i forskjellige typer kreft, inkludert CRC [12]. I denne studien var mulig modulering av ADAMTS-1, -4, -5 og -20 distribusjon og uttrykk i tykktarmskreft sammenlignet med ren sunn kolon undersøkt.
