Abstract
Bakgrunn
Et stort antall humane tumorassosierte antigener som er anerkjent av CD8
+ T celler i en human leukocytt antigen klasse I (HLA-I) – begrenset mote har blitt identifisert. Spesielle AT-rik sekvens bindende protein 1 (SATB1) blir høyt uttrykt i mange typer humane cancere som en del av deres neoplastiske fenotype, og oppregulering av SATB1 ekspresjon er nødvendig for tumor overlevelse og metastase, således dette proteinet kan tjene som en rasjonell målet for kreftvaksiner.
metodikk /hovedfunnene
Twelve SATB1-peptider ble spådd av en immun-informatikk tilnærming basert på HLA-A * 02 bindende motiv. Disse peptidene ble undersøkt for deres evne til å indusere peptid-spesifikke T-celle-responser i perifere mononukleære blodceller (PBMC) erholdt fra HLA-A * 02
+ friske donorer og /eller HLA-A * 02
+ kreftpasienter . Erkjennelsen av HLA-A * 02
+ SATB1-uttrykke kreftceller ble også testet. Blant de tolv SATB1-avledede peptider, SATB1
565-574 ofte indusert peptid-spesifikke T-celle-responser i PBMC fra både friske donorer og kreftpasienter. Viktigere, SATB1
565-574-spesifikke T-celler anerkjent og drept HLA-A * 02
+ SATB1
+ kreftceller i en HLA-I-begrenset måte.
Konklusjoner /Betydning
Vi har identifisert en ny HLA-A * 02 begrenset SATB1-avledede peptid-epitop som gjenkjennes av CD8
+ -T-celler, som i sin tur gjenkjenner og dreper HLA-A * 02
+ SATB1
+ tumorceller. Den SATB1-avledede epitop identifisert kan bli anvendt som en diagnostisk markør, så vel som et immun mål for utvikling av kreftvaksiner
relasjon:. Wang M, Yin B, Matsueda S, Deng L, Li Y, Zhao W , et al. (2013) Identifisering av Spesial AT-Rich Sequence Binding Protein en som Novel Tumor Antigen Anerkjent av CD8
+ T celler: Implikasjon for Cancer Immunterapi. PLoS ONE 8 (2): e56730. doi: 10,1371 /journal.pone.0056730
Redaktør: Silke Appel, Universitetet i Bergen, Norge
mottatt: 26 oktober 2012; Godkjent: 14 januar 2013; Publisert: 21 februar 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra National Cancer Institute, National Institutes of Health and Cancer Research Institute og The Methodist Hospital Research Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
en av de mest lovende fremgangsmåter i cancerterapi er avhengig av å utnytte immunsystemet for å fjerne maligne celler, [1], hvor vellykket som baserer seg i stor grad på identifikasjon av egnede tumor-assosierte antigener (TAA) for å generere effektiv kreftvaksiner. Det har blitt godt etablert at tumorceller uttrykker TAA som kan gjenkjennes av CD8
+ T-celler i forbindelse med human leukocytt-antigen klasse I (HLA-I) molekyler. Et stort antall TAA og TAA-avledede epitoper er blitt identifisert [2], [3], med noen av disse proteiner og peptidderivater som allerede er i kliniske vaksineforsøk. Nye godkjenninger for immunterapi basert vaksine /narkotika sipuleucel-T (Provenge) og ipilimumab (Yervoy) av Food and Drug Administration (FDA) representerer milepæler innen kreft immunterapi [4], [5]. Og en klinisk fase III studie av gp100 peptid for melanom også gitt svært oppmuntrende resultater [6]. I tillegg arbeider fra to uavhengige grupper understreket viktigheten av tumorspesifikke antigener i fremlokkende immunresponser mot en utvikling av svulst [7], [8], utvilsomt ytterligere intensivere arbeidet med å søke etter nye tumorantigener for kreft immunterapi.
til tross for slike lovende resultater, suksess i vaksineforsøk kreft i det hele har vært sporadisk [9] – [11]. I løpet av de siste par årene har flere TAA som er uttrykt i ulike typer av neoplasia blitt identifisert [2], [3]. Men de fleste av antigenene som er beskrevet så langt er unnværlig for overlevelse og vekst av tumorcellene, med unntak av noen få TAA så som telomerase [12], Survivin [13] og anti-apoptotiske medlemmer av Bcl-2- familien (Bcl-2, Bcl-X (L) og Mcl-2) [14]. Tumorceller kan derfor ha unnsluppet overvåking av immunsystemet gjennom tap og /eller nedregulering av tumorantigener [15]. Følgelig er rettet mot TAA som er essensielle for overlevelsen og veksten av kreftceller kan bedre forhindre immunoselection av antigen-tap varianter som et resultat av vaksinasjon og forbedre effektiviteten av cancer immunoterapi [15], [16]. Slike immunogene tumorantigener som lokke fram minimal immun flukt representerer derfor de mest optimale vaksinekandidater for immunterapi av kreft.
Spesial AT-rik sekvens bindende protein 1 (SATB1) er en nukleær faktor som fungerer som en global kromatin arrangør. Den regulerer genuttrykk ved å brette kromatin til sløyfe domener, og tethering DNA-domener til SATB1 nettstruktur [17]. SATB1 syntes å være overuttrykt i aggressive brystkreftcellelinjer, men fraværende eller ikke påvisbar i normale og udødeliggjorte humane mammary epitelceller, hvilket antyder en rolle SATB1 i omprogrammering kromatin organisasjon og til slutt transkripsjonelle profiler av bryst-tumorer for å fremme vekst og metastase [18] . I tillegg ble høyere nivåer av SATB1 uttrykk forbundet med mange andre typer kreft, inkludert laryngeal plateepitelkarsinom [19], endometrioid livmorkreft [20], leverkreft [21], endetarmskreft [22], kutant malignt melanom [23 ], magekreft [24], [25], eggstokk-kreft [26], prostatakreft [27], lungecancer [28] og gliom [29]. Oppregulering av SATB1 i disse typer kreft kan fremme tumorvekst og metastasering. Siden SATB1 er essensielt for tumorvekst /overlevelse og metastase, immun flukt med tap eller nedregulering av SATB1 uttrykk kan redusere vedvarende tumorcellevekst og /eller metastase, og dermed gjøre SATB1 et attraktivt mål for antikreftvaksiner mot ulike typer av kreft som uttrykker SATB1.
i denne rapporten beskriver vi identifikasjon av SATB1-avledet T-celle epitoper for T-celle anerkjennelse ved hjelp av en immun-bioinformatikk tilnærming. Vi valgte tolv peptider som ble forutsagt å binde seg til HLA-A * 02 molekyl. De ble syntetisert og evaluert
in vitro
for deres evne til å stimulere T-celler i PBMC fra friske individer og /eller kreftpasienter basert på interferon-γ (IFN-γ) frigivelse. En av disse peptidene, SATB1
565-574, ble funnet å indusere IFN-γ frigivelse i perifere T-celler fra både friske forsøkspersoner og kreftpasienter. Viktigere, SATB1
565-574-spesifikke T-celler var i stand til å gjenkjenne og drepe HLA-A * 02
+, SATB1-uttrykker tumorceller i en HLA-I-avhengig måte. Disse resultatene viser gyldigheten av immuno-bioinformatikk tilnærming og foreslå SATB1
565-574 kan representere en ny svulst-spesifikke epitop for kreft immunterapi.
Materialer og metoder
friske donorer og kreft~~POS=TRUNC pasienter~~POS=HEADCOMP
HLA-A * 02
+ prostata eller eggstokkreft kreftpasienter og ti HLA-A * 02
+ friske personer ble rekruttert i studien etter skriftlig informert samtykke ble innhentet. Alle protokoller ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) ved Baylor College of Medicine før du starter studiene. 20 ml perifert blod ble oppnådd fra hver enkelt person, og perifert blod mononukleære celler (PBMC) ble isolert ved tetthetsgradient sentrifugering ved anvendelse Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norge). Nyisolerte PBMC ble oppbevart for senere bruk i en mL iskaldt medium inneholdende 90% FCS og 10% dimetylsulfoksid (DMSO) ved -140 ° C. HLA-A * 02 uttrykk i PBMC hentet fra kreftpasienter og friske personer ble bekreftet ved flowcytometri med FITC-merket HLA-A * 02 mAb BB7.2 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA).
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Alle brystkreftcellelinjer (MCF-7, CAMA-en, MDA-MB-134VI, MDA-MB-175VII, MDA-MB-361, DU4475, MDA-MB-231, MDA -MB-436, MDA-MB-453, MDA-MB-468), T2-celler (et HLA-A * 02
+ TAP-manglende cellelinje), prostata cancer-cellelinjer (PC3, LNCaP og DU145), ovarian cancer cellelinje OVCAR-3 og lymfom cellelinje Jeko-1 ble ervervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). En eggstokkreft cellelinje Skov-1 [30], [31] var en gave fra Dr. Kunle Odunsi (Roswell Park Cancer Institute, NY, USA); en lymfom cellelinje L1236 [32], [33] var en gave fra Dr. Catherine M. Bollard (Baylor College of Medicine, Houston, USA). Alle cellelinjer ble holdt i RPMI-1640 medium (Mediatech, Manassas, VA, USA), supplert med 10% FBS, 1% L-glutamin og 1% penicillin og streptomycin
Peptides
tolv SATB1-peptider (tabell 1) ble beregnet med BIMAS (https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), SYFPEITHI (https://www.syfpeithi.de/), og Rankpep (https://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) basert på HLA-A * 02 bindende motiv. Epitoper som ble forutsagt av i det minste to av disse algoritmene ble valgt for videre testing. Peptidene ble syntetisert ved en fast-fase-metoden ved anvendelse av en peptid-synthesizer (AApptec, Inc .; Louisville, KY, USA), ble renset ved reversfase væskekromatografi og validert ved massespektrometri. De syntetiserte peptider ble løst i DMSO ved en konsentrasjon på 10 mg /ml og lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse. En peptid (SATB1
544-552) ble ekskludert fra studien på grunn av vanskelighetene med peptidsyntese.
In vitro
Stimulering av Peptide-spesifikke T-celler i PBMC
PBMC (1 x 10
5-celler /brønn) enten fra friske individer eller kreftpasienter ble inkubert med standard peptid-konsentrasjoner på 20 pg /mL per peptid [34] – [37] i 96-brønners U-bunn mikroplater (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) i 200 ul av T-celle-medium (TCM), bestående av RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA, USA), 10% humant AB-serum (dalen Biomedical, Winchester , USA), 50 uM 2-merkaptoetanol, 100 IU /ml interleukin-2 (IL-2), og 0,1 mM MEM ikke-essensiell aminosyre-løsning (Invitrogen, grand Island, NY, USA). Halvparten av TCM ble fjernet og erstattet med frisk TCM inneholdende peptider (20 ug /ml) hver 5 dag. Etter 14 dagers dyrkning ble cellene høstet og testet for deres evne til å produsere IFN-γ svar på T2-celler (1 x 10
4 celler /brønn), som var forhåndslastet med enten SATB1 peptid (5 ug /mL) eller et kontroll peptid (et irrelevant HLA-A * 02 binding EBV-peptid: GLCTLVAML) som en negativ kontroll. Etter 18 timers inkubering ble supernatanter oppsamlet, og IFN-γ frigivelse ble bestemt ved hjelp av ELISA-analyse.
Rapid Expansion Protocol (REP) for SATB1 peptid-spesifikke T-celler
SATB1 peptid-spesifikk T-celler ble ekspandert ved en rask ekspansjon protokoll (REP) som tidligere beskrevet [38] med en svak modifikasjon. I korthet på dag 0, 0,1-0,5 x 10
6 SATB1 peptid-spesifikke T-celler ble dyrket i en T25-kolbe med 20 ml RPMI-1640 supplementert med 10% humant AB-serum, 50 uM 2-merkaptoetanol, 30 ng /ml OKT3 antistoff (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ, USA) og 30 ng /ml anti-CD28 antistoff (R St. Louis, Missouri, USA) ble tilsatt per brønn. Den kolorimetriske Reaksjonen ble stanset ved hjelp av 2N H
2SO4 og platene ble avlest ved 450 nm ved hjelp av en ELISA-plateleser.
RNA Utvinning og RT-PCR
RNA ekstraksjon og RT-PCR var utført som tidligere rapportert [39]. I korte trekk, ble total RNA ekstrahert fra kreftceller med 1 ml Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Tre mikrogram RNA ble revers-transkribert til cDNA i 30 ul volum og 1 ul av hver cDNA ble anvendt i påfølgende PCR-reaksjon med et par av SATB1 spesifikke primere: Primer 1:5′-TGCAAAGGTTGCAGCAACCAAAAGC-3 «; 5»-AACATGGATAATGTGGGGCGGCCT-3 «. GAPDH ble brukt som lasting kontroll: primer 1:5»-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3 «; Primer 2:5»-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3 «. PCR-reaksjonen ble utført under de følgende betingelser: 95 ° C i 1 min, 95 ° C i 40 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 40 s, totalt 40 sykluser, 72 ° C i 5 minutter, og GAPDH ble kjørt i 25 sykluser. Like mengder PCR produktene ble deretter lastet og oppdaget ved gel elektroforese.
Western Blot
Hele celle ekstrakter ble utarbeidet og vedtatt i SDS-PAGE-geler. Proteinene ble overført til PVDF membran (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) og videre inkubert med SATB1 antistoff (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). LumiGlo Chemiluminescent Substrate System fra KPL (Gaithersburg, MD, USA) ble anvendt for proteindeteksjon.
FACS analyse
Celler (0,5 x 10
6) ble farget med enten FITC-anti -CD8, PE-Cy5-anti-CD4 (Både fra eBioscience, San Diego, CA, USA) eller FITC-anti-HLA-A * 02 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) i PBS inneholder 2% FBS på is i 30 min, og deretter vasket to ganger i PBS. Etterpå ble cellene resuspendert i 500 ul PBS og analysert ved hjelp av et FACSCalibur maskin. For DimerX HLA-A * 02: Ig flekker, SATB1 reaktiv CD8
+ T-celler ble inkubert med renset HLA-A * 02: Ig dimer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) lastet med et gitt peptid, og deretter farget med FITC anti-mus IgG1 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Flow-cytometri ble utført på et FACSCalibur maskin.
Cvtotoksisitetsmålinq
SATB1-avledet peptid-spesifikke T-celler ble testet for cytotoksisitet mot peptid-lastet T2 celler, to HLA-A * 02
+ SATB1
+ cancercellelinjer (Skov-1 og Jeko-1) og et HLA-A * 02 negativ SATB1
+ PC3-cellelinje som en negativ kontroll ved en laktat dehydrogenase (LDH) assay (Promega; Madison, WI, USA). Analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. LDH utgivelsen ble beregnet basert på følgende formel:.
Cytotoksisitet (%) = (Experimental – Effector Spontan – Target Spontan LDH release) /(Target Maximum – Target Spontan LDH release) × 100
Spontan frigjøring ble bestemt ved hjelp av supernatanten av målcellene alene eller effektorceller alene, og den maksimale meldingen ble bestemt ved hjelp av supernatanten av målceller inkubert med en lyseløsning inkludert i LDH kit.
Statistikk
t-test ble anvendt for å analysere kvantitative forskjeller mellom de eksperimentelle brønnene og kontroller i ELISA-analyser. P 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
SATB1 mRNA uttrykkes i en rekke kreftformer
For å undersøke om SATB1 er uttrykt i kreftceller, mRNA uttrykk for SATB1 i. ulike typer av tumorceller ble utført ved RT-PCR. Som vist i figur 1, ble SATB1 mRNA sterkt uttrykt i en rekke krefttyper, inkludert brystkreft, eggstokk-kreft, prostatakreft, samt lymfom. Mens normal prostata epitelcellelinje, gjorde PNT1A ikke uttrykke SATB1 mRNA.
mRNA-ekspresjon for SATB1 i forskjellige cellelinjer ble bestemt ved RT-PCR. De brystkreft cellelinjer (MCF-7, CAMA-en, MDA-MB-134VI, MDA-MB-175VII, MDA-MB-361, DU4475, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB- 453 og MDA-MB-468), prostatakreft (PC) cellelinjer (PC3, LNCaP og DU145), eggstokk-kreft (OC) cellelinjer (OVCAR-3 og Skov-1), lymfom cellelinjer (Jeko-1 og L1236 ) og en normal prostata epitelcellelinje PNT1A ble inkludert som en kontroll. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Induksjon av SATB1-avledet Peptide CTL hos friske donorer
Først vi innhentet PBMC fra 10 HLA-A * 02
+ friske donorer for å avgjøre om SATB1-reaktive T-celle forløpere var til stede i disse friske personer. Cellene ble stimulert
in vitro
for to uker med hver av de SATB1-avledede peptider inneholdende HLA-A * 02-bindingsmotiv (tabell 1). Ved slutten av peptidet stimulering, ble supernatanter fra kulturene analysert ved hjelp av ELISA for å påvise IFN-γ frigivelse som reaksjon på T2-celler pulsert med eller uten tilsvarende peptider. Som vist i tabell 2, nesten alt av de 11 SATB1-avledede peptider (10/11) var i stand til å indusere peptid-spesifikke T-celle-responser i det minste i en av de friske forsøkspersoner. Spesielt peptidet SATB1
565-574 induserte høyere nivå av IFN-γ frigivelse (mer enn 900 pg /mL) i 4 av 10 friske forsøkspersoner, som angir høy immunogenisitet og potensial i å utvide antigen-spesifikke T-celler i friske personer.
tilstedeværelse av SATB1-avledet peptide CTL hos kreftpasienter
Vår analyse indikerte at peptid-spesifikke T-celler mot SATB1
565-574 ble funnet i ~ 60% av friske personer, vi derfor begrunnet at CTL forløpere som kan gjenkjenne dette peptid kanskje også rikelig i PBMC fra kreftpasienter. For å teste vår hypotese, undersøkte vi om peptid SATB1
565-574 kan indusere peptid CTL fra PBMC av HLA-A * 02
+ eggstokkreft pasienter. PBMC fra tre HLA-A * 02
+ eggstokkreft pasienter ble samlet og stimulert
in vitro
med peptid SATB1
565-574. Som vist i tabell 3, peptid SATB1
565-574 var i stand til å indusere peptid-spesifikke CTL fra PBMC i ovarier kreftpasienter, som indikerer at peptidet er sterkt immunogent, ikke bare i friske individer, men også i kreftpasienter. Vi har også bestemt om dette peptid kandidaten kan indusere peptid CTL fra PBMC av HLA-A * 02
+ prostatakreftpasienter. Som tilfellet var med eggstokkreft kreftpasienter, peptid SATB1
565-574 tilsvar indusert peptid CTL fra PBMC av 5 prostatakreftpasienter i tillegg (tabell 3), noe som indikerer CTL forløpere som gjenkjenner dette peptidet er rikelig i PBMC fra kreft pasienter.
SATB1-avledet Peptide Induced CD8
+ T-celleavhengige Responses
For ytterligere å analysere SATB1
565-574 peptid-spesifikke T-celler, vi neste ekspanderte SATB1
565-574 peptid-spesifikke T-celler er identifisert i tabell 2 og 3 for å oppnå et tilstrekkelig antall av disse cellene. For å oppnå dette, utførte vi peptid titrering eksperimenter for å bestemme den optimale peptidkonsentrasjonen for lasting T2 celler for T-celle-gjenkjennelse. Som vist i figur 2A, kan T2 celler sensibilisert ved peptid SATB1
565-574, men ikke en kontroll EBV-peptid for T-celle-gjenkjenning i en konsentrasjon på 0,08 ug /ml, og bindingsstedene for HLA-A * 02 molekyler på T2-celler ble mettet ved 5 ug /ml. Ytterligere økning av konsentrasjonene av SATB1
565-574 mislyktes i å øke produksjon av IFN-γ. Derfor har vi konsekvent brukt peptidet konsentrasjon på 5 pg /mL for forbelastning av T2-celler i våre ELISA-analyser. De ekspanderte T-cellene opprettholdt antigen-spesifisitet og sekreterte betydelige mengder av IFN-γ etter stimulering med T2-celler pulsert med de tilsvarende peptidene, men ikke med en styre EBV peptid (figurene 2A og B). For å oppnå direkte bevis på delsett av responderende T-celler som er avbildet i figur 2B, ble de ekspanderte SATB1 peptid-reaktive PBMC utarmet for enten CD4
+ T-celler (figur 2C) eller CD8
+ T-celler (figur 2D ) før inkubering med peptider for ELISA-analyser. Som vist i figur 2E, CD8
+ T-celler, ikke CD4
+ T-celler (figur 2F), oppnådd fra ekspanderte PBMC svarte på SATB1
565-574 pulsede T2-celler, noe som indikerer at T-cellerespons indusert av SATB1
565-574 var avhengig av CD8
+ T-celler. Videre dimerX HLA-A * 02: Ig farging (figur 2G og H) og IFN-γ intracellulær farging (figur S1) viste også at SATB1
565-574 indusert peptid spesifikke, HLA-A * 02 begrenset CD8
+ T-celleavhengige responser.
indusert CD8
+ T-celleavhengige responser. Erkjennelsen av T2 celler forhåndslastet med titrerte konsentrasjoner av peptider (0-20 mikrogram /ml) ved utvidet SATB1
565-574-spesifikke T-celler fra frisk donor # 1 ble testet ved ELISA-analysen (A). Den utvidede SATB1-reaktive PBMC (B) var co-inkubert med T2 celler (1 x 10
4 celler /brønn) alene i fullstendig medium (CM), eller med T2 celler forhåndsinstallert med enten SATB1
565 -574 (5 ug /ml) eller et kontroll EBV peptid som en negativ kontroll. Cellene ble inkubert i 18-24 timer, ble IFN-γ sekresjon i supernatanten bestemt ved ELISA-analyse. SATB1-reaktive PBMC-utarmet av CD4
+ T-celler (C) og SATB1-reaktive PBMC-utarmet av CD8
+ T-celler (D) ble verifisert ved strømningscytometri. De anerkjennelser av T2-celler pulsert med SATB1
565-574 av SATB1-reaktive PBMC utarmet av enten CD4
+ T-celler (E) eller CD8
+ T-celler (F) ble bestemt ved ELISA. SATB1 reaktive CD8
+ T-celler ble inkubert med rensede HLA-A2: Ig dimer lastet med et styrings EBV peptid (G) eller med peptidet SATB1
565-574 (H), og så farget med FITC-anti-mus IgG1. Celler ble analysert under anvendelse av et FACSCalibur maskin. Data (fra A, B, E og F) er plottet som middel ± SD. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001 versus kontroller (T2 celler alene eller T2 celler pulsert med en kontroll EBV peptid).
Anerkjennelse og Killing av kreftceller ved SATB1-avledet Peptide spesifikke CD8
+ T celler i en HLA-i Restricted Manner
Basert på våre resultater så langt, SATB1
565-574 bestemt CD8
+ T-celler ble brukt i senere eksperimenter. For å avgjøre om SATB1-avledet peptid-spesifikke T-celler var i stand til å gjenkjenne og drepe HLA-A * 02
+, SATB1-uttrykke kreftceller, brukte vi en HLA-A * 02
– SATB1 mRNA positiv prostatakreft cellelinjen PC3 (som en negativ kontroll) og fem HLA-A * 02
+ SATB1 mRNA-positive cancercellelinjer. Ekspresjonen av SATB1 mRNA i disse 6 cellelinjer ble tidligere undersøkt ved hjelp av RT-PCR (figur 1) og HLA-A * 02 ekspresjon ble bekreftet ved flowcytometri (figur 3A). I tillegg har vi også sjekket uttrykk for SATB1 protein blant disse cellelinjer (figur 3B), og fant ut at alle kreftcellelinjer uttrykte SATB1 protein unntatt PC3 og ovčar-3. Derfor, OVCAR-3, ble også betraktet som en negativ kontroll. Som vist i figur 4A, SATB1
565-574-spesifikke T-celler kunne gjenkjenne HLA-A * 02
+ SATB1 som uttrykker Skov-1 og Jeko-1-celler, men ikke PC3 eller OVCAR-3-celler. De andre to HLA-A * 02
+ SATB1 uttrykkende kreftcellelinjer (CAMA-1, MDA-MB-231) ble først skal skje når de ble forbehandlet med IFN-γ (figur 4B), som antyder at enten forbedret HLA-A * 02 ekspresjon på celleoverflatene (Figur S2), eller induksjonen av immunoproteasomes av IFN-γ, kan lette presentasjonen av riktig epitopen til celleoverflater for T-celle-gransking. I kontrast, kan normale celler, inkludert PNT1A og autologe PBMC, ikke gjenkjennes av SATB1
565-574-spesifikke T-celler (figur 4A). I tillegg SATB1
565-574-spesifikke T-celler gjenkjenner ikke in vitro-differensiert Th undergrupper, inkludert Th1, Th2 og Th17 celler (Figur S3).
(A) Cellene ble farget med FITC -anti-HLA-A * 02 i PBS inneholdende 2% FBS. Deretter ble cellene vasket og resuspendert i PBS og analysert ved hjelp av et FACSCalibur maskin. (B) Ekspresjon av SATB1 protein i forskjellige tumorceller, ble bestemt ved western blot. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting.
(A) SATB1
565-574-spesifikke T-celler fra frisk donor # 1 ble dyrket alene, i medium eller ko-inkubert med forskjellige typer av tumor celler samt normale celler (PNT1A og PBMC); (B) Tumorceller ble forbehandlet med eller uten IFN-γ (10 ng /ml) i 48 timer før inkubering med SATB1
565-574-spesifikke T-celler. SATB1
565-574-spesifikke T-celler ble dyrket i medium alene som en negativ kontroll (rød kolonne); For å blokkere HLA-avhengige responser, enten anti-HLA-I-mAb (W6 /32) eller HLA-II-mAb ble tilsatt til cellekulturer i løpet av inkubasjon av SATB1
565-574-spesifikke T-celler med Skov-1 (C) eller Jeko-1-celler (d). Celler ble inkubert i 18 -24 timer, ble IFN-γ sekresjon i supernatanten bestemt ved ELISA-analyse. SATB1
565-574-spesifikke CD8
+ T-celler ble testet for cytotoksisitet mot T2-celler pulsert med eller uten peptider (E), Skov-1 (F) og Jeko-1 (G) ved LDH analysen. HLA-A * 02 negative PC3-celler ble anvendt som en negativ kontroll i LDH-analysen. Data fra A-G er plottet som gjennomsnitt ± SD. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,001 versus kontroller
for å avgjøre om anerkjennelse av kreftceller ved SATB1
565-574 spesifikke CD8
+ T-celler var HLA-i begrenset, vi co-dyrkede SATB1
565-574-spesifikke T-celler med enten Skov- 1 eller Jeko-1 celler i nærvær av enten anti-HLA-i-mAb (W6 /32) eller anti-HLA-II mAb. Som vist på figur 4C og D, ble T-celle-responser inhiberes fullstendig ved tilsetning av anti-HLA-I mAb, men ikke anti-HLA-II (HLA-DP-mAb), noe som antyder at gjenkjennelse av tumorceller ved SATB1
565-574 spesifikke CD8
+ T-celler er HLA-i begrenset.
for ytterligere å undersøke om SATB1
565-574 spesifikke CD8
+ T-celler var i stand til å drepe HLA-A * 02
+, SATB1-uttrykke kreftceller, utførte vi cytotoksisitetsassayer. Som vist i figur 4E, SATB1
565-574-spesifikke T-celler som ble avlivet T2-celler pulsert med SATB1
565-574, men ikke T2 celler alene eller de pulset med en kontroll EBV peptid. Viktigere, SATB1
565-574-spesifikke T-celler var i stand til å drepe HLA-A * 02
+, SATB1 uttrykker Skov-en og Jeko-1 celler, men ikke HLA-A * 02
– PC3 celler (figur 4F og G). Disse resultatene tyder på at SATB1
565-574-spesifikke T-celler gjenkjenner en T-celle epitop som er endogent bearbeidet og presentert av kreftceller.
Diskusjoner
Det er godt etablert at CD8
+ T-celler spiller en avgjørende rolle i å kontrollere tumorutvikling og progresjon. Peptide epitoper avledet fra TAA kan gjenkjennes som antigener av T-celler i sammenheng med MHC-I-molekyler [40], [41]. Identifisering av ideelle TAA og deres peptider som gjenkjennes av T-celler er avgjørende for utviklingen av effektive kreftvaksiner. Ideell TAA som anti-apoptotiske proteiner [14], telomerase [12] og survivin [13], som er obligatorisk for tumorvekst /overlevelse, kan representere optimale mål for vaksine mediert immunterapi av kreft. SATB1 er sterkt uttrykt i mange typer kreft hos mennesker og oppregulering av SATB1 uttrykk er avgjørende for svulst overlevelse og metastase, og dermed SATB1 representerer en av slike ideelle TAA.
Hensikten med denne studien var å identifisere HLA -En * 02 bindende SATB1-avledet epitoper gjenkjent av CD8
+ T-celler i PBMC av friske og kreftpasienter. Tolv SATB1-peptider ble beregnet med BIMAS, SYFPEITHI, og Rankpep basert på HLA-A * 02 bindende motiv. Peptider som ble forutsagt ved minst to av tre programmer som ble valgt for ytterligere testing av deres evne til å stimulere PBMC fra friske individer og /eller kreftpasienter. Videre undersøkelser viste at 10 av 11 syntetiserte SATB1-avledede peptider var i stand til å indusere peptid-spesifikke T-celle-responser i det minste i en av 10 friske forsøkspersoner. Nærmere bestemt, SATB1
565-574 ble funnet å indusere høyere nivå av IFN-γ frigivelse (mer enn 900 pg /mL) i 4 av 10 friske forsøkspersoner, som indikerer at dette peptid kan være immunogen og potensielt i stand til å utvide antigen spesifikke T-celler hos friske personer. Videre SATB1
565-574 indusert ofte spesifikke T-celleresponser i PBMC-of ovarian cancer pasienter så vel som i PBMC fra prostata kreftpasienter. Viktigere, SATB1
565-574 peptid-spesifikke T-celler gjenkjennes og drept HLA-A * 02
+ SATB1-uttrykk Jeko-1, Skov-1-celler, så vel som IFN-y-behandlede brystcancercellelinjer ( CAMA-en og MDA-MB-231), noe som tyder på dette peptid er naturlig behandlet av kreftceller.
SATB1 er en global kromatin arrangør og transkripsjonsfaktor og har dukket opp som en nøkkelfaktor integrere høyere orden kromatin arkitektur med genregulering [42]. SATB1 fremmer tumorvekst og metastase ved å omprogrammere kromatin organisering og transkripsjonsprofiler, og er sterkt uttrykt i en rekke krefttyper, inkludert brystkreft [18], laryngeal karsinomer [19], endometrioid endometrial cancer [20], hepatocellulært karsinom [21] , endetarmskreft [22], kutant malignt melanom [23], magekreft [24], [25], eggstokkreft [26], prostata kreft [27], lungekreft [28] og gliom [29]. I kreftceller med høye nivåer av SATB1, gener som fremmer tumorprogresjon og metastase ble oppregulert, mens gener som hemmer tumor metastase ble undertrykt [17]; mens kneble av SATB1 sterkt redusert invasiv og metastatisk kapasitet på kreftceller [43].
