Abstract
Utviklings gener er brakt til taushet i embryonale stamceller ved en bivalent histon-baserte kromatin mark. Det har blitt foreslått at dette merket gir også en predisposisjon for avvikende DNA arrangøren hypermethylation av tumorsuppressorgener (TSGs) i kreft. Vi rapporterer her at stanse av en betydelig andel av disse TSGs i humane embryonale og voksne stamceller er forbundet med promotor-DNA hypermethylation. Våre resultater tyder på en rolle for DNA-metylering ved regulering av gen-ekspresjon i humane stamceller og tyder på at, for gener trykt ved promoter hypermethylation på stamceller
in vivo
, avvikende prosess i kreft kunne forstås som en defekt i å etablere en unmethylated promoter under differensiering, snarere enn som en isolert prosess med
de novo
hypermethylation
Citation. Calvanese V, Horrillo A, Hmadcha A, Suarez-Álvarez B, Fernandez AF Lara E et al. (2008) kreftgener Hypermethylated i humane embryonale stamceller. PLoS ONE 3 (9): e3294. doi: 10,1371 /journal.pone.0003294
Redaktør: Maarten M. S. van Lohuizen, Nederland Cancer Institute, Nederland
mottatt: 30 april 2008; Godkjent: 01.09.2008; Publisert: 29.09.2008
Copyright: © 2008 Calvanese et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet var i hovedsak støttet av den europeiske union (LSHG-CT-2006-018739, ESTOOLS). MFF er finansiert av den spanske Ramon Cajal Program og Helse Institutt for den spanske regjeringen (PI061267). Kreft epigenetikk gruppen ved CNIO er støttet av Helse (FIS01-04) og lærerutdanning og naturvitenskap (I + D + I MCYT08-03, FU2004-02073 /BMC og Consolider MEC09-05) Avdelinger av den spanske regjeringen, EU Grant TRANSFOG LSHC-CT-2004-503438, og den spanske foreningen mot kreft (AECC). VC er en mottaker av en Fellowship fra FPU spanske forskningsprogram. KLL og BSA er støttet av Helse Institutt for den spanske regjeringen (PI051707). Den BACM støttes av Consejería de Salud de la Junta de Andalucía (0029 og 0030/2006 til PM), og det spanske helsedepartementet til PM (FIS PI070026). CB er støttet av Det internasjonale Jose Carreras Foundation mot leukemi (EDThomas-05) og ISCIII (FIS 3 + 3 kontrakt). The Institute of rekonstruktiv nevrobiologi fått ekstra midler fra DFG og Hertie Foundation. BS, ABH og Anh støttes av Fundación Progreso y Salud og Instituto de Salud Carlos III-Red Española de Terapia Celular (RD06 /0010/0025). PWA, NH og HDM er også støttet av MRC
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
I løpet av embryoutvikling. cellene er i utgangspunktet totipotente, men etter et par divisjoner, begynner å miste styrke og blir forvandlet til pluripotente celler, slutt å bli terminalt differensierte somatiske celler. Den progressive tap av styrke i løpet av differensiering har grunnleggende betydning for sykdom fordi utvinning av pluripotency gjennom atom omprogrammering er en av de store utfordringene i regenerativ medisin [1], og fordi forstyrrelse av utviklingsprosessen som gir opphav til et terminalt differensiert somatisk celle fra sin tilsvarende stamceller kan føre til malign transformasjon [2].
differensiering av humane embryoniske stamceller (hESCs) krever undertrykkelse av transkripsjonsfaktorer som er involvert i å opprettholde pluripotency og aktivering av utviklings gener. Begge prosessene er styrt av spesifikke epigenetiske mekanismer. Et eksempel på den første typen er den promoter hypermethylation avhengige undertrykkelse av pluripotency Bevarende gener som Nanog og OCT4 som stamceller differensiere [3]. Så langt, aktivering av utviklings gener under stamcelledifferensiering på DNA metylering har blitt mindre grundig undersøkt. I stedet har disse utviklings genene er rapportert som å være i en undertrykt tilstand under tidlige stadier av utvikling på grunn av etableringen av et bestemt mønster av histon modifikasjon, kalt «toverdige domener», som består av store regioner av H3-lysin 27 metylering husing mindre regioner av H3 lysin 4 metylering [4]. Dette kromatin-undertrykkende status er formidlet ved Polycomb gruppe proteiner [5], [6] og er antatt å disponere til avvikende promotor hypermethylation i kreft [7] – [9]. Den finner at behandling av hESCs med demethylating narkotika 5′-Aza-2′-deoxycytidine forårsaker hjertestans differensiering og genet reaktivering [10] bedt oss om å vurdere om arrangøren DNA metylering kan bidra til etablering og vedlikehold av spesifikt gen undertrykkelse i hESCs . For å etablere dens eksistens og dens antatte forhold med avvikende promotor hypermethylation i kreft, sammenlignet vi promotor-DNA-metylering mønster av et panel på 800 kreft-relaterte gener mellom hESCs og forskjellige typer av terminalt differensierte voksent vev og kreftcellelinjer.
Resultater
Arrangøren DNA metylering profilering i hESCs, normale differensierte vev og kreftprøver
Vi brukte Illumina Golden metylering Arrays © å sammenligne DNA metylering status for 1,505 sekvenser (fra 807 gener) i åtte uavhengig isolerte hESCs linjer, 21 normale humane primære vev (NPTs) som tilsvarer seks normale vevstyper (NTTS) og 21 humane kreftcellelinjer (CCLS) (se Methods). Genene som inngår i metylering matriser ble valgt på basis av deres betydning for cellulær oppførsel og differensiering, og med gener som tidligere er rapportert for å være forskjellig denaturert, samt tumorsuppressorgener onkogener og gener som koder for faktorer involvert i cellesyklus kontrollpunkt [ ,,,0],11]. Vi først valgt ut de autosomale gener (766) fra matriser for å utelukke DNA-metylering-avhengig X-kromosom inaktivert gener. Som tidligere rapportert, uten tilsyn clustering av prøvene utelukkende ved hjelp av metylering signalene for autosomal gener (1,421 sekvenser) som finnes i arrays aktivert riktig klassifisering av hver prøve i den tilsvarende gruppen (hESC, PT, eller CCL) (figur 1A, og se Figur S1 i den elektroniske supplerende data for denne artikkelen), for derved å bekrefte at hver enkelt gruppe av prøver har en spesifikk DNA-metylering signatur [11]. Deretter forsøkte å klassifisere genene i matrisen i forhold til deres metylering status på de tre typer av prøven analysert (hESC, CCL, og PT) (figur 1A, og tabellene 1 og S1). Vi fant at 65,31% (928/1421) av sekvensene ikke ble ofte hypermethylated i hESCs (matrise signal≤0.7 in≥25% (2/8) av prøvene) og at halvparten av dem (464/928) ble ofte hypermethylated i CCLS (rekke signal 0,7 in≥25% (6/21) av prøvene). De aller fleste av disse sekvensene (99,78%, 463/464) var unmethylated i minst ett av de NTTS analysert (matrise signal 0,3 in≥1 /6 NTTS). Dette funnet er i samsvar med det syn at genene abnormt hypermethylated i cancer (dvs. ikke hypermethylated i normalt vev) er ikke hypermethylated i hESCs [8]. Vi kalte dette gruppen av gener som klassisk A-kreft hypermethylated gener (tabell 1 og S1).
(A) metylering profiler av klasse AI (350), A-II (94), BI (20), og B-II (107) gener i hESCs (8), normal (21), og kreft (21) prøver erholdt ved Illumina matriser. De metylering nivåene varierer fra helt denaturert (rød) for å fullt unmethylated (hvit). Den høyre søylene viser metylering status for histon H3 og Polycomb belegg på de samme genene hentet fra tidligere publiserte data [5], [12], [16]. Blå, metylering på K4 og K27; orange, metylering på K4 alene; grønn, ingen metylering ved K4 eller K27; svart, nærvær av Polycomb protein SUZ12. (B) Anriking av Polycomb protein SUZ12, den toverdige kromatin signatur (K4 /K27) eller fravær av begge merkene (ingen) i klasse A og klasse B gener (øvre panel) og klasse I og klasse II gener (nedre panel) .
Betydelig, fant vi at 34,69% (493/1421) av sekvensene ble ofte hypermethylated i hESCs (rekke signal 0,7 in≥25% (2/8) av prøvene ). De fleste av disse (79,72%, 393/493) ble også ofte hypermethylated i CCLS (matrise signal 0,7 in≥25% (6/21)) av prøvene). Igjen, mange av dem (32,32%, 127/393) ble unmethylated i det minste en av de NTTS analysert (matrise signal 0,3 in≥17% (1/6) NTTS) (figur 1, og tabellene 1 og S1). I motsetning til klasse A kreft hypermethylated gener, de av denne gruppen ble også ofte hypermethylated i hESCs, så vi foreslår at de kan betraktes som medlemmer av en annen kategori av kreft metylert gener, som vi har kalt klasse B kreft hypermethylated gener. Av de 697 sekvenser ofte hypermethylated i kreft og unmethylated i minst ett av de NTTS analysert, 444 (66,70%) og 127 (18,22%) henholdsvis ble klassifisert som klasse A og klasse B gener (figur 1 og tabell 1 og S1) , noe som indikerer, mot formodning, at en betydelig andel (rundt 20%) av kreft metylert gener er også ofte hypermethylated i hESCs.
Forbløffende nok ikke alle genene ofte hypermethylated i CCLS var helt unmethylated i hele NTTS analysert (figur 1, og tabellene 1 og S1). Hyppigheten av hypermethylation i normalt vev er bare av moderat betydning for klasse A klassisk kreft metylert gener, som de fleste av dem (78,83%, 350/444 sekvenser) er unmethylated i NPTs. På den annen side er bare 20 sekvenser tilsvarende klasse B-gener var unmethylated i hele NTTS analysert (tabell 1). Når et gen metyleres i noen, men ikke alle normale vev, er det metylering sannsynligvis er involvert i beskrivelsen av en vevstype under utvikling [12]. Når genet er ikke hypermethylated i hESCs, må vev-type-avhengige selektiv metylering forekomme. I motsetning til dette, når genet er ofte hypermethylated i hESCs, er det mest sannsynlig blir selektivt demetyleres ved differensiering som en epigenetisk mekanisme som er i stand til å lette vev spesifikasjonen. Omvendt, når et gen unmethylated i alle normale differensierte celler og hypermethylated i stamceller, er mer sannsynlig å være involvert i tidlige differensieringsprosesser enn i vev spesifikasjon [12] tapet av promoteren metylering som nødvendigvis oppstår under differensiering. Dermed har vi definert to nye underkategorier for både klasse A og B kreft denaturert gener: Under jeg, for gener som alltid unmethylated i normalt vev, og underkategorien II, for gener som er noen ganger metylert i normalt vev (figur 1 og tabell 1 og S1). Prosentandelen av klasse A-II og klasse B-II-gener er ganske lik (7,53% og 6,61%) (tabell 1). Imidlertid er prosentandelen av gener i klasse A-I (24,63%) mye høyere enn det som i klasse B-I (1,41%). Genene i disse fire kategorier (A-I, A-II B-I og B-II) utgjør 58,2% av alle sekvensene som foreligger i metylering matriser. Ved å vurdere den metylering status for de tre grupper av prøver (hESCs, NPTs, og CCLS) vi var i stand til å klynge fleste av de resterende gener i rekken i åtte flere kategorier (tabell 1), som inkluderte, for eksempel, to kategorier av gener som vi definerer som konstitutivt metylert (metylert i hESCs, CCLS, og alle NTTS, 11,19%), henholdsvis gener, eller konstitutivt unmethylated (28.43% unmethylated i hESCs, CCLS, og alle NTTS). Vi foreslår derfor at DNA-metylering er ikke viktig for regulering av genene i disse kategoriene. Klassifiseringen av gener i henhold til deres metylering status i hESCs, CCLS, og NTTS, og tolkningen av den biologiske rolle av DNA-metylering i genene i hver gruppe er oppsummert i tabell 1. Tabell S1 viser de genene i hver gruppe.
det er viktig å merke seg her at alle de ovenfor beskrevne prosentandeler refererer til de 807 gener som inngår i metylering matriser, mens den totale prosentandel av gener i hver gruppe kan være forskjellig hvis hele genomet ble vurdert. Klassifiseringen terskel som vi benyttet for å identifisere gener ofte hypermethylated i hESCs (mer enn 70% av arrangøren CpG metylering i mer enn 25% av prøvene som ble analysert) er det som er vanlig å definere et gen som blir ofte hypermethylated i kreft [13] . For å vurdere om våre observasjoner sanne for snerpende klassifisering terskler vi reexamined våre data på leting etter: i) sekvenser hypermethylated i de fleste av hESCs analysert (matrise signal 0,7 in≥75% (6/8) av hESCs), og ii ) sekvenser «fullt metylerte» i noen av de analyserte hESCs (matrise signal 0,8) in≥25% (2/8) av den hESCs) (tabell S2). Vi fant ut at fem BI og 84 B-II-sekvenser montert det første kriteriet, og 13 BI og 86 B-II-sekvenser montert den andre (tabell S2), noe som indikerer at våre konklusjoner er gyldig selv med disse strengere klassifiserings terskler.
Det har nylig blitt vist at langvarig
in vitro
kultur av hESCs er assosiert med DNA-metylering ustabilitet [14], [15]. For å vurdere om arrangøren hypermethylation av våre klasse B genene er assosiert med
in vitro
kulturprosessen, sammenlignet vi våre data med de som tidligere er publisert av Bibikova
et al.
[11]. Disse forfatterne brukte Golden metylering plattform for å sammenligne metylering status for 1505 CpG nettstedene som finnes i arrays i ti hESC linjer på lave og høye passasjer. De fant at selv om metylering forandringer fant sted med passasje nummer, slike endringer var liten sammenlignet med forskjellene mellom celletyper. De fant fem gener (
ASCL2
,
GALR1
,
MEST
,
NPY, etter og
SLC5A8
) å være konsekvent hypermethylated med passering nummer (økning i metylering nivå 0,34 i minst to cellelinjer (20%)). Tre av disse genene (
ASCL2
,
NPY, etter og
SLC5A8
) er medlemmer av klasse B-I, men interessant, ingen var i klasse B-II-genet. Disse resultatene tyder på at vedvarende
in vitro
kulturen var bare ansvarlig for promoteren hypermethylation av en liten del (3/97, 3%) av våre B-gener, og at effekten viste seg å være større i klasse BI gener.
som tidligere nevnt, har det nylig blitt foreslått at utviklings gener er brakt til taushet i embryonale stamceller ved en Polycomb avhengig bivalent histon-basert kromatin mark [4], [5], som antas å disponere til avvikende DNA arrangøren hypermethylation av TSGs i kreft [7] – [9]. Som vi fant ut at en undergruppe av kreft metylert gener kan også være metylert i hESCs vi ønsket å undersøke forholdet mellom arrangøren hypermethylation og Polycomb avhengige histone modifikasjon mønster i hESCs. For å oppnå dette, sammenlignet vi våre metylering data for den klasse AI, A-II, BI og B-II-gener med de tidligere rapporterte histone modifikasjon profil og Polycomb belegg på de samme genene i embryonale stamceller [5], [12] , [16] (Figur 1 og Tabell S3). I samsvar med en tidligere rapport [9], fant vi at rundt 35% av sekvensene ofte hypermethylated i kreft og unmethylated i minst ett av de NTTS analysert inneholdt kromatin-undertrykkende tegn ved sine arrangører (228-277 /697 næret meK27, og 236/697 inneholdt SUZ12). Forbløffende nok sammenligne våre metylering data med de av Mikkelsen
et al.
[16] observerte vi at de aller fleste (96,4%) av gener som bærer meK27 inneholdt også meK4 og at bare rundt 30% av genene ofte hypermethylated i kreft presenterte toverdige kromatin domene (meK4 /meK27) i hESCs (tabell S3).
Når vi sammenlignet kromatin mønstre og Polycomb belegg i klasse AI, A-II, BI, og B-II-gener vi fant hver gruppe har en bestemt kromatin signatur (p 0,00001). Klasse A gener var mer anriket i Polycomb og toverdige tegn (47,5% og 45,5 til 57,3% av gener, henholdsvis) enn klasse B gener (19,7% og 21,4 til 32,7%, henholdsvis) (p 0,00001) (Figur 1b og tabell S4 ). Berikelse av den toverdige mark i klasse A gener er først og fremst på grunn av de lave nivåer av dette kromatin signatur i klasse B-II-gener (tabell S4). Faktisk, klasse B-I genene viser lignende nivåer av meK4 /meK27 til klasse A gener (tabell S4) (p 0,00001). Interessant, klasse II gener, ble mye sjeldnere okkupert av Polycomb proteiner og utstilt færre toverdige merker (33,3% og 26,5 til 38,8% av gener, henholdsvis) (p 0,00001) enn klasse I gener (45,7% og 47,6 til 59,3 %, henholdsvis) (figur 1B og tabell S4). De lavere nivåer av toverdige mark i klasse II gener var først og fremst på grunn av de lave nivåer av dette kromatin signatur i klasse B-II-gener (tabell S4). Faktisk, klasse A-II gener hadde tilsvarende nivåer av meK4 /meK27 til de av klasse I gener (tabell S4) (p 0,00001).
TSGs trykt av arrangøren hypermethylation i hESCs
Å teste hypoteser formulert på grunnlag av data innhentet fra metylering arrays, fokuserte vi vår oppmerksomhet på fire klasse B gener (ofte hypermethylated i kreft og hESCs) som tidligere allment rapportert å være gener med tumorsupressorproteinene egenskaper og som ofte hypermethylated i kreft. Vi valgte to (MGMT og SLC5A8) [17], [18] fra klasse BI underkategori (unmethylated i alt NTTS) og to (PYCARD og RUNX3) [19], [20] fra klasse B-II (unmethylated i en rekke av NTTS). Vi først ansatt bisulfite sekvensering av flere kloner å fastslå nøyaktig arrangøren DNA metylering status for disse genene i hESCs og normalt vev (Figur 2A, og figurene S2, S3, S4, S5). I alle tilfeller, bisulfitt-sekvenseringsdata bekreftet resultatene oppnådd fra de matriser og viste at hypermethylation observert i hESCs påvirket flertallet av CPGs omgir den transkripsjonelle start-området av utvalgte gener. MGMT og SLC5A8 (klasse BI) present tett promoter hypermethylation i hESCs men ikke i normale differensierte vev (Figur 2A, og figurene S2, S3), mens klasse B-II-gener ble ofte hypermethylated i hESCs og noen ganger i normalt vev (Tall S4, S5 ). For å forstå bedre den rollen i promoter hypermethylation av våre utvalgte TSGs i hESCs og NTTS, brukte vi q-RT-PCR for å måle deres uttrykk i begge utvalgsgrupper (figur 2B, og figurene S2, S3, S4, S5). Vi fant at promoteren hypermethylation ble alltid forbundet med genet undertrykkelse, men dets fravær i somatiske vev primær ikke nødvendigvis innebære oppregulering av genet. For eksempel, mens
SLC5A8
ble hypomethylated i alle normale vev analysert (figur S3A, B), det ble bare overuttrykt i hjerne, lever og tykktarm (figur S3C).
(A ) Bisulfite genomisk sekvensering av flere kloner av MGMT arrangøren i hESCs (I3, H14), normal primære vev (Pool lymfocytter, normal bryst) og to CCLS av lymfoid og bryst opprinnelse (U937 og MDA-MB-231, henholdsvis). Svart, metylert CpG; hvit, unmethylated CpG; rød, CpG ikke til stede. Den grønne bar over diagrammet av MGMT CpG øy indikerer lokaliseringen av sonden som brukes i metylering matriser. (B) Forholdet mellom MGMT promoter hypermethylation og uttrykk i hESC, normal, og kreftprøver. Den øvre panelet viser den relative metylering signal oppnådd med metylering arrays og nedre panel uttrykket nivåer av MGMT mRNA i forhold til GAPDH.
Tap av arrangøren hypermethylation og genaktivering under
in vitro
differensiering av hESCs
for å demonstrere videre at differensiering av hESCs er assosiert med mindre DNA metylering ved promoter-regionen i visse gener, vi indusert
in vitro
differensiering av hESC linje Shef -1 i to celle linjene (fibroblast-lignende celler og nevrale forløpere) (figur 3A). Vi vurderte avstamning spesifikasjon hjelp tidligere publiserte markører [21] (figur 3A, høyre-paneler) og deretter brukt metylering arrays for å identifisere gener som ble hypomethylated under differensiering. Vi fant at 12,98% (37/285) av genene hypermethylated i Shef-en (som ikke ble metylert i hele NTTS analysert) blir unmethylated under
in vitro
differensiering. Av disse 12 gener blir unmethylated under neuron differensiering og 25 under spontan differensiering (tabell S5). Tre av disse genene var felles for begge gruppene (figur 3B) og to av dem tilhørte klasse B-II. Det er spesielt oppmerksom på at, mens 9/25 av genene unmethylated under spontan differensiering var av klasse B-II, ingen av de 12 genene unmethylated under neuron differensiering tilhørte denne kategorien.
(A) Venstre- hånd~~POS=TRUNC bilder, Shef-en stamcellelinje (øvre) og de samme celler etter neural differensiering (i midten) og spontan differensiering til fibroblast-lignende celler (lavere). Den høyre panelene viser de relative mRNA nivåer av pluripotency (Nanog, OCT4), nevroektodermal (Pax6, NEUROD1), og mesodermal (COL1A1, fn1) markører før og etter Shef-en differensiering. (B) Antall sekvenser hypomethylated under Shef-en neural (rød sirkel) og spontan (blå sirkel) differensiering, og deres overlapper med klasse B-I og klasse B-II-gener (svarte sirkler). (C) Bisulfite genomisk sekvensering av flere kloner av DLC1 promoter i Shef-en stamcellelinje (øvre) og de samme celler etter neural differensiering (i midten) og spontan differensiering til fibroblast-lignende celler (lavere). Fargekoden er som for figur 2. (D) Forholdet mellom DLC1 promoter hypermethylation og uttrykk i løpet av differensiering av Shef-1 celler. Den øvre panelet viser den relative metylering signal oppnådd med metylering arrays og nedre panel uttrykket nivåer av DLC1 mRNA i forhold til GAPDH.
For å vise at noen TSGs som ofte hypermethylated i kreft og hESCs kan mister metylering under differensiering, fokuserte vi vår oppmerksomhet på DLC1. Vi valgte dette genet fordi metylering arrays hadde vist at den mistet promoter metylering under spontan differensiering av Shef-1, og fordi den er kjent for å være en TSG som ofte hypermethylated i kreft (figur S6) [22], [23]. Bisulfitt sekvensering av flere kloner bekreftet resultatene oppnådd med de metylering matriser og viste at DLC1 promoteren hypermethylated i Shef-1 og blir unmethylated under spontan, men ikke neural, differensiering (figur 3C). I q-RT-PCR eksperimenter DLC1 var dårlig uttrykt i Shef-en cellelinje og ble overuttrykt under spontan, men ikke neural, differensiering (figur 3D).
TSGs trykt av arrangøren hypermethylation i stamcelle forfedre
Etter å ha vist at enkelte kreftgener hypermethylated og undertrykt i hESCs og at de kan miste metylering under
in vitro
differensiering av hESCs undersøkte vi om dette fenomenet er begrenset til embryoutvikling eller omvendt er et epigenetisk mekanisme forbundet med stemness status uavhengig av ontogenetisk stadium av cellen. Vi brukte metylering arrays for å identifisere gener hypermethylated i CD34 + somatiske stamceller stamceller (figur S7) sammenlignet med perifere blod lymfocytter og nøytrofile, to typer voksne primære celler avledet fra CD34 + hematopoetiske stamceller. Vi identifiserte 362 betydelig hypermethylated sekvenser i CD34 + celler (rekke signal 0,7) (Tabell S6). De aller fleste av disse sekvensene (92,27%, 334/362) ble også metylert i hESCs og de fleste ble ofte hypermethylated i CCLS (83,43%, 302/362) (figur 4A, og tabell S6). Disse resultater antyder at den hypermethylation av kreftgener kan forekomme i stamceller uavhengig av ontogenetisk trinnet (embryo vs. voksen). Vi identifiserte neste ni-sekvenser som var signifikant hypermethylated i CD34 + celler i forhold til perifere lymfocytter, og 16 sekvenser som ble hypermethylated i disse progenitorceller i forhold til neutrofiler (tabell S7). De fleste av sekvensene identifisert ble også ofte hypermethylated i hESCs (8/9 for lymfocytter og 14/16 for nøytrofile) og CCLS (6/9 for lymfocytter og 13/16 for nøytrofile). I tillegg var det ingen sekvenser felles for lymfocytter og nøytrofile og de fleste av dem ble noen ganger hypermethylated i NPTs. Interessant, 28 av disse sekvensene ble tidligere klassifisert som klasse B-II-gener, mens ingen av dem var fra klasse BI (figur 4A).
(A) panel Den venstre viser antall sekvenser som hypermethylated i de somatiske stamceller CD34 +, og hypermethylated i hESCs og CCLS. Merk at de fleste av sekvensene hypermethylated i somatiske stamceller er også hypermethylated i embryonale stamceller. panelet til høyre viser antall sekvenser hypermethylated i CD34 + celler (sort sirkel) klassifisert som klasse B-II-gener (rød sirkel). Sekvenser hypermethylated i CD34 + celler ble aldri klassifisert som klasse B-I genene (blå sirkel). (B) Bisulfite genomisk sekvensering av flere kloner av AIM2 promoter i Shef-en og I3 stamcellelinjer (øvre), CD34 + hematopoetiske stamcellestamfedre (midten), og terminalt differensierte hematopoetiske celler (perifere lymfocytter og nøytrofile). Fargekoden er som for figur 2. (C) Forholdet mellom
AIM2 Hotell og
RUNX3
promoter hypermethylation og uttrykk i CD34 + somatiske stamcelle forfedre og terminalt differensierte hematopoetiske celler (perifere lymfocytter og nøytrofile ). Den øvre panelet viser den relative metylering signal oppnådd med metylering arrays og nedre panel uttrykket nivåer av
AIM2 Hotell og
RUNX3
mRNA i forhold til GAPDH.
til slutt, for å vise at noen kreft metylert gener er også ofte metylert i somatiske stamceller stamceller og at deres metylering er viktig for avstamning spesifikasjon, vurderte vi to gener:
RUNX3 Hotell og
AIM2
. Vi valgte
RUNX3
fordi, i samråd med tidligere publiserte data [24], våre metylering arrays viste at i forhold til CD34 + celler,
RUNX3
ble hypomethylated i perifere lymfocytter, men ikke i perifere nøytrofile.
AIM2
ble valgt fordi det ble tidligere antatt å være en TSG som ofte hypermethylated i kreft (figur S8) [25] og fordi, i motsetning til
RUNX3
, blir det unmethylated spesielt i myeloid avstamning (figur 4B, C). Bisulfitt-sekvenseringsdata bekreftet resultatene oppnådd med de matriser, som viser at CD34 + celler og de perifere lymfocytter ble tett metylert ved promotoren av
AIM2
gen mens de perifere neutrofiler var nesten unmethylated (figur 4B). For å finne ut hvilken rolle arrangøren hypermethylation av
AIM2 Hotell og
RUNX3
i blodkreft differensiering, brukte vi q-RT-PCR for å analysere deres uttrykk i våre grupper av prøver (Figur 4C). Vi fant at arrangøren hypermethylation var alltid forbundet med genet undertrykkelse i både gener og at tap av promoter metylering i
AIM2 Hotell og
RUNX3
i perifere lymfocytter og nøytrofile, henholdsvis, ble forbundet med deres reexpression ( Figur 4C).
Diskusjoner
Aberrant arrangøren hypermethylation av TSGs og differensieringsfaktorer er en sentral epigenetisk endring i kreft [26], [27]. Genene som gjennomgår slike endringer i kreft har blitt rapportert å være undertrykt i hESCs ved etablering av «toverdige kromatin domener» bestående av aktivering (H3 lysin 27 metylering) og undertrykke (H3 lysin 4 metylering) histone merkene som holder dem rustet for aktivering men på samme tid, predisponerer dem for å avvikende promotor hypermethylation hos voksne-kreft [7] – [9]. Heri vi vise at et annet nivå av kompleksitet som finnes der noen av genene ofte abnormt hypermethylated i kreft er også ofte hypermethylated i hESCs. Våre resultater tyder på at, som tidligere foreslått for museceller [28], kan promoter DNA-metylering være en viktig faktor for genregulering i hESCs.
På bakgrunn av metylering status i hESCs vi etablert to kategorier kreft metylert gener: klasse A gener, som ofte unmethylated i hESCs og klasse B gener, som ofte hypermethylated i hESCs. Som vi uventet funnet at en betydelig andel av genene som inngår i begge gruppene ble også ofte hypermethylated i normale differensierte vev, etablerte vi to nye underkategorier av kreft metylert gener: Under jeg, for gener som er mest unmethylated i normalt vev, og underkategori II , for gener som er noen ganger hypermethylated i normale vev. Den biologiske tolkningen av avvikende metylering i klassene A og B kreft denaturert gener og deres to underkategorier er helt annerledes. Klasse A-I-genene er ofte hypermethylated i kreft, men ikke i normalt vev eller hESCs. Disse genene er ikke ment å være regulert av DNA metylering under normal utvikling og dermed hypermethylation i kreft bør alltid tolkes som en avvikende prosess. Klasse A-II gener er ofte metylert i CCLS og noen ganger i normalt vev, men sjelden i hESCs. Metylering av disse genene kan være viktige for avstamning spesifikasjon og bør vurderes avvikende i kreft når det skjer i en tumortype i hvis tilsvarende normalt vev det er ikke hypermethylated. Klasse BI gener (unntatt
ASCL2
,
NPY, etter og
SLC5A8
gener, hvis arrangøren DNA hypermethylation i hESC linjer kan være grunn til
in vitro
kulturprosessen [11]) er ofte hypermethylated i hESCs og kreftcellelinjer, men ikke i normale vev, noe som antyder at tapet av metylering ved promotorene av disse genene kan være en viktig innflytelse på tapet av pluripotency under utvikling. Deres hypermethylation i kreft bør alltid vurderes som avvikende. Klasse B-II-gener er ofte hypermethylated i hESCs og kreftceller, men, da de er også noen ganger metylert i normalt vev, kan deres hypermethylation i kreft bare betraktes som avvikende i tumortyper i som ved normal motstykker de er helt unmethylated. Bortsett fra dette, er det faktum at ikke alle genene ofte hypermethylated i kreft var helt unmethylated i alle normale vev analysert er et svært viktig funn i kreft epigenetikk [26] fordi arrangøren hypermethylation av et gen i en bestemt tumortype bør ikke være
