Abstract
Samler bevis indikerer at microRNAs (mirnas) er avvikende uttrykt i menneskelig kreft og bidra til tumorigenesis, men deres roller i kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt i stor grad ukjent. I denne studien våre data viste at Mir-130b ble betydelig nedregulert i 52 par med kreft i bukspyttkjertelen vev og fem cellelinjer. Videre ble det deregulerte MIR-130b korrelert med dårligere prognose, økt tumorstørrelse, sent TNM stadium, lymfatisk invasjon og fjernmetastaser. Multivariat analyse viste at Mir-130b uttrykk var en betydelig og uavhengig prognostisk prediktor for kreft i bukspyttkjertelen pasienter. Funksjonelle studier indikerte at overekspresjon av MIR-130b dramatisk undertrykkes spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler både in vitro og in vivo, som kunne tilskrives den induksjon av apoptose og cellesyklus-stans i S-fasen. I mellomtiden, en overuttrykt MIR-130b bemerkelsesverdig hemmet invasiv evne til kreft i bukspyttkjertelen celler. Videre er den doble luciferase-analysen viste at STAT3 er direkte rettet av MIR-130b, som ble ytterligere bekreftet ved det inverse uttrykk for MIR-130b og STAT3 i kreft i bukspyttkjertelen prøver. Våre funn antydet at Mir-130b kan ha et betydelig potensial i prognose identifisering og anvendelse av behandling for kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Zhao G, Zhang Jg, Shi Y, Qin Q, Liu Y, Wang B, et al. (2013) MiR-130b er en prognostisk markør og hemmer celleproliferasjon og invasjon i bukspyttkjertelkreft gjennom målretting STAT3. PLoS ONE 8 (9): e73803. doi: 10,1371 /journal.pone.0073803
Redaktør: Johannes Haybaeck, Medical University Graz, Østerrike
mottatt: Per 31. desember 2012; Godkjent: 24 juli 2013; Publisert: 10.09.2013
Copyright: © 2013 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Science Foundation Committee (NSFC) Kina (tilskuddsordninger tall 30972900 og 30600594). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs er endogene ikke-kodende RNA som består av ca 22 nukleotider. MicroRNAs kan negativt regulere genekspresjon ved å binde seg til delvis komplementære sekvenser i det spesifikke mål-mRNA 3′-utranslatert region (UTR), noe som kan resultere i enten mRNA degradering eller translasjon inhibering [1]. Emerging bevis indikerer at mirnas er avvikende uttrykk i ulike typer svulster og delta i menneskelig tumorigenesis og /eller metastase ved direkte rettet mot onkogener eller tumorsuppressorgener [2] – [4].
Kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest dødelige kreftformer. Bare 10-20% av pasientene diagnostisert med kreft i bukspyttkjertelen er resectable og samlet sin 5-års overlevelse er bare 5% på grunn av sin høye tilbakefall til tross for multimodalitet behandlinger [5], [6]. Som andre kreftformer, utvikling av kreft i bukspyttkjertelen er en flertrinnsprosess med opphopning av genetiske og epigenetiske endringer. Endrede miRNA uttrykk, for eksempel MIR-34a, MIR-21 og MIR-20a, har blitt identifisert som modulatorer av cellevekst, apoptose, migrasjon eller invasjon i bukspyttkjertelkreft [7] – [9]. Derfor blir mer omfattende undersøkelser trengs på rollen miRNAs, som er deregulert i kreft i bukspyttkjertelen for å belyse funksjon av miRNAs i bukspyttkjertelkreft.
Microarray studier har identifisert en rekke microRNAs som ble deregulert i bukspyttkjertelen kreft, inklusive miRNA-130b [10] – [12]. Til dags dato har MIR-130b er funnet å være deregulert i enkelte typer kreft, inkludert å være overuttrykt i magekreft [13], [14], gliom [15] og nyrecellekreft [16], mens blir nedregulert i livmorkreft [ ,,,0],17] og papillær thyroideakarsinom [18]. Imidlertid har ingen spesifikke studier er gjennomført for å avdekke hvilken rolle MIR-130b i bukspyttkjertelkreft. Derfor ble vår studie forsøkte å identifisere rollen MIR-130b i bukspyttkjertelkreft. I denne studien ble uttrykket av MIR-130b mellom kreft i bukspyttkjertelen og normal tilstøtende bukspyttkjertelen vev analysert. Videre ble det spredning og invasivitet evaluert i PANC-en og ASPC-1 celler etter å ha blitt tilført med MIR-130b.
Vår forskning videre identifisert potensial direkte mål der Mir-130b utøves sin funksjon på bukspyttkjertelen kreftceller. Den mikroRNA prediksjon programvare indikerte at signalet svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) kan være nedstrøms målet for MIR-130b. STAT3 er en nøkkel cytoplasmisk transkripsjonsfaktor som blir aktivert av tyrosin kinase vekst og cytokinreseptorer. STAT3 spiller en viktig rolle i å mediere en rekke biologiske prosesser, inkludert: celle proliferasjon, apoptose og differensiering [19]. STAT3 har blitt identifisert som en nøkkel onkogen faktor i et antall av maligniteter og er nødvendig for onkogenese i huden og gastriske cancere [20], [21]. I kreft i bukspyttkjertelen, aktivering av STAT3 fremmet tumorcellevekst og invasjon, noe som førte til dårlig pasient overlevelse [22]. Videre STAT3 knockdown hemmet cellevekst og invasivitet i bukspyttkjertelkreft både
in vitro Hotell og
in vivo
, og markert redusert VEGF og MMP-2 uttrykk [23], [24]. Derfor ble den doble luciferase assay brukes til å identifisere om STAT3 var direkte rettet av MIR-130b. Videre er korrelasjonen mellom uttrykket av MIR-130b og STAT3 i bukspyttkjertelkreft prøvene ble videre utforsket.
Materialer og metoder
Pasienter og tumorvev
Totalt 52 menneskelige kreft i bukspyttkjertelen vev (PC) og matchet normale tilstøtende bukspyttkjertelen vev (NP) ble oppnådd i løpet av kirurgi ved bukspyttkjertel Disease Institute, Union Hospital (Wuhan, Kina) mellom januar 2007 og desember 2009. diagnosen var basert på patologisk bevis og prøvene ble umiddelbart snap-frosset. De ble lagret ved -80 ° C for fremtidig MIR-130b og STAT3 ekstraksjon. Ingen av pasientene fikk kjemoterapi eller radioterapi før kirurgisk inngrep. Alle 52 pasienter gitt skriftlig informert samtykke til bruk av sine vev og studieprotokollen ble godkjent av etikkomiteen av Huazhong University of Science and Technology, og antall etisk godkjenning var S214.
kvantitativ real-time revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR)
Total RNA ble isolert fra kreft i bukspyttkjertelen vev eller celler ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA). MiR-130b og U6 ble polyadenylert bruker poly-A polymerase basert First-Strand Synthesis kit (Takara Bio, Japan) etter produsentens protokoll. For å kvantifisere STAT3 og GAPDH mRNA-nivåer, ble en ug av total RNA utsatt for første-tråd cDNA syntese i 15 minutter ved 37 ° C og 5 s ved 85 ° C ved hjelp av en PrimeScript RT Reagent Kit (Takara). QPCR ble utført med SYBR Grønn PCR Master Mix (Takara) på ABI 7500HT System. U6 eller GAPDH ble anvendt som en endogen kontroll. De relative fold uttrykk ble beregnet med to
-ΔΔCT metode. Alle QRT-PCR-reaksjoner ble kjørt i triplikat. En liste av primere anvendt i reaksjonene er angitt i tabell S1.
Cellelinjer og kulturer
human bukspyttkjertelkreft PANC-1, ASPC-1, Miapaca-2, BXPC-3 og SW1990 cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og ble opprettholdt i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin sulfat). Cellene ble dyrket i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
Transfeksjon
microRNAs ble utformet og syntetisert av RiboBio (Ribobio Co, Guangzhou, Kina). Den mikroRNA transfeksjon ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). De kreft i bukspyttkjertelen celler ble sådd ut i 12-brønners plater og fikk vokse opp til 40% konfluens før transfeksjon. RNA og proteiner ble ekstrahert ved 48 timer etter transfeksjon. Den endelige konsentrasjonen av MIR-130b ligne og anti-MIR-130b var 50 nM. Lentiviral MIR-130b (LV-MIR-130b) og tom lentiviral vektor (LV-NC) ble konstruert ved Genechem Company (Shanghai, Kina) og ble transfektert inn i kreft i bukspyttkjertelen celler i henhold til produsentens anvisninger. Alle oligonukleotidsekvenser anvendt i dette forsøk er oppført i Tabell S2.
celleproliferasjon Assays
Celleformering ble bestemt ved MTT-analyser. Kort sagt ble de pankreatiske cancerceller (5 x 10
3 per brønn) sådd ut i 96-brønners plater i RPMI 1640 og 10% FBS. Etter 24 timer for å være i kulturen ble cellene transfektert med 50 nM MIR-130b etterligner, anti-MIR-130b og deres respektive kontroll ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cellene ble deretter dyrket i mediet for en annen 48 timer, og ble bestemt ved en kolorimetrisk bestemmelse under anvendelse av MTT-løsning (5 mg /ml) ved 570 nm. Alle forsøkene ble utført tre ganger med fem replikater.
Evaluering av apoptose og Cell Cycle Distribution
apoptose hastighet og cellesyklus scenen ble bestemt ved FACS flowcytometri som tidligere rapportert [25]. For apoptose-analyse ble celler samlet opp, vasket to ganger med kald fosfatbufret saltløsning (PBS) og resuspendert i bindingsbuffer ved en celletetthet på 1 x 10
6 /ml. Cellene ble deretter farget med Annexin V-FITC og propodium jod i henhold til produsentens protokoll. Signalet ble kjøpt av en FACS Calibur flowcytometer (BD Biosciences) og ble analysert med Cellquest programvare. For den cellesyklusanalyse, ble cellene høstet ved trypsinering, vasket to ganger ved hjelp av kald PBS og fiksert i 70% etanol over natten ved -20 ° C. Deretter ble cellene behandlet med DNA-fargeløsning inneholdende 3,4 mM Tris-Cl (pH 7,4), propodium jodid, 0,1% triton X-100 buffer og 100 ug /ml RNase A. Cellesyklus analyse ble utført med FACS strømningscytometri.
Matrigel Invasion Assay
Matrigel invasjonen kammeret ble brukt for å vurdere celle invasjon egenskaper (24-brønners plater, 8 mm porestørrelse, Corning) som tidligere beskrevet [26]. I korte trekk-celler (5 x 10
4) ble sådd ut i det øvre kammer ved 37 ° C med media inneholdende 0,1% bovint serum-albumin, mens mediet inneholdende 20% føtalt bovint serum ble plassert i den nedre brønnen. Etter 48 timer ble de noninvading cellene fjernes med bomullspinner. Invaderende celler på bunnen av membranen ble farget med 0,1% krystallfiolett og ble tellet under mikroskopisk observasjon. Analysene ble utført i tre eksemplarer, og ble gjentatt tre ganger.
Western Blot analyse
kreft i bukspyttkjertelen celler ble samlet etter 48 timers behandling med 50 nM MIR-130b etterligne eller anti-MIR-130b og tilsvarende kontroller. Proteinekstraksjon, SDS-PAGE-gel-elektroforese og blotting ble utført som vi tidligere beskrevet [27]. Flere forskjellige primære antistoffer ble brukt blant annet: STAT3 (Cell Signaling Technology, Danvers, USA) og GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). De sekundære antistoff-inkubasjoner ble utført i 2 timer ved romtemperatur og proteinbånd ble visualisert på røntgenfilm ved bruk av en forbedret kjemiluminescens ECL substrat.
Dual Luciferase Assay
kotransfeksjonseksperimenter var utført i 96-brønners plater. Totalt 1 × 10
4-celler ble sådd per brønn i 200 ul medium. Totalt 100 ng villtype (WT) eller mutant (MUT) reporter konstruksjonene ble ko-transfektert med Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens til kreft i bukspyttkjertelen celler med 50 nM MIR-130b eller MIR-NC i henhold til produsentens anvisninger. Etter 48 timer ble luciferaseaktiviteten målt med Dual-luciferase reporter analysesystem (Promega). Firefly luciferase aktiviteten var så normalisert til den tilsvarende Renilla luciferase aktivitet.
Bukspyttkjertelkreft Xenotransplantat Modell
Fire uker gammel kvinnelig naken mus (BALB /c-nude) ble brukt for å undersøke tumorigenitet . I alt 100 pl celle oppløsninger (inneholdende 1,5 x 10
7 PANC-1-celler) ble injisert subkutant inn i høyre flanke av musene. Den tumorstørrelse ble målt med en verniercaliper hver fire dager og tumorvolumene ble beregnet ved anvendelse av formelen: lengde x bredde
2 x 0.5 [28]. Bruken av hårløse mus holdt Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og studien ble godkjent av Animal Care og bruk komité Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology.
Statistical Analysis
den MIR-130b uttrykk ble sammenlignet i kreft i bukspyttkjertelen vev og celler ved uparede Student t-test. Sammenhengene mellom MIR-130b og clinicopathologic parametre ble evaluert av χ
2 test. Overlevelsesratene for Mir-130b uttrykk ble estimert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og forskjellen i overlevelseskurver ble testet ved log-rank test. Overlevelsesdata ble evaluert ved hjelp av en multivariat Cox regresjonsanalyse. Forholdet mellom MIR-130b og STAT3 uttrykk ble utforsket av Spearmans korrelasjon. Alle statistiske analyser ble utført av SPSS13.0 programvare og data ble presentert som betyr ± standardavvik (SD). En p lavere enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Clinicopathologic Betydningen av MIR-130b i bukspyttkjertelen kreftpasienter
Ved hjelp av en QRT-PCR-metoden, MIR-130b ble oppdaget i alle de 52 parene av kreft i bukspyttkjertelen vev og deres matchede noncancerous pankreatiske vev, så vel som kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer. Som vist på fig. 1A, 45 PC vev viste lav uttrykk for MIR-130b i forhold til at av de NP vev og median ganger endring var 1,86 (P 0,01). I mellomtiden, MIR-130b uttrykk ble betydelig redusert i alle fem bukspyttkjertelkreft cellelinjer undersøkt i forhold til at av de normale bukspyttkjertel prøver (Fig. 1B).
(A) Den relative uttrykk nivået av MIR-130b i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen vev (n = 52) og matchet tilstøtende noncancerous pankreas vev (n = 52). PC: kreft i bukspyttkjertelen vev; NP: tilstøtende noncancerous bukspyttkjertelen vev. (B) Uttrykket nivået av MIR-130b i fem bukspyttkjertelkreft cellelinjer (Panc-1, ASPC-en, Miapaca-2, BXPC-3 og SW1990). Data er presentert i bukspyttkjertelcancercellelinjer sammenlignet med kontrollgruppen. Det var ingen normal bukspyttkjertelen cellelinje, så vi valgte tilfeldig tre normale bukspyttkjertelen vev som kontroll. U6 ble brukt som kontroll for RNA lasting og miRNA overflod ble normalisert til den av U6 RNA. (C) Kaplan-Meier-kurver av den totale overlevelse av 52 kreft i bukspyttkjertelen ble pasientene mottok så lavt ekspresjonsnivå (under medianverdi, n = 26) og høy ekspresjon nivå (over medianverdi, n = 26) i henhold til mir -130b uttrykk. Mir-130b downregulation var signifikant korrelert med en samlet kortere overlevelse. P-verdiene er vist med bruk av log-rank test. (D) χ
2 analyse av forholdet mellom MIR-130b og invasjon /metastase i bukspyttkjertelen kreftpasienter. *. P 0,05; **. P . 0,01
Videre ble korrelasjonen av MIR-130b downregulation korrelert med bukspyttkjertelkreft prognose undersøkt. Vi studerte sammenhengen mellom MIR-130b uttrykk og kliniske patologiske kjennetegn ved kreft i bukspyttkjertelen. Den lave MIR-130b uttrykk gruppen viste en høyere forekomst av økt tumorstørrelse (P = 0,001), sent TNM stadium (P = 0,005), lymfatisk invasjon (P = 0,012) og fjernmetastaser (P = 0,012). Men ingen signifikante forskjeller ble observert med hensyn til kjønn, alder, tumor beliggenhet, histologisk grad eller fartøy infiltrasjon i bukspyttkjertelkreft (tabell 1). Videre er Kapan-Meier-overlevelsesanalyse viste at pasienter med en lav MIR-130b ekspresjon hadde en vesentlig dårligere prognose enn de med en høy ekspresjon (Fig. 1C). Som vist på fig. 1D, den χ
2 analyse viste at pasienter med en lavere MIR-130b uttrykk ble oftere assosiert med tumorinvasjon og metastasering. Videre pasienter med tumorinvasjon og metastase hadde signifikant lavere MIR-130b uttrykk. I mellomtiden, Cox multivariat analyse viste at Mir-130b uttrykk, TNM stadium, og fjernmetastaser var signifikant assosiert med total overlevelse av kreft i bukspyttkjertelen pasienter som uavhengige prognostiske faktorer (tabell 2). Resultatene viste at MIR-130 deregulering ble korrelert med en dårligere prognose og var involvert i invasjon /metastasering av kreft i bukspyttkjertelen.
MiR-130b Trykt Cell Proliferation både
i
vitro Hotell og
in vivo
for å identifisere virkningene av MIR-130b på kreft i bukspyttkjertelen celler, vi transfektert Panc-1 og ASPC-1 celler med 50 nm MIR-130b ligner, anti-MIR-130b og deres respektive sokkelen. Som vist på fig. 2A, Mir-130b ligner forårsaket en 63,32 og 28,75 ganger økning i MIR-130b uttrykk i PANC-1 og ASPC-1 celler, henholdsvis. Samtidig sank anti-MIR-130b Mir-130b uttrykk ved 2,34 og 2,88 folder i PANC-en og ASPC-1 celler, henholdsvis. Etter transfeksjon med MIR-130b etterligner, spredning ble betydelig hemmet i PANC-en og ASPC-1 celler ved 30,35 ± 2,90% og 22,03 ± 7,64%, henholdsvis (P 0,01). Men anti-MIR-130b fremmet veksten av Panc-1 og ASPC-1 celler ved 15.23 ± 7.40% og 16,70 ± 3,56%, henholdsvis (P 0,01; Fig. 2B).
(A) uttrykket nivået av MIR-130b ble testet i 48 timer i kreft i bukspyttkjertelen celler transfektert med MIR-130b ligner (MIR-130b), anti-MIR-130b og deres respektive NCs (50 nm) ved QRT-PCR. (B) Effekten av transient transfeksjon av MIR-130b eller anti-MIR-130b (50 nM) i 48 timer, ble undersøkt på vekst av PANC-1 og ASPC-1-celler med MTT-analyse. (C) Mir-130b hemmet tumourigenicity i naken mus xenograft modell. LV-MIR-130b eller LV-NC ble transfektert inn i PANC-1-celler i nærvær av virus ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 20. De infiserte PANC-1-celler ble deretter injisert subkutant inn i nakne mus. De tumorvekstkurver og fotografiene av det utskårede tumorer ved 32 dager etter implantasjon er vist som angitt. Data blir representert som gjennomsnittet ± SD av 10 mus. (D) MIR-130b ekspresjonsnivåer ble analysert i skåret svulster ved QRT-PCR og ble normalisert til den for den endogene kontroll (U6 RNA). Data er vist som gjennomsnitt ± SD av 10 mus. *. P 0,05; **. P 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
For ytterligere å bekrefte de ovennevnte funn, en
in vivo
tumormodell ble konstruert av implantere PANC-1 celler transfektert med LV-miRNA. -130b eller negativ kontroll. Gjennom tumorigent periode, svulster fra Mir-130b transfekterte cellene vokste betydelig tregere (Fig. 2C). MIR-130b ekspresjon i xenografttumorer av LV-MIR-130b gruppe var åpenbart høyere enn for kontrollgruppen (fig. 2D). Resultatene viste at Mir-130b hemmet spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler både
in vitro Hotell og
in vivo
.
MiR-130b apoptose og cellesyklus arrest i bukspyttkjertelen kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP
for å undersøke mekanismene for Mir-130b hemming på kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon, analyserte vi apoptose og cellesyklus i de transfekterte PANC-1 og ASPC-1 celler ved hjelp av flowcytometri. Mir-130b ligner betydelig økt apoptose raten i PANC-1 (3,57 ± 0,83%
vs.
11.17 ± 1.96%) og ASPC-1 celler (6,17 ± 1,66%
vs.
12,30 ± 1,30%) sammenlignet med den for den MIR-NC (fig. 3A og 3C). Videre Mir-130b ligner betydelig redusert andelen av G0 /G1 og G2 /M faser. Videre økte de andelen av S-fasen i PANC-en (24,13 ± 4,10%
vs.
41,54 ± 3,80%) og ASPC-1 celler (23,52 ± 3,33%
vs.
47.66 ± 2,04%) sammenlignet med den for kontrollgruppen (fig. 3B og 3D).
(A) PANC-1 og ASPC-1-celler ble transfektert med MIR-130b eller MIR-NC (50 nM) i 48 timer, og apoptose ble målt ved hjelp av Annexin V-farging og flowcytometri. (B) Den PANC-1 og ASPC-1-cellene ble behandlet som nevnt ovenfor, og cellesyklusfordelingen ble målt ved PI farging og flowcytometri. Flowcytometrisk analyse av virkningene av MIR-130b indusert apoptose (C) og cellesyklus arrest (D). Data er presentert som gjennomsnitt ± SD av resultater fra 3 uavhengige eksperimenter. **. P 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
MiR-130b hemmet kreft i bukspyttkjertelen Cell Invasivitet
Effekten av MIR-130b på kreft i bukspyttkjertelen celle invasivitet ble undersøkt av Matrigel invasjonen. analyser. Vi fant at antallet invaderende Panc-1 celler transfektert med Mir-130b ligner (57 ± 5 celler /HP, HP: høy effekt forstørrelse felt) var bemerkelsesverdig lavere enn antallet av dem transfektert med MIR-NC (122 ± 9 celler /HP, fig. 4A). Lignende resultater ble også oppnådd for den invasivitet av ASPC-1-celler transfektert med de MIR-130b etterligner (Fig. 4B). Det viste seg at MIR-130b mediert bukspyttkjertelkreft celle invasivitet.
(A) PANC-1-celler ble transfektert med MIR-130b eller MIR-NC (50 nM) i 48 timer og celle invasjon evnen var målt ved matrigel invasjon analyser. (B) De ASPC-1-cellene ble behandlet som ovenfor, og den celle invasjon evnen ble målt ved matrigel invasjons analyser. Kvantifisering ble utført ved å telle de farget PANC-1 og ASPC-1 celler som invaderte til det nedre kammer under et lys-mikroskopi. Alle resultatene var reproduserbare i tre uavhengige forsøk. **. P . 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
STAT3 kan være direkte Target av MIR-130b
For å undersøke mulighetene mål gjennom som MIR-130b hemmer spredning og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler, vi tok fordel av bioinformatikk til å forutsi mulige MIR-130b mål ved hjelp TargetScan, Miranda og PicTar algoritmer. Vår analyse identifiserte STAT3, en nøkkel onkogen, som en av de potensielle mål for MIR-130b. Videre ble målsekvenser av STAT3 3’UTR (villtype, WT) eller mutant sekvens (mutant type MUT) klonet inn i luciferase reporter vektor, henholdsvis (fig. 5A). Våre resultater viste at MIR-130b signifikant redusert ildflue luciferase aktiviteten i reporter med villtype 3’UTR, men aktiviteten av mutant 3’UTR vektor forble upåvirket (Fig. 5B). De PANC-1 celler ble ytterligere transfektert med MIR-130b og ble undersøkt for STAT3 uttrykk ved QRT-PCR og Western blot. Som vist på fig. 5C, Mir-130b transfeksjon førte til en åpenbar nedgang i STAT3 mRNA og protein uttrykk. Tvert imot, transfeksjon av anti-MIR-130b resulterte i en oppregulering i STAT3 uttrykket.
(A) (Øvre panel) Den humane STAT3 3’UTR-fragment som inneholdt vill-type eller mutert MIR-130b- bindende sekvens. (Nedre panel) Mir-130b og Mir-130b-bindingssetet i 3’UTR av STAT3. (B) luciferase reporter analysen med kotransfeksjon av villtype eller mutant 3’UTR (100 ng) og MIR-130b eller MIR-NC (50 nM) i PANC-1-celler. Ildflue luciferase-aktiviteten av hver prøve ble normalisert mot Renilla luciferase-aktivitet. (C) Virkningene av MIR-130b eller anti-MIR-130b på uttrykket av endogen STAT3. QRT-PCR (venstre panel) og western blot (høyre panel) ble brukt for å overvåke STAT3 uttrykk i PANC-1 celler 48 timer etter transfeksjon med MIR-130b eller anti-MIR-130b (50 nM). Alle data fra tre separate forsøk er presentert som gjennomsnitt ± SD. *. P 0,05; **. P . 0,01
STAT3 ble oppregulert i bukspyttkjertelen vev og ble omvendt korrelert med MIR-130b Nivåer
De STAT3 mRNA nivåene ble målt i PC vev og tilstøtende noncancerous vev. Som vist på fig. 6A, det gjennomsnittlige nivået av STAT3 ekspresjon var signifikant høyere i PC-vev sammenlignet med den for NP vev (P 0,01). En signifikant invers korrelasjon ble observert mellom STAT3 og MIR-130b uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen vev (Spearmans korrelasjon, r = -0,4903; P 0,01) og tilstøtende noncancerous vev (r = -0,4026; P 0,001) (fig 6B.).
(A) STAT3 ble oppdaget av QRT-PCR i 52 bukspyttkjertelkreft (PC) vev og ble matchet de tilstøtende noncancerous bukspyttkjertelen vev (NP). Den STAT3 overflod ble normalisert mot GAPDH. (B) Forholdet mellom STAT3 og MIR-130b uttrykk ble utforsket av Spearmans korrelasjon i 52 sammenkoblede PC vev og tilstøtende NP vev. Alle data fra tre separate forsøk er presentert som gjennomsnitt ± SD. *. P 0,05; **. P . 0,01
Diskusjoner
Det er etablert Mirna profiler for en rekke solide og hematologisk kreftsykdom [29], [30]. I de siste årene har oppdagelsen av miRNAs gjennomgått betydelige fremskritt i forståelsen av kreft biologi ved å gi ekstra mekanismer for genetisk deregulering. Imidlertid er lite kjent om de molekylære mekanismer som av mirnas modulasjon i prosessen med tumorgenese og oppførselen til kreft i bukspyttkjertelen celler. I denne studien fant vi at Mir-130b var ofte nedregulert i både kreft i bukspyttkjertelen vev og cellelinjer. Det ble også avdekket at Mir-130b trykt bukspyttkjertelen kreftceller spredning både
in vitro Hotell og
in vivo
av induksjon av apoptose og cellesyklus arrest, samt hemmet invasivitet
i vitro
. Videre også STAT3 ble karakterisert som et funksjonelt mål for MIR-130b.
mirnas har blitt rapportert å være viktig i bukspyttkjertel kreft, mens assosiasjoner til overlevelse og kliniske resultater er i stor grad uklart. Overlevelse analyse av denne studien viste at Mir-130b deregulering korrelert med kortere overlevelse av kreft i bukspyttkjertelen pasienter. I mellomtiden, de kliniske data viste at Mir-130b deregulering var signifikant forbundet med stor svulst størrelse, sent TNM stadium, lymfatisk invasjon og fjernmetastaser. I tillegg multivariat analyse indikerte at den lave MIR-130b uttrykk, avansert TNM stadium og fjernmetastaser var signifikante prognostiske faktorer for en dårlig generelle overlevelse av kreft i bukspyttkjertelen pasienter. Derfor foreslår vi at våre observasjoner gi innsikt til viktigheten av MIR-130b som kan være en roman biomarkør å forutsi prognose og progresjon av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
Nylig er modulering av miRNAs antas å holde betydelig klinisk potensiale i behandling av kreft [31]. Yip et al. avslørte at downregulated MIR-130b var sterkt korrelert med aggressiv fenotype av papillær thyroideakarsinom [18]. Yang et al. viste at MIR-130b nedregulering fremmet utviklingen av multimedikamentresistent eggstokkreft delvis ved å målrette det 3′-UTR av CSF-1, mens MIR-130b stanse kan være mediert av DNA-metylering [32]. Men de andre resultatene viste at Mir-130b ble betydelig oppregulert og fungerte som en svulst promoter. Lai et al. viste at MIR-130b ble åpenbart overexpressed i magekreft og dens overekspresjon økt celle levedyktighet og redusert celledød [13]. Liu et al. viste at MIR-130b ble overexpressed i levercellekreft og kan være et serum biomarkør med kliniske verdier for levercellekreft screening [33]. Siden effekten av MIR-130b i bukspyttkjertelkreft ble langt fra definert, denne studien forsøkte å identifisere funksjonen til MIR-130b i bukspyttkjertelkreft. Restaureringen av MIR-130b ble funnet å vesentlig undertrykke spredning av PANC-en og ASPC-1 celler ved induksjon av apoptose og cellesyklus arrest i S-fasen. Videre vekst av xenografttumorer ble betydelig hemmet etter å ha blitt tilført med LV-MIR-130b. Disse resultatene antydet at Mir-130b kan fungere som en inhibitor i fremdriften av bukspyttkjertelen kreftutvikling. Videre disse resultatene viste heterogenitet i funksjon av MIR-130b som var avhengig av krefttype og cellulær sammenheng.
invasjon og metastase var de viktigste årsakene til dårlig prognose hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Mange studier har vist at det var en nær sammenheng mellom invasjon /metastase av kreft i bukspyttkjertelen og mirnas, slik som MIR-20 og MIR-146a [9], [34]. Derfor rakne den komplekse rollen miRNAs i ferd med bukspyttkjertelkreft metastaser kan gi ny innsikt for noen terapeutiske konsekvenser. Våre kliniske resultater viste at Mir-130b ble betydelig redusert hos pasienter med invasjon /metastasering. Videre pasienter med et høyere uttrykk av MIR-130b ble sjeldnere assosiert med invasjon /metastasering. Vi identifiserte ytterligere rollen MIR-130b i bukspyttkjertelkreft celle invasivitet. Etter restaureringen av MIR-130b, invasivitet av PANC-1 og ASPC-1 celler ble tydelig hemmet. Disse resultatene intensivt innebar at Mir-130b kan være involvert i bukspyttkjertelkreft metastase progresjon. Derfor tilnærminger for å introdusere MIR-130b til kreftceller kan være potensielt mulig for klinisk behandling av bukspyttkjertelkreft, spesielt for de med lavere Mir-130b uttrykk i tumorvev.
STAT3, et medlem av signaltransduksjon og aktivering av transkripsjon (STAT) familie, har vært hyppig overuttrykt i et bredt spekter av humane tumorer, inkludert kreft i bukspyttkjertel [35] – [37]. STAT3 deltar i initiering og utvikling av kreft ved å fremme celleproliferasjon, inhibere celle apoptose, fremme angiogenese, invasjon og metastase [38], [39]. I denne studien ble en viktig molekylær sammenheng mellom MIR-130b og STAT3 demonstrert. Den bioinformatikk analyse indikerte at STAT3 kan være en av de potensielle mål for Mir-130b. Luciferaseaktiviteten data viste at Mir-130b var i stand til å direkte målrette 3’UTR av STAT3. Den QRT-PCR og Western blot Resultatene viste at overekspresjon av MIR-130b downregulated uttrykk for STAT3 i kreft i bukspyttkjertelen celler av både forstyrrer og nedverdigende mRNA, mens anti-MIR-130b oppregulert den STAT3 uttrykk. Til slutt, den inverse sammenhengen mellom MIR-130b og STAT3 uttrykk i PC og NP vev ble ytterligere bekreftet at Mir-130b downregulation resulterte i STAT3 overekspresjon. Samlet utgjør disse dataene viste at Mir-130b kan hemme cellevekst og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen ved å målrette STAT3.
I sammendraget, vår nåværende studien viste at det deregulerte uttrykk for MIR-130b var assosiert med dårlig prognose og aggressiv fenotype for kreft i bukspyttkjertelen. Denne studien antydet også at Mir-130b spilt en viktig rolle i reguleringen av kreft i bukspyttkjertelen ondartet oppførsel inkludert celleproliferasjon og invasjon av direkte rettet mot STAT3.
