Abstract
Kirurgi indusert betennelser er en potent formidler av tumor tilbakefall og metastase i tykk- og endetarmskreft. Den nylig oppdaget familie av NOx enzymer utgjør en stor kilde av endogene reaktive oksygenarter (ROS) og er nå sterkt implisert i tumorcellemetastase. Interessant, kan Nox enzymer være «målrettet» aktiveres av inflammatoriske cytokiner og vekstfaktorer som finnes i overflod i den perioperative vinduet. Som tykktarm kreft celler uttrykker Nox enzymer og Toll-like receptor 4 (TLR-4), hypotese vi at LPS kan forsterke muligheten for tykktarmskreftceller til metastasise via Nox enzymmediert Redox signal. Til støtte for denne hypotesen, viser dette papiret at LPS induserer en signifikant, forbigående økning av endogen ROS i SW480, SW620 og CT-26 tykktarm kreft celler. Denne økningen i LPS-indusert ROS aktivitet er fullstendig opphevet av en Nox-hemmer, diphenyleneiodonium (DPI), Nox1 siRNA og en NF-kB inhibitor, Dihydrochloride. En betydelig økning i Nox1 og Nox2 protein ekspresjon forekommer etter LPS-behandling. Hemming av NF-kB demper også økningen av Nox1 og Nox2 protein uttrykk. Sub-cellulære plassering av LPS-indusert ROS generasjon ligger hovedsakelig i det endoplasmatiske retikulum. LPS aktiverer PI3K /Akt vei via Nox generert ROS og dette signalet blir hemmet av DPI. Denne LPS-aktiverte Nox mekanisme muliggjør en betydelig økning i SW480 kolon cancer celle adhesjon til kollagen I, som hemmes av DPI, Nox1 siRNA og et PI3K-inhibitor. Til sammen disse dataene tyder på at LPS-Nox1 redoks signalnettverk aksen spiller en avgjørende rolle i tilrettelegging av tykktarmskreft celle adhesjon, og dermed øke metastatisk potensial for tykktarmskreftceller. Nox1 kan representere et verdifullt mål i å forebygge tykktarmskreft metastase
Citation. O’Leary DP, Bhatt L, Woolley JF, Gough DR, Wang JH, Cotter TG, et al. (2012) TLR-4 Signale Akselererer Colon Cancer Cell Adhesjon via NF-kB mediert Transkripsjonell oppregulering av Nox-en. PLoS ONE 7 (10): e44176. doi: 10,1371 /journal.pone.0044176
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: Mai 29, 2012; Godkjent: 30 juli 2012; Publisert: 11 oktober 2012
Copyright: © O’Leary et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste årsaken til kreft. relatert dødelighet i den vestlige verden [1]. Kirurgisk reseksjon er fortsatt bærebjelken i kurativ behandling for kreft i tykktarmen. Imidlertid vil ca 25-35% av node positive pasienter utvikle enten lokalt tilbakefall eller fjernmetastaser innen fem år etter operasjonen [2]. Dette fenomenet er på grunn av frigjøringen av inflammatoriske mediatorer i respons til kirurgiske traumer, som potensierer den metastaserende evne av sirkulerende tumorceller og gjenværende celler svulster. Effekten av dette fenomenet manifesterer seg i en betydelig reduksjon i sykdom og total overlevelse for pasienter med kolorektal kreft.
Tumor celle tilslutning er et viktig steg på metastatisk kaskade. Nyere bevis har vist hvordan eksogene kirurgi-indusert reaktive oksygenforbindelser (ROS) styrke evnen til sirkulerende kreftceller til å følge den endothelial fôr ved å opprette inter hull, slik at kreftceller til å følge fortrinnsvis til den eksponerte ekstracellulære matriks. Disse destruktive, cytotoksiske effekter av ROS forekommer ved høye nivåer. Men på lave nivåer, kan endogen ROS fremme celle overlevelse gjennom regulering av redoks sensitive overlevelses trasé som PI3K /Akt, som har vært tungt involvert i å tilrettelegge svulst celle metastasering.
Nox enzymer er en viktig kilde til endogen ROS generasjon i respons til inflammatoriske mediatorer så som cytokiner, vekstfaktorer og hypoksiske betingelser, som alle er forhøyet som følge av kirurgisk trauma [3] – [4]. Nox enzymer består av en familie på 7 enzymer, Nox1-5 og Duox1,2 [5]. Interessant, ekspresjon av Nox enzymer i kreftceller er nylig blitt beskrevet og Nox-avledede ROS er nå kjent for å lette den metastatiske prosess i kreftceller, inkludert tykktarmen, melanom, pankreatisk og magekreftceller [6] – [8]. Nyere bevis tyder på at signal effektene av Nox-avledet ROS er kontekstavhengig, som de ikke bare gi pro-inflammatorisk virkning, men også spille en rolle i den cellulære anti-inflammatorisk forsvarsmekanisme [9].
lipopolysakkarid ( LPS) eller endotoksin er en potent trigger vertsbetennelsesreaksjoner i peri-operative vindu. LPS er en gram negativ bakterie antigen som translocates over tarmveggen etter større kirurgiske inngrep eller under et septisk episode, noe som resulterer i en endotoxaemia [10]. Anerkjennelse av LPS av Toll-like receptor-4 (TLR4) induserer medfødt immunitet via en intracellulær signalering kaskade i en MyD88 avhengig eller uavhengig måte. Både in vitro og in vivo studier nå implisere LPS indusert TLR-4 signalering som en utløser for hver fasett av metastatisk cascade inkludert heft [11] – [12]. Dessuten er TLR-4 uttrykk i tykktarm kreft celler assosiert med økt risiko for dannelse av levermetastaser i tykktarm kreftpasienter og ensidige dårligere prognose [13] -. [15]
Som nyere bevis antyder, vellykket tumorcelle metastase er fremmet av den ødeleggende effekten av eksogent ROS. Vi hypotese at endogene ikke-giftige nivåer av ROS kan også spille en viktig rolle i orkestre svulst celle metastasering. Heri viser vi hvordan en LPS-Nox1 signale aksen gir opphav til en betydelig økning i den klebende evne av tykktarmskreftceller. LPS-aktivering av Nox aktivitet forekommer i et NF-kB avhengig måte som fører til en forbigående økning av intracellulær ROS. Denne forbigående økning av intracellulær ROS fører fosforylering av Redox sensitive Akt. Til sammen disse dataene tyder på at LPS-Nox1 redoks signalnettverk aksen spiller en avgjørende rolle i tilrettelegging av tykktarmskreft celle adhesjon, og dermed øke metastatisk potensial for tykktarmskreftceller.
Materialer og metoder
Cell Culture
den menneskelige tykktarmskreftcellelinjer, SW480, SW-620 og CT-26 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Celler ble opprettholdt i en sub-konfluent tilstand ved bruk av RPMI (Roswell Park Memorial Institute) dyrkningsmedium supplementert med 10% føtalt kalveserum, 1% penicillin /streptomycin, og 4 mmol /l L-glutamin alle fra Sigma Aldrich, Dublin, Irland . Celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2. Celler ble belagt over natten før LPS behandling for å tillate vedlegg
Antistoffer og reagenser
LPS avledet
E.coli
belastning 055. B5 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. I denne studien følgende antistoffer ble brukt – Nox1, p22phox, p47phox (i Santa-cruz Biotechnology, Santa-Cruz, CA, USA), Nox2 (Upstate, Milton Keynes, UK), p-Akt (Cell Signaling), IkB-α , p-IkB-a (Cell Signal), GAPDH (Avansert immunochemicals, Long Beach, CA, USA). IKK inhibitor (dihydroklorid) ble kjøpt fra Sigma og PI3K inhibitor (LY294002) ble kjøpt fra EMD Chemicals (San Diego, California, USA). Målrettet knockdown av Nox1 ble utført ved hjelp av siRNA. To forskjellige konstruksjonene ble benyttet (Ambion, # s25726, s25727).
Flowcytometri
5 × 10
4 celler per brønn ble belagt over natten i en 24 brønners plate. -Celler ble behandlet med LPS i en konsentrasjon på 1 pg /ml for 0,10,20,30,40,50,60 minutter og 24 timer. ROS produksjon etter LPS behandling ble overvåket ved hjelp av 2 «, 7» dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCF) (Molecular Probes, Leidin, Nederland). Cellene ble trypsinisert, sentrifugert i 5 minutter ved 1000 rpm og deretter oppsamlet. DCF ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 50 uM og prøvene ble inkubert i 15 minutter ved 37 ° C før analyse på en FACScan strømningscytometer (Becton Dickinson, Oxford, UK). Dichlorofluorescin (DCF) fluorescens, genereres når DCF samhandler med ROS. ROS ble dermed målt ved fluorescens kanal 1 (FL-1) (530 nm) med eksitasjon ved 488 nm. Cellquest-programvare (Becton Dickinson) ble anvendt for dataanalyser.
Western blotting
Western blotting ble utført for å måle proteininnholdet i celler behandlet med 1 ug /ml LPS for 0,10,20, 30,40,50,60 minutter og 24 timer. Cellene ble deretter trysinised og sentrifugert i samlingen. Hele celleekstrakter ble deretter oppnådd. Cellepelletene ble vasket med iskald PBS og deretter resuspendert i cellelyseringsbuffer 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mMNaCl, en mMNa3VO4, en mMNaF, en mMEGTA, 1% Nonidet P-40, 0,25% natrium-deoksycholat inneholdende proteaseinhibitorer ( Roche Diagnostics, Lewes, UK) og 0,2 mM 4- (2-aminoetyl) benzensulfonyl fluor-hydroklorid] og inkubert på is i 20 min. Alle rester ble fjernet ved sentrifugering ved 4 ° C, og proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK) ved anvendelse av bovint serumalbumin som en standard. Ekvivalente mengder av protein, ble oppløst ved anvendelse av denaturerende natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese, etterfulgt av overføring til nitrocellulosemembraner (Schleicher 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
LPS indusert TLR-4 signalering øker intracellulære ROS-nivåer i tykktarm kreft celler
SW480, SW620 og CT. -26 celler uttrykker TLR-4, og ble derfor valgt for å undersøke effekten av LPS-indusert produksjon ROS [16]. Som bestemt ved FACScan-analysen, er en forbigående økning i intracellulære nivåer ROS-sett som respons på LPS behandling etter 40 minutter i alle cellelinjer (figur 1 (a)). Endogene nivåer av ROS er nesten på kontrollnivåer på 60 minutter. Disse data ble kvantifisert ved anvendelse av dataprogrammet Cellquest for å måle de geometriske middel for kurvene (figur 1 (b)). SW480 celler konsekvent generere høyere nivåer av intracellulær ROS i forhold til SW620 og CT-26 celler. På bakgrunn av dette SW480 celler er hovedfokus for etterfølgende eksperimenter.
(a) LPS indusert en forbigående, betydelig økning i ROS-aktivitet i SW480, SW620, Ct-26 tykktarm kreft celler. SW480, SW620 og CT-26 celler ble behandlet med LPS (1 ug /ml) på tjue, førti og seksti minutter. DCF fluorescens ble målt ved anvendelse av FACScan strømningscytometer og Cellquest-programvare. Disse resultatene er samlet i de ovennevnte histogrammer. Y-aksen representerer celletall og på x-aksen måler fluorescens nivå. En forskyvning til høyre langs x-aksen representerer et høyere nivå av DCF fluorescens og således ROS produksjon. Alle histogram viser en kontroll (solid svart linje) med en Color Line representerer en økning i DCF fluorescens. Effekten av LPS på ROS-aktivitet i SW480, SW620 og CT-26 colon cancerceller ble kvantifisert ved hjelp av Cellquest for å måle de geometriske middel for kurvene, og sammenlignet med ubehandlede kontroller som ble testet på samme dag, og sammenlignet i et stolpediagram. (B) LPS induserer en doseavhengig ROS sprekke ved 40 minutter. En flowcytometri histogram viser en doseavhengig forskyvning i ROS-aktivitet. (Solid svart strek = ubehandlede, grønn = 0,1 ng /ml, rød = 1 mikrogram /ml, blå = 10 mg /ml Den doseavhengig effekt ble kvantifisert og sammenlignet i et stolpediagram * P … 0,05 Disse dataene er representative av 3 uavhengige eksperimenter.
ved søkt å undersøke om dette LPS-indusert økning i endogen ROS var som reagerer på variasjoner i dosen av LPS. Vi viser at etter hvert som dosen av LPS øker, ROS respons øker (figur (1 b)). Disse resultater indikerer at SW480 celler generere endogent ROS i respons til TLR-4-signalisering i en doseavhengig måte i tykktarmskreftceller.
LPS-indusert ROS generasjon i SW480-celler er opphevet ved en Nox enzyminhibitor
Gitt at TLR-4-signalisering induserer en signifikant økning i endogene ROS-nivåer, ved søkte vi å etablere den intracellulære kilden til LPS-indusert ROS. LPS-indusert ROS-aktivitet er kjent for å innbefatte TLR-4 mediert interaksjon med Nox4 i embryoniske nyreceller [17]. imidlertid intra-cellulær kilde til LPS-indusert ROS i tykktarmskreftceller er stort sett ukjent. Andre plausible kilder til endogen ROS generasjon bortsett fra Nox enzymer inkluderer mitokondrier og COX enzymer. Med dette i bakhodet har vi brukt målrettet hemmere for å hindre ROS generasjon i SW480 celler fra alle disse kilder, inkludert en mitokondrie inhibitor (rotenon), en COX-hemmer (diklofenak) og en Nox protein inhibitor (DPI). Forbehandling med rotenon var forbundet med en liten økning i ROS-nivåer, i tråd med de siste rapportene at rotenon kan aktivere Nox aktivitet [18]. Diclofenac forårsaker ingen signifikant reduksjon i LPS-indusert intracellulære ROS-nivåer (figur 2 (a) og (b)). Interessant, forbehandling med DPI resulterer i fullstendig oppheving av LPS-indusert ROS-aktivitet ved 40 minutter (figur 2 (c)). Tatt sammen, disse resultater viser at NOx-enzymer er de mest sannsynlige intra-cellulær kilde til ROS følgende TLR4 signalering i kolon kreftceller.
(a) En betydelig dempning av fluorescens ble observert i prøvene som er behandlet med DPI ( 2 mm). DCF fluorescens ble målt ved anvendelse av FACScan strømningscytometer og Cellquest-programvare. Solid svart linje (kontroll). Rød linje (LPS behandlet). Grønn linje (LPS + DPI behandlet). (B, c) rotenon og diclofenac ikke klarte å inhibere LPS (1 pg /ml) indusert ROS-aktivitet på 40 minutter. * P 0,05. Disse dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter.
LPS behandling av SW480 celler øker nivået av Nox1 og Nox2 uttrykk
Som DPI resulterte i fullstendig oppheving av LPS-indusert ROS aktivitet, vi ønsket å ytterligere undersøke hvilken rolle Nox enzymer i LPS-indusert ROS generasjon i SW480 celler. Western blotting ble brukt for å identifisere Nox enzym uttrykk. Nox1 samt Nox2 ble funnet å bli uttrykt (fig 3 (a), (b)). Interessant, nivået av Nox1 og Nox2 uttrykk øker som respons på LPS behandling. Nox1 protein expression øker vesentlig over den ubehandlede nivået av ekspresjon ved 40 minutter (figur 3 (a)). En tilsvarende økning observeres i uttrykket mønster av Nox2 (figur 3 (b)). Heving av Nox1 og Nox2 protein uttrykk sammenfaller med den betydelige økningen i LPS indusert-ROS generasjon 40 minutter sett på flowcytometri.
(a) Ved hjelp av Western blotting vi vise at Nox1 uttrykk i SW480 celler øker i respons til LPS (1 pg /ml). (B) Western blotting viser også at LPS øket ekspresjon av Nox2 40 minutter. (C) p22phox er vist å være uttrykt og uttrykk øker tidligere enn Nox1 og Nox2. (D) p47phox er vist å bli uttrykt, men uttrykket er stabil de tidspunkter. (E) Kvantitativ PCR analyse av Nox1 og Nox2 mRNA i SW480-celler ble behandlet med LPS (1 pg /ml) over en time. Data blir representert som fold-forandring i forhold til kontroll ubehandlede celler timer som bestemt ved 2-ΔΔCt metode. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD og er representative for tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05. Disse dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter.
Nox enzymaktivering er avhengige på montering av individuelle underenheter. Vi har derfor også sett på effekten av LPS-behandling på protein uttrykk for p22phox og p47phox (figur 3 (c, d)). Det var ingen endring i p47phox uttrykk, men det var en økning i p22phox uttrykk på tjue minutter og forble vedvarende gjennom 60 minutter.
Vi undersøkte videre økning av Nox1 og Nox2 protein uttrykk som respons på LPS behandling ved hjelp av RT-PCR for å kvantifisere Nox1 og Nox2 mRNA-nivåer som respons på LPS (figur 3 (e)). En dramatisk seks ganger økning i Nox1 mRNA nivåer og en 5 ganger økning i Nox2 mRNA nivåer sammenlignet med ubehandlede kontroller skjer 20 minutter etter LPS behandling. Denne økning i mRNA-nivåer er forbigående, og det er en betydelig reduksjon av 40 minutter og 60 minutter etter LPS-behandling. Disse resultatene antyder at LPS aktiverer en transkripsjonsfaktor, mest sannsynlig NF-kB, som øker Nox1 og Nox2 mRNA som respons på LPS. Dette muliggjør da en økning i Nox1 og Nox2 ekspresjon ved 40 minutter som manifesterer med en betydelig økning i endogene ROS-nivåer i SW480 celler. For å bekrefte denne teorien, vi trengte for å lokke fram den rollen NF-kB i LPS indusert endogen ROS-aktivitet.
LPS indusert ROS er NF-kB avhengig
Ettersom det er en etablert kobling tydelig mellom LPS og NF-kB aktivering via MyD88 vei, undersøkte vi om NF-kB spilt en rolle i LPS indusert ROS-aktivitet. I-B-Kappa-kinase (IKK) er et enzym som er nødvendig for å aktivere NF-kB. En IKK inhibitor ble anvendt for å inhibere NF-kB aktivitet (figur 4 (a)). Forbehandling med IKK-inhibitor resulterte i fullstendig oppheving av LPS-indusert ROS-aktivitet på 40 minutter. IKB-α er en hemmende underenhet av NF-kB. Fosforylering av IKB-α er nødvendig for NF-kB-aktivering. På bakgrunn av dette har vi sett på pIKB-α uttrykk som respons på LPS behandling. Interessant er nivået av pIKB-α signifikant forhøyet i 20 minutter etter LPS-behandling (figur 4 (b)). Det er sannsynlig at NF-kB aktivering 20 minutter etter LPS behandling gjør at transkripsjon av mRNA nødvendig for økningen i Nox1 og Nox2 uttrykk sett på 40 minutter.
(a) Kvantifisering av DCF fluorescens ved hjelp Cellquest programvare viser en betydelig reduksjon av LPS-indusert 40 minutters ROS-aktivitet i nærvær av IKK-inhibitor (40 ug /ml) etter LPS-behandling (1 pg /ml). (B) p-IkB økning i ekspresjon ved 20 minutter etter LPS-behandling. * P 0,05. Disse data er representative for 3 uavhengige eksperimenter. (C) LPS (1 pg /ml) indusert ekspresjon Nox1 økt 40 minutter etter LPS-behandling, men forbehandling med IKK inhibitor i 1 time reduserte nivået av ekspresjon til ubehandlede nivåer. (D) LPS indusert Nox2 uttrykk på 40 minutter er også redusert ved IKK inhibitor. * P 0,05. Disse data er representative for 3 uavhengige eksperimenter.
For å bevise at NF-kB-aktivering er nødvendig for en økning i Nox1 og Nox2 uttrykk etter LPS-behandling, ble en NF-kB-inhibitor igjen anvendt. LPS-indusert Nox1 protein ekspresjon i 40 minutter ble redusert med IKK inhibitor (figur 4 (c)). LPS-indusert Nox2 protein-ekspresjon ble også redusert signifikant ved 40 minutter i nærvær av IKK inhibitor (figur 4 (d)). Det ser derfor ut som LPS-indusert ROS generasjon er avhengig av NF-kB-aktivering som resulterer i en økning av Nox1 og Nox2 ekspresjon i SW480.
LPS-indusert DCF fluorescens co-lokaliseres til det endoplasmatiske retikulum i SW480 celler
Nye antioksidant terapi er mer effektive på grunn av økt biotilgjengelighet og muligheten til å målrette bestemte ROS genererer organeller som mitokondrier. Siden det ikke var noen reduksjon i ROS-nivåer ved bruk av rotenon, spurte vi den subcellulære rommet som var ansvarlig for ROS generasjon som respons på LPS. Vi først co-farget SW480 celler med DCF og en ER tracker fargestoff og deretter undersøkt fluorescens ved hjelp multiphoton mikroskopi. DCF viser en tydelig peri-nukleær fargemønster i SW480-celler som respons på LPS behandling (figur 5a). Dette mønsteret er svært likt det vi observerer med en ER tracker fargestoff og co-Lokaliserer med DCF. Dette tyder på at økningen i ROS etter LPS-behandling er generert i ER. Når SW480 celler ble behandlet med DPI, demper dette DCF fluorescens i akuttmottaket, og dermed gi ytterligere bevis på at LPS-indusert ROS aktivitet er forbundet med Nox enzymet uttrykk. Disse eksperimentene indikerer at ROS generert som respons på LPS lokalisere til ER og sammen med nyere bevis som viser at de TLR-4 /MD2 komplekse signaler gjennom ER, viser at ER spiller en fokal rolle i TLR-4-signalisering.
Cellene ble dyrket i 48 timer i glassbunn retter. (A) Celler ble behandlet med DCF og en ER tracker fargestoff i 1 time ved 37 ° C med LPS (1 pg /ml) ble tilsatt 30 minutter før avbildning med en multiphoton laser scanning mikroskop. (B) Celler ble farget med mitotracker dyp rød (1 uM) og (10 uM) MitoPY, og behandlet med menadion (8 pM) eller LPS (1 pg /ml) i 1 time ved 37 ° C. Målestokk representerer 20 mikrometer.
siden ønsket å undersøke mitokondriene som en intracellulær kilde til LPS indusert ROS. En tidligere studie av Dickenson et al viste at peroksy-gul (MitoPY), et fluorescerende probe, effektivt kan brukes til bilde H
2o
2 i mitokondriene i levende celler [19]. Her har vi co-farget MitoPY med mitotracker dyp rød og deretter behandlet SW480 celler med menadion ved 8 pM i 1 time ved 37 ° C (figur 5b) [20]. Vi bekreftet at MitoPY er rettet til mitokondriene og oppdager mitokondrielle ROS når cellene ble behandlet med menadione. Vi behandlet deretter SW480-celler med LPS og observert minimale nivåer av ROS generert i mitokondriene i forhold til den positive kontroll hvor celler ble behandlet med menadion.
TLR-4 indusert ROS regulere metastatiske signaltransduksjonsveiene i SW480-celler
Regulering av cellulære signalveier er en av en rekke intracellulære effekter hentet fra TLR-4 signalering. Individuelle overlevelsesreaksjonsveier inkludert PI3K /Akt veien, noe som er kjent for å lette tumormetastase, kan aktiveres med TLR-4-signalisering. Den inhibitoriske proteiner av denne reaksjonsvei som PTEN, er kjent for å være redoks-følsomt. Etter å ha fastslått at SW480 celler generere endogen ROS fra ER i en NF-kB avhengig måte i respons til TLR-4-signalisering, således undersøkte vi om LPS-induserte endogene ROS kan spille en rolle i regulering av disse redoks-følsomme baner. Vi ser en økning i pakt 40 minutter etter LPS-behandling som tilsvarer økningen i LPS-indusert ROS-aktivitet også iakttatt ved 40 minutter (figur 6 (a)). pakt ekspresjon på 40 minutter blir inhibert av DPI (figur 6 (b)). Disse resultatene demonstrerer hvordan TLR-4 indusert ROS aktivitet kan regulere metastatiske signalveier som PI3K /Akt.
(a) LPS (1 pg /ml) behandling bevirker en forbigående økning i fosforylering Akt, maksimal ved 30- 40 minutter. (B) Pakt uttrykk er økt respons på LPS behandling på 40 minutter og fullstendig hemmet av DPI (2 mm). * P 0,05. Disse dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter.
LPS indusert adhesjon er tilrettelagt i en Nox avhengig måte
Nyere studier har rapportert at LPS kan øke kreftceller tilslutning, et viktig skritt for vellykket metastase [21]. LPS letter dette gjennom oppregulering av proteiner som β1-inte [22]. Den viktigste signalveien ansvarlig er PI3K /Akt sti som vi har vist til regulert av LPS aktivering av Nox-avledet ROS. Dermed har vi ønsket å etablere hvis Nox signaliserer tilrettelagt LPS tykktarmskreft celle tilslutning respons på LPS. En betydelig økning i SW480 celle tilslutning til Collagen I er sett på en time (figur 7 (a, b)). Denne økningen i tilslutning hemmes av DPI og en PI3K inhibitor, LY294002. Dette tyder på at mekanismen som er ansvarlig er avhengig av Nox signalering. Etter å ha vist at LPS induserer ROS via en Nox mekanisme, ønsket vi å undersøke nærmere hvilke medlem av Nox familien var ansvarlig for denne økningen i ROS aktivitet og tumor celle adhesjon. Effektiviteten av siRNA middel ble testet ved anvendelse av flow cytometri. Den andre siRNA gitt best reduksjon og faktisk forårsaket en nesten fullstendig oppheving av LPS indusert ROS (Figur 7 (c)). Det ser derfor ut Nox1 bidrar flertallet av ROS og kanskje har en mer funksjonell rolle enn Nox2 som respons på LPS behandling. Western blotting ble brukt til å bekrefte effektiviteten av hver siRNA transfeksjon (figur 7 (c)).
(a, b) LPS behandling resulterte i en signifikant økning i SW480 celle adhesjon til kollagen etter 1 time. Dette ble inhibert ved hjelp av en anerkjent Nox-inhibitor, DPI (2 uM), og et PI3K-inhibitor, LY294002 (5 uM). (C) Nox1 siRNA opphever LPS indusert ROS og Nox1 knockdown bekreftes av Western blotting. (D) Økningen i SW480 tykktarmskreft celle adhesjon ble fullstendig hemmet av Nox1 siRNA. * P 0,05. Disse dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter.
Nox1 siRNA behandlede celler ble så brukt til å undersøke hvilken rolle Nox1 i tykktarmskreft celle tilslutning. Interessant nok var en signifikant reduksjon i tumorcelle tilslutning sett i Nox1 siRNA celler etter LPS behandling, noe som indikerer at Nox1 avledet ROS er avgjørende for potensering av tykktarmskreftcelle tilslutning som respons på LPS (figur 7 (d)).
diskusjon
koblingen mellom systemisk inflammasjon og profilering av metastase har blitt godt etablert [23]. I denne studien viser vi hvordan Nox-avledet ROS gi en «missing link» i forståelsen av hvordan betennelse aktiverer signaltransduksjonsveier ansvarlig for svulst tilbakefall og metastasering. Denne studien viser at LPS regulerer PI3K /Akt signalisering via Nox-avledet ROS i tykktarm kreft celler. Derfor LPS dette aktivert redoks mekanismen er ansvarlig for å fremme svulst etterlevelse, poten risikoen for vellykket metastaser.
Operasjon betennelse forsterker tumorcelle metastase gjennom PI3K /Akt signalering. Tidligere studier har vist en betydelig økning i lungemetastaser etter operasjonen, og denne effekten blir hemmet av et PI3K inhibitor [24]. Tilsvarende Hsu et al nylig vist at tumorcelle adhesjonen er avhengig av PI3K signalering som respons på LPS [11]. Faktisk LPS er blitt vist å direkte aktivere PI3K /Akt signalering, men som viser våre resultater, Nox-avledede ROS spille en viktig rolle i redoks-regulering av denne veien [25] – [26]. Interessant nok har tidligere undersøkelser vist at Nox-deriverte ROS aktiveres nedstrøms av PI3K /Akt signalering [27].
