Abstract
Heat sjokk faktor 1 (HSF1) er en mester regulator som koordinerer anstand protein uttrykk for å forbedre mobilnettet overlevelse i møte med varmestress. I kreftceller, driver HSF1 en transkripsjons program forskjellig fra varmesjokk for å fremme metastasering og celleoverlevelse. Sin sterke tilknytning til ondartede fenotype innebærer at HSF1 antagonister kan ha generelle og effektive verktøy i kreftbehandling. For dette formålet, hadde vi identifisert en ivrig RNA aptamer for HSF1 som er bærbare mellom ulike modellorganismer. Utvide vårt tidligere arbeid i gjær og Drosophila, her rapporterer vi aktiviteten til dette aptamer i humane kreftcellelinjer. Når den leveres inn i celler ved anvendelse av et syntetisk gen og sterk promoter, dette aptamer var i stand til å forhindre HSF1 fra binding til dets DNA-reguleringselementer. På cellenivå, ekspresjon av dette aptamer indusert apoptose og avskaffet koloni-dannende evne av kreftceller. På molekylært nivå, det reduserte anstand og dempet aktivering av MAPK-signalveien. Sammen er disse dataene viser fordelen av aptamerer i narkotika mål validering og støtter hypotesen om at HSF1 DNA-bindende aktivitet er et potensielt mål for styring av onkogene transformasjon og neoplastisk vekst
Citation. Salamanca HH, Antonyak MA, Cerione RA Shi H, Lis JT (2014) Hemme Heat Shock faktor 1 i humane kreftceller med en potent RNA Aptamer. PLoS ONE 9 (5): e96330. doi: 10,1371 /journal.pone.0096330
Redaktør: Sandy D. Wester, University of South Florida, USA
mottatt: 18 januar 2014; Godkjent: 04.04.2014; Publisert: 06.05.2014
Copyright: © 2014 Salamanca et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd (GM25232 til JT Lis; CA140730 til JT Lis og H. Shi, Minority Supplement # 25232-2351 til JT Lis og HH Salamanca), og Cornell University (Provost mangfold Fellowship til HH Salamanca). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
The Heat Shock Factor 1 (HSF1) er en transkripsjonsfaktor som reagerer på en rekke miljømessige stressfaktorer for å aktivere varmesjokk respons i eukaryoter, en beskyttende mekanisme konservert blant forskjellige riker [1]. Stressende fornærmelser, for eksempel termisk eksponering, stimulere HSF1 å opptre som en mester aktivator av et sett av målgener. Spesielt fører det opphopning av proteiner med chaperoning aktiviteter, for eksempel varmesjokkproteiner (HSP), HSP70 og HSP90, som bidrar til å opprettholde intracellulær homeostase ved å beskytte proteomet mot toksiske effekter av protein misfolding og aggregering [2]. Mens det er bare en HSF i
Saccharomyces cerevisiae Hotell og
Drosophila melanogaster
, flere isoformer eksisterer hos pattedyr og planter, som synes å ha spesialiserte funksjoner [3] – [5]. HSF1 funksjon er viktig for stressrespons og levedyktighet i gjær [6], og viktig for oogenesen og tidlig utvikling i Drosophila [7]. HSF1 er også involvert i aldringsprosessen i
C. elegans product: [8], så vel som i ekstra-embryonale utvikling og flere viktige sykdommer hos pattedyr [9].
Paradoksalt nok under visse omstendigheter, HSF1 evne til å fremme celle overlevelse kan true den generelle vel- være av en flercellet organisme. En gripende eksempel er funksjonen av HSF1 i kreft. Det har lenge vært kjent at kreftceller kan fortsette å spre seg i hypoksiske og fiendtlige microenvironments som ellers er veksthemmende til normale celler. Derfor er det ikke overraskende at kreftcellene oppviser forhøyede nivåer av varmesjokkproteiner (HSP) for å lette brettingen av skadede proteiner og solubilisering av proteinaggregater [10]. Mens denne observasjonen tyder på en indirekte rolle HSF1 i kreft progresjon, har en direkte innvirkning på HSF1 på malignitet blitt oppdaget nylig [11]. Faktisk er HSF1 funnet å bli aktivert i et bredt utvalg av ondartede celler, og mønsteret av DNA belegg med HSF1 i slike kreftceller er forskjellig fra den for normale celler eksponert for varmesjokk. Dermed driver HSF1 en distinkt transkripsjonen program som fremmer cellulær transformasjon og vedlikeholder ondartet vekst. I tillegg til mange klassiske varmesjokkgener, kreft-spesifikke gener i dette programmet støtte cellesyklusregulering, signalering, metabolisme, heft og oversettelse. Fordi dette HSF1 signatur er assosiert med dårlig pasientens utfall i ulike typer kreft hos mennesker, inkludert de av bryst, lunge og tykktarm, kan HSF1 være et mål for generell og effektiv kreftbehandling [11].
For hensikten med å studere og å styre funksjonen av HSF1 i celler og organismer, vi tidligere har identifisert et RNA aptamer, AptHSF-RA1 [12]. Den aptamer ble først isolert i en
in vitro
valg Drosophila eksperiment ved hjelp HSF1 som målet, og senere vist å være i stand til å gjenkjenne HSF1 i gjær, Drosophila og mennesker. Sletting analyse definert en minimal binding motiv av aptamer består av to stengler og en stilk-løkke sammen med en 3-veis kryss [12]. Dette aptamer samvirker med den DNA-bindende domene og et tilstøtende område av linker HSF1, og konkurrerer med de DNA-varmesjokkelementer (HSEs) for binding til HSF1. I gjærcelleekstrakter, hemmer aptamer transkripsjon fra varmesjokkpromotorer, og når det uttrykkes i levende gjærceller, den produserer en temperaturfølsom vekstretardasjon fenotype og spesifikk reduksjon av varmesjokk-genekspresjon [13]. I Drosophila, dette aptamer reduserer Hsp83 nivåer og forårsaker utviklingsavvik som etterligner fenotyper av Hsp83 reduksjon. Den aptamer også effektivt undertrykker fenotyper indusert av konstitutivt aktive former av EGF reseptoren og Raf teinene, som er regulert «klient» proteiner av Hsp83 [14].
Her i denne studien rapporterer vi anti- cancer aktiviteten til dette HSF1 aptamer i dyrkede humane celler. Vi vedtok dimer konfigurasjonen av AptHSF-RA1 brukes i Drosophila [14], som ble kåret iaRNA
HSF1 ( «ia» står for «hemmende aptamer»), og leverte den inn HeLa livmorhalskreft celler i form av et syntetisk -genet ved transfeksjon. Den anti-cancer aktiviteten til aptamer ble deretter undersøkt gjennom tre linjer av studier. Først fikk vi bekreftet den molekylære mekanismen av aptamer handling ved å bestemme avbrudd av HSF1 interaksjon med sine beslektede DNA-elementene
in vitro Hotell og
in vivo
. For det andre, demonstrerte vi muligheten av aptamer, når uttrykt i kreftceller, for å fremme apoptose og hemmer kolonidannelse i myk agar. Til slutt, vi ta opp spørsmålet om spesifisitet i cellene ved å vise: (1) de aptamer fenotyper blir undertrykt av overekspresjon av HSF1 eller HSP, (2) aptamer uttrykk reduserer HSF1 mål genuttrykk, og (3) aptamer uttrykk reduserer HSF1 modulert, MAPK signalveien. Samlet våre resultater er enig med tidligere rapporter som viser at HSF1 er avgjørende for å opprettholde cellulære transformasjon. Videre våre funn heve interessant mulighet for at en aptamer som funksjonelt inaktiverer HSF1 kan brukes til å blokkere menneskelig kreft progresjon.
metoder og materialer
Expression konstruerer
Sekvensen dimerisk aptamer konstruere, er iaRNA
HSF1 følgende (de små bokstaver representerer hammer Ribozyme): 5′GUCGAGUGACGUUGGCAUCGCGAUACAAAAUUAAGUUGAACGCGAGUUCUUCGGAAUUCAACUGCCUUCGUCAUACUCCUUGAAUUCAACUGCCUUCGGGCAUCGCGAUACAAAAUUAAGUUGAACGCGAGUUCUUGGAGGCUCGACguc uagcgaugugguuucgcuacugaugaguccgugaggacgaaac 3 «. I prosessen med å konstruere ekspresjonsvektoren for den dimere aptamer, et antisense-styrekonstruksjon, RevRA1, ble generert ved hjelp av primersett som bytter sperre og lagging tråder av aptamer kodende område samtidig som hammerenheten intakt. Både sense- og antisense-enheter ble klonet i gateway-vektorene [14] og flyttet inn i pDest51 (Invitogen) for ekspresjon av aptamer og kontrollen i pattedyrceller. Den kodende sekvens av «redde» proteiner og deres kontroller, inkludert HSF1, HSP90, HSP70, LacZ og GFP, ble hver klonet nedstrøms fra CMV promoteren i en annen vektor med G418 som selektiv markør.
Cellekultur og transfeksjon
Celler brukt i denne studien ble innhentet fra ATCC og vedlikeholdt i henhold til produsentens instruksjoner. HeLa (CCL-2), Havforskningsinstituttet-90 (CCL-196), 293T (CRL-3216), MCF7- (HTB-22), U87 MG (HTB-14), og BE (2) -M17 (CRL-2267) cellene ble dyrket i E-MEM lav glukosemedium (ATCC) supplert med 10% FBS, 1X Pen /Strep i 5% CO
2. MDA-MB-231 (CRM-HTB-26) ble dyrket i RPMI media supplert med 10% FBS, 1X Pen /Strep i 5% CO
2. De 293T-celler ble dyrket i DMEM høy glukosemedium (ATCC) supplert med 10% FBS, 1X Pen /Strep i 5% CO
2. Etter vekst til konfluens ble cellene trypsinert og føres inn i friskt medium i henhold til ATCC instruksjoner. Disse foreldre celler ble transfektert med iaRNA
HSF eller RevRA1 RNA kontroll-uttrykke vektorer. Ikke-transfekterte celler ble deretter fjernet fra populasjonen ved dyrking av cellene i 6 ug /ml blasticidin og vasking av cellene 24 timer etter transfeksjon. Deretter ble cellene opprettholdt og dyrket i (1 pg /ml) blasticidin. Bare de blasticidin-resistente celler ble anvendt gjennom hele etterfølgende analyser. For de «redning» eksperimenter, konstruerer uttrykker menneskelig HSF1 (hHSF1), human HSP90 (hHSP90), menneskelig Hsp70 (hHSP70), LacZ, eller GFP ble blandet med ekspresjonsvektorer for HSF aptamer (eller kontroll RNA) på en 20:01 ratio for å sikre riktig og overskudd ekspresjon av de interesserte målene i forhold til de aptamerer. Etter at plasmidene var blandet, ble hver blanding transfektert inn i HeLa-celler i 6-brønners skåler. Ikke-transfekterte celler ble skylt bort ved å bruke metodene som er beskrevet ovenfor, og de gjenværende celler ble holdt i seleksjonsmedium.
EMSA
Det generelle skjema for elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA) ble tatt i bruk og modifisert fra tidligere arbeid [12]. RNA prober ble internt merket med [a-
32P] UTP ved hjelp av en T7
in vitro
transkripsjon kit (MAXIscript, Ambion, Austin, TX). De 10 ul bindings løsningen inneholdt 1 x bindingsbuffer, 1 ug bærer gjær-RNA, 4 ug bærer BSA, 5 mM DTT, 10% glycerol, 6 enheter av SUPERase-In (RNase-inhibitor), pluss protein og merket RNA aptamer. Konsentrasjonen av merket RNA-probe er under 1 nM i de fleste eksperimenter. Den humane HSF1-genet ble oppnådd fra Thiele Lab [15] og ble subklonet inn i Gateway ekspresjonssystem som en Hans fusjon. Den bakterielt uttrykte Hans-merket hHSF protein ble renset ved Ni-NTA kromatografi. Dette ble renset His-tagget hHSF1 protein ble inkubert med aptamer RNA ved romtemperatur i 30 min og 10 min ved 4 ° før lasting på en 6-9% innfødt polyakrylamidgel. Gelene inneholdt 1/4 TBE-buffer og 1 mM MgCl
2 og ble kjørt ved 100-150 V ved 4 ° C i 1-2 timer.
RT-PCR
RT -PCR ble utført 24 timer etter transfeksjon ifølge en protokoll som er beskrevet tidligere ved hjelp av følgende primere
iaRNA
HSF1 F:.
5′-GTCGAGTGACGTTGGCATCG
iaRNA
HSF1 R:
5’GACGTCGAGCCTCCAAGAAC
iaRNA
Rev F:
5′-GTCGAGCCTCCAAGAACTCG
iaRNA
Rev R :
5’GACGTCGAGTGACGTTGGCA
Chromatin Immunpresipitasjon (chip)
ChIP analysen ble utført 36 timer etter transfeksjon ifølge en protokoll som er beskrevet tidligere [16] med antistoffer mot HSF1 eller HSF2 vennlig levert av Dr. Richard Morimoto.
Western blot
Prøver ble utarbeidet 72 timer etter transfeksjon for molekylære analyser mindre annet er spesifisert. For undersøkelse av caspase-3 prøver ble fremstilt mellom 72-96 timer. I korte trekk ble cellene tilført hver 48 timer, og prøver ble samlet ved sentrifugere media, pelletering av cellene. Dessuten ble adherente celler vraket i PBS, pelletert og kombinert med de celler i media. Deretter prøver ble lysert i nærvær av ikke-ioniske vaskemidler som inneholder proteasehemmere, og prøvene ble kokt i nærvær av 6X-SDS. Konvensjonelle Western blot protokollene ble anvendt med følgende antistoffer. Primære antistoffer: G6PDH ble kjøpt fra Sigma (A9521). Alle andre antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Inc .: HSF1 (No. 4356), HSP90 (No. 4875), Hsp70 (No. 4872), hsp60 (No. 4870), Hsp40 (No. 4868), calnexin (No. 2433), GRP78 (No. 3177), EGFR~p (No. 2234), ERK1 /2~p (No. 9146), total ERK1 /2 (No. 9102), Caspase-3 (# 9662). PARP-antistoff var anti PARP-DBD, en gave fra Dr. W.L. Kraus, og transglulaminase (TGM2) var en gave fra Dr. R. Ceriones laboratorium kjøpt fra Thermo Scientific. Sekundære antistoffer ble anvendt i henhold til riktig immunreaktivitet. PVDF-membranene ble blokkert ved anvendelse av 5% BSA og membraner ble inkubert primære antistoffer over natten ved 4 ° C.
apoptotisk assay
Apoptose ble observert ved å kvantifisere antallet av HeLa-celler som inneholdt fragmenterte kjerner som visualisert etter DAPI flekker under mikroskopet. I disse eksperimentene, ble foreldre, iaRNA
HSF eller RevRA1 RNA-kontrollceller observert i 96 timer etter transfeksjon. I disse forsøk ikke-transfekterte iaRNA
HSF ble fjernet ved dyrking av cellene i 6 ug /ml blasticidin og vasking av cellene 24 timer etter transfeksjon. Bare de blasticidin-resistente celler ble anvendt gjennom hele etterfølgende analyser. Alle statistiske analyser i denne studien ble beregnet ved anvendelse av Students t-test.
forankringsuavhengig vekst assay
6 x 10
3 semi-stabile transfekterte celler ble sådd ut på 6-brønners skåler i passende medium supplert med 3% agarose (type VII, Sigma A4018) over et varmt lag av pre-størknede medium inneholdende 6% agarose (type VII, Sigma A4018). Fem dager etter plating cellene en ny en cm lag med media ble belagt over voksende celler. HeLa-celler inneholdende 17-AGG hadde en endelig konsentrasjon på 8,8 ug /dl 17-AAG agar blanding. Evnen av celler til å vokse i bløt agar ble evaluert etter 14 dager. Kolonier ble analysert under lysmikroskop.
Resultater
iaRNA
HSF1 hindrer HSF1 fra binding til sine regulatoriske DNA elementer i HeLa carcinoma celler
Tidligere utviklet vi en metode for å levere RNA aptamerer inn i kjernen av celler som syntetiske gener [17] og brukte den til å uttrykke aptamer for HSF1, AptHSF-RA1, i Drosophila [14]. Dette RNA konstruksjon, kalt iaRNA
HSF1, inneholder to aptameric enheter for økt aviditet og en hammer ribozym hvori den 5 «og 3» ender av RNA-er beskyttet for å lette bretting og stabilitet. Vi tilpasset denne konstruksjon ved å plassere dens kodende sekvensen under kontroll av den EF-1a-promoteren i en pattedyr-ekspresjonsvektor. Vi har også gjort en kontroll konstruksjon, kalt RevRA1, hvori aptamer-delen av den iaRNA
HSF1 ble erstattet av sin antisense-sekvens. Før du bruker den på celler, produserte vi dette RNA av
in vitro
transkripsjon og bestemt sin grådighet for renset humant HSF1 i en elektromobilitet skift assay (EMSA) (figur 1A) med renset humant HSF1 protein (figur S1 A) . Her er den iaRNA
HSF1 generert en forskjøvet kompleks med en tilsynelatende K
d av 25 nM (figur 1B). I kontrast, gjorde RevRA1 kontroll ikke viser noen bindende. I tillegg, når begrensende mengder av iaRNA
HSF1 ble inkubert med høye mengder av renset BSA (1 uM), ingen forskjøvet bånd ble observert. Sammen utgjør disse
in vitro
Resultatene viste at samspillet mellom iaRNA
HSF1 og HSF1 oppstår med høy affinitet og er relativt selektiv.
(A) Elektro motilitet shift-analyse (EMSA) ved hjelp radiomerket iaRNA
HSF1 (1 nM) og økende mengder av menneskelig HSF1 protein viser at aptamer binder seg til målet ivrig. (B) Kvantifisering av uavhengige EMSA avslører den tilsynelatende affinitet av iaRNA
HSF1 for HSF1 som Kd~25 nM (n = 5).
Deretter transfektert vi iaRNA
HSF1 -expressing vektor inn i en kreft og en ikke-transformert cellelinje. Vi valgte HeLa-cervikale karsinomceller som en representant kreftcellelinje, fordi de er en av de mest vanlig brukte og godt karakteriserte humane cancer-cellelinjer [18]. Som en ikke-transformert cellelinje, anvendte vi IMR-90-celler, som er ikke-transformerte, ikke-immortaliserte humane lungefibroblaster [19]. Som en kontroll for den funksjonelle aptamer brukte vi RevRA1 uttrykke vektoren. For å bekrefte uttrykket av konstruksjonene i cellene, utførte vi revers transkripsjon og kvantitative PCR (RT-qPCR) analyser ved hjelp av primersett som gjenkjenner dimeric iaRNA
HSF1 eller kontroll RevRA1 24 timer etter transfeksjon. Våre resultater viste at RNA aptamer nivåer var lik for både aptamer og kontroll RNA i HeLa og IMR-90-celler (figur 2A).
(A) kontroll RNA (RevRA1) og aptamer RNA (iaRNA
HSF1) konstruerer er uttrykt i tilsvarende nivåer i HeLa og IMR90 celler etter 24 timer etter transfeksjon (RNA-verdier normalisert til GAPDH, n = 3). (B) Forstyrrelse av HSF1 interaksjon med sine beslektede DNA-elementer ved iaRNA
HSF1. Chip-analyser i iaRNA
HSF1 (eller RevRA1) uttrykker HeLa-celler som viser at iaRNA
HSF1 uttrykk effektivt kan hemme HSF1 binding til
HSP90 Hotell og
Hsp70
arrangøren loci
in vivo
(n = 3). Antistoffer brukes i chip analyser er spesifikke for pattedyr HSF1 eller HSF2 proteiner [20]. BG = Bakgrunns.
For å bekrefte den molekylære mekanismen for aptamer handling, bestemt vi enten iaRNA
HSF1 effektivt forhindret HSF1 fra binding til sine regulatoriske DNA elementer i cellene. For dette formål, utførte vi kromatin immunoutfelling (chip) analyser på iaRNA
HSF1 eller RevRA1 uttrykker HeLa-celler (36 timer etter transfeksjon, før cellene som gjennomgår apoptose-se nedenfor) ved bruk av et antistoff som er spesifikt for pattedyr HSF1 [20] . Vi fant ut at iaRNA
HSF1 uttrykk betydelig svekket HSF1 binding til sentrale varmesjokk arrangører (
HSP90 Hotell og
Hsp70
)
in vivo plakater (figur 2B). Fordi pattedyr inneholder to heat shock proteiner, HSF1 og HSF2, og DNA-bindende domene er sterkt konservert mellom dem, vi også testet om vår aptamer hemmer HSF2 bindende. Vi fant ut at iaRNA
HSF1 uttrykk på samme måte hindrer HSF2 binding til
HSP90 Hotell og
Hsp70
arrangøren
in vivo plakater (figur 2B). Det er mulig at den aptamer hemmer begge transkripsjonsfaktorer eller hemning av en faktor binding kan påvirke promoteren belegg på den andre, som begge HSF1 og HSF2 er kjent for å regulere spesifikke varmesjokkgener [21]. Likevel, mye lavere nivåer av HSF2 på arrangørene, i forhold til HSF1 (legg merke til 50-fold forskjell i y-aksen skala), oppdaget av Chip på
HSP90
og
HSP70
arrangører og redusert affinitet av aptamer for HSF2 (figur S1B) antyder at de primære hemmende effekter av aptamer på nedstrøms genuttrykk er gjennom HSF1, i hvert fall under disse forholdene i HeLa celler.
iaRNA
HSF1 uttrykk induserer apoptose og demper transformere evnene til kreftceller
Deretter undersøkte vi om at aptamer har på overlevelse av HeLa celler og de ikke-transform IMR-90 celler. Fire dager (96 timer) etter transfeksjon cellene med enten iaRNA
HSF1 eller RevRA1, ble mobilnettet levedyktighet og apoptose kvantifisert ved direkte observasjon av de cellene som var aktivt gjennomgår celle blebbing, kjernekraft sammenbrudd og kromatisk fragmentering. Vi fant at aptamer uttrykk i de ikke-transformerte IMR-90-celler forårsaket liten, om noen morfologiske endringer (figur 3A), eller induksjonen av celledød (figur 3B). I motsetning til dette forårsaket en aptamer omtrent 9-ganger økning i celledød av kreftcellelinje HeLa (63% av befolkningen,
p
= 0,0001). Som allerede vist ovenfor i figur 2A, er disse forskjellene var ikke på grunn av forskjeller i nivåene av ekspresjon aptamer mellom de ikke-transformerte og transformerte kreftcellelinjer. For å demonstrere det generelle i denne effekten, da spurte vi om uttrykk for iaRNA
HSF1 i kjemisk forvandlet menneske 293T nyrecellelinje vil likeledes drepe cellene. Vi fant ut at iaRNA
HSF1 uttrykk i 293T celler dramatisk fører til at cellene til å runde opp og løsne fra deres kultur plater, i likhet med HeLa-celler (figur 3A). Sammenlignet med de foreldre og kontrollcellene var det en ca 7 ganger økning av apoptose i iaRNA
HSF1 uttrykker 293T celler, med en
p
-verdi av 0,0018 (figur 3B).
(A) iaRNA
HSF1 uttrykk påvirker ikke normale celler (IMR90), men induserer en unormal morfologi i HeLa livmorhalskreft og kjemisk transformnyreceller (293T). (B). Nuclear kondens og fragmentering analyser viser at iaRNA
HSF1 uttrykk induserer ~ 10 ganger økning i apoptose i HeLa-celler (p 0,0001) (n = 8), og ~ 7 ganger økning i apoptose i 293T celler (p 0,0001 ) (n 8). Videre iaRNA
HSF1 indusert apoptose i effektivt undertrykt av over-uttrykk for molekylære anstand (HSF1 p 0,006, HSP90 p 0,005, eller Hsp70 p 0,002), men ikke tilfeldig proteiner (GFP eller LacZ) (n 8).
Siden en brøkdel av iaRNA
HSF1-uttrykke kreftceller ikke gjennom apoptose (ca. 30%), forsøkte vi å finne ut om disse cellene ble kompromittert i deres evne til å danne kolonier i forankringsuavhengig (soft agar) vekstanalyser, en
in vitro
måling av tumorgenicity. Som forventet, HeLa-celler som uttrykker en kontroll RNA-sekvens (RevRA1) dannes store kolonier i bløt agar (Figur 4); Men HeLa celler som uttrykker iaRNA
HSF1 ikke. Dette indikerte at HeLa-celler som uttrykker HSF1 aptamer som ikke gjennomgår apoptose i løpet av de første 96 timene av sitt uttrykk er kompromittert i deres transformasjon kapasitet. Disse funnene gir ytterligere støtte som HSF1 er faktisk nødvendig for vedlikehold av den transform kreft fenotype, i likhet med tidligere rapporter [22].
HSF1 hemming av iaRNA
HSF1 hemmer forvandlet vekst i myk agar. Soft agar-analyse av ikke-transfekterte HeLa-celler (øverst til venstre) eller kontroll RNA overuttrykkende HeLa (nederst til venstre), viser at iaRNA
HSF1 over-uttrykket (nederst til høyre) hemmer cellulær transformasjon (kolonidannelse) på en lignende måte som behandling av HeLa celler med 150 nM 17-AAG (øverst til høyre) (dag 14).
Fordi HSP90 er co-regulert av HSF1 og er viktig for veksten av kreft celler [23], vi videre sammenlignet hemmende effekter av iaRNA
HSF1 mot en potent HSP90 inhibitor 17- (allylamino) -17-demethoxygeldanamycin (17-AAG) på kolonidannelse i soft agar. I likhet med iaRNA uttrykkende celler, HeLa-celler dyrket i nærvær av 150 nM 17-AAG ikke var i stand til å danne kolonier i bløt agar (figur 4). Samlet er disse funnene tyder på at den funksjonelle inaktivering av HSF1 av iaRNA
HSF1 reduserer uttrykk for viktige HSF1-regulerte gener som igjen er avgjørende for vedlikehold av transformert fenotype.
iaRNA
HSF redusert anstand nivåer og svekket den MAPK veien i HeLa celler
Drug mål validering og terapeutisk utvikling krever streng kvalitetssikring av spesifisitet. Dette problemet er relevant for HSF1 aptamer beskrevet her, så det ble isolert ved hjelp av en ortologe protein. Imidlertid er mangel på off-target effekter vanskelig å påvise i det komplekse miljø i levende celler. Således vi nærmet seg dette problemet fra tre forskjellige vinkler på molekylært nivå for å demonstrere den kausalitet mellom aptamer ekspresjon og tap av den transformerte fenotype i humane kreftceller. Først tok vi en genetisk tilnærming som ligner faktor titrering eller legge til tilbakekjøps eksperimenter hvor aptamer induserte effektene reverseres ved tilsetning av overskudd target protein [17]. Nylig har vi med hell brukt denne strategien i Drosophila og fant at utviklingsavvik indusert av iaRNA
HSF1 kan bli undertrykt av over-uttrykk for HSF1 [14]. Etter dette eksempelet, undersøkte vi om HSF1 over-uttrykk kan redde kreftceller som uttrykker iaRNA
HSF1 fra gjennomgår apoptose. Vi fant at ektopisk uttrykk for HSF1 eller HSF1-regulert gener som er viktige for å fremme celle overlevelse, nemlig
Hsp70 Hotell og
HSP90
kan redde aptamer-mediert apoptotisk respons, sammenlignet med ekspresjon av kontrollproteiner (LacZ eller GFP) (figur 3B).
for det andre, bekreftet at det er årsakssammenheng mellom aptamer ekspresjon og dens effekt på HSF1 inhibering ved å måle nivået av produktene av genene som er kjent å bli kontrollert av HSF1 binding, som inhiberingen av HSF1 binding av aptamer bør føre til en reduksjon i disse proteinene. Vi målte den totale nivåer av ulike molekylære anstand proteiner 72 timer etter transfeksjon i foreldre (ikke-transfektert), kontroll RNA (Rev) og iaRNA
HSF1-uttrykke HeLa-celler (figur 5A). Viktigere, nivåene av HSP70, calnexin, transglutaminase 2 (TGM2), og grp78 ble sterkt redusert i aptamer uttrykke celler. HSP90 uttrykk ble også reproduserbart redusert, men i mindre grad enn HSP70. I motsetning til dette ble nivået av mitokondriell spesifikk hsp60 anstand ikke påvirkes av aptamer, noe som tyder på at hsp60 er enten en meget stabil protein med en lang halveringstid som er tolerant av de proteolytiske hendelsene i apoptose eller dens uttrykk er uavhengig av HSF1 transkripsjonen aktivitet. I disse forsøk ble apoptose detektert ved analysering for spaltning av caspase-3 target PARP. For å møte om den observerte reduksjonen i HSP70, calnexin, transglutaminase (TGM2), og grp78 skyldtes HSF1 hemming eller en konsekvens av den av den aptamer indusering av apoptose, målte vi den totale nivåer av anstand i HeLa-celler som uttrykte iaRNA
HSF men ble forhindret fra å komme inn apoptose ved samtidig uttrykke HSP90. I likhet med hva vi har observert i celler som uttrykker bare iaRNA
HSF1, cellene uttrykker både iaRNA
HSF1 og HSP90, observerte vi en generell nedgang i den totale nivåer av utvalgte molekylære anstand, HSP70 (-50%), calnexin (~ 50%), og grp78 (-25%) sammenlignet med foreldre HeLa eller kontrollcellene (som uttrykker RevRA1) (figur 5B, n = 4). Denne observasjonen tyder på at reduksjon av molekyl anstand av iaRNA
HSF1 skyldes, i det minste delvis, til den generelle reduksjon i HSF1 aktivitet på sin genet mål.
(A) Western blot-analyse som viser uttømming av spesifikke molekylære anstand proteiner i aptamer eller kontroll uttrykke celler. HSP90 co-uttrykk redder spesifikke molekylære anstand observert i HSF1 hemmet aptamer uttrykke celler. Stjernen indikerer PARP nedbrytningsprodukt, en markør for apoptose. De forlot de fleste tre baner er en seriell fortynning av foreldre linje ekstrakter som gir en kvantifisering standardkurve. (B) Kvantifisering av resultatene observert i panel A (n = 4, indikerer feil% SEM).
Vi validere resultatene ovenfor og utnytte kraften i pattedyr genetikk ved sondering for HSP70 og HSP90 hjelp mus embryonale fibroblast som har blitt hentet fra levedyktige og frukt hSF1 null mus (
hsf1 – /-
) genereres i Benjamin Ivor laboratorium [24]. Blant pattedyr, viser HSF1 høy strukturell og funksjonell bevaring [15], [20] På lignende måte som HSF1 inhibering av aptamer, finner vi at
hsf1 – /-
celler har relativt liten effekt på den totale nivå av HSP90 protein, men viser store utslag i Hsp70 under normale vekstforhold sammenlignet med villtype MEFs (Figur S2).
Tredje, undersøker vi hvordan hemme HSF1 av vår aptamer demper aktivering av MAPK signalveien . Drosophila MAPK veien ble tidligere rapportert av oss til å bli påvirket av HSF1 aptamer [14]. Likeledes Lindquist og Gius Laboratories har vist at HSF1 utarming også påvirke denne veien [22] – [23], [25]. Her viser vi i menneskeceller som HSF1 hemming av aptamer påvirket den generelle nivåene av klinisk relevante teinene, Ras, Raf, og Akt, før utbruddet (48 timer) og under aptamer indusert apoptose (96 timer). I forhold til den RevRA1 kontroll, aptamer uttrykkende celler viste en progressiv reduksjon i nivåene av Ras, Raf og Akt på en måte som var også i samsvar med avtagende nivåer av full-lengde caspase-3, et bonified markør av apoptose [ ,,,0],26] (figur S3A). Vi finner at disse resultatene kan delvis trykkes av co-uttrykk for hHSF1 både biokjemiske og morfologiske analyser (Figur S3 A B).
For å direkte undersøke muligheten for iaRNA
HSF1 å hemme MAPK aktivitet i humane kreftceller, stimulerte vi HeLa-celler som uttrykker aptamer eller kontroll RNA med mitogen, epidermal vekstfaktor (EGF), og undersøke virkningene den hadde på aktivering av EGF-reseptor eller MAPK-signalisering ved å samle cellene 10 minutter etter behandlingen og analysering av prøvene ved Western blotting. Viktigere, ble disse forsøkene utført i en tid når cellene ikke var aktivt gjennomgår apoptose som visualisert ved det intakte protein PARP (36 timer etter transfeksjon) (figur 6A). Totalt sett finner vi at sperre eller kontroll RNA-uttrykkende HeLa-celler som uttrykker en betydelig mengde av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) som kan aktiveres som reaksjon på epidermal vekstfaktor stimulering (p-EGFR) (figur 6A). I motsetning til dette rettet mot HSF1 aktivitet med aptamer redusert mengden av aktivert EGFR (p-EGFR) (figur 6A). For å undersøke effekten av denne aptamer hadde på mitogene signaliseringsaktivitet, vi undersøkt for aktiverte ERK1 /2 plan, medlemmer av MAPK som fungerer nedstrøms for EGFR. Her finner vi at celler som uttrykker HSF1 aptamer inneholde reduserte mengder av Actived ERK1 /2 (fosforylert) som er ledsaget av en ca 75% reduksjon i de totale nivåer av ERK1 /2-protein, sammenlignet med celler som uttrykker styre aptamer (figur 6B). På en lignende måte, og som et bevis på prinsipp, utfyller vi disse eksperimentene bruker WT og
hsf1 – /-
MEFs og finner ut at HSF1 K.O. celler viser en nedsatt evne til aktiv ERK1 /2 (p-ERK1 /2) (fig S4). Dette svekket MAPK signaliserer svar kan dempes ved over-uttrykke k-Ras
G12V i
hsf1 – /-.
MEF celler
(A) HSF1 hemming demper EGF reseptor aktivering etter tilsetning av EGF til HeLa-celler. (B) HSF1 hemming av iaRNA
HSF1 fører til en utarming av de totale nivåer og aktiverte former av ERK1 /2.
