Abstract
Formål
For å finne ut om nano-arkitektoniske avhør av prostata feltet kreftutvikling kan brukes for å forutsi prognosen hos pasienter med tidlig stadium (Gleason 6) prostatakreft (PCA), som er for det meste lat men ofte unødvendig behandles.
Materialer og metoder
Vi har tidligere utviklet delvis bølgespektroskopi-mikroskopi ( PWS) som muliggjør kvantifisering av nanoskala intracellulære arkitektur (20-200nm lengde skala) med bemerkelsesverdig nøyaktighet. Vi tilpasset denne teknikken til å vurdere prostata nål kjerne biopsier i en kasus-kontrollstudie fra menn med Gleason 6 sykdom som enten progrediert (n = 20) eller forble lat (n = 18) over et ~ 3 års oppfølging. Vi målte parameter lidelse styrke (LD) karakteriserer den romlige heterogeniteten av nanoskala cellestruktur og kjernefysisk morfologi fra mikroskopisk normal slimhinne ~ 150 histologisk normale epitelceller.
Resultater
Det var en dyp øke i nano-arkitektonisk lidelse mellom progressors og ikke-progressors. Faktisk Ld fra fremtidige progressors ble dramatisk økt i forhold til fremtidig ikke-progressors (1 ± 0,065 versus 1,30 ± 0,0614, henholdsvis p = 0,002). Arealet under mottageroperatøren karakteristiske kurven (AUC) var 0,79, noe som ga en følsomhet på 88% og spesifisitet på 72% for å skille mellom progressors og ikke-progressors. Dette ble ikke gjort til skamme av demografiske faktorer (alder, røykestatus rase, fedme), og dermed støtter robustheten av tilnærming.
Konklusjoner
Vi viser for første gang at nano- arkitektoniske endringer forekommer i kreft felt prostata kreftutvikling og kan utnyttes for å forutsi prognose av tidlig stadium PCa. Denne tilnærmingen har løftet i adressering klinisk irriterende dilemma med styring av Gleason 6 PCa og kan gi et paradigme for å håndtere større problem for kreft diagnostikk
Citation. Roy HK, Brendler CB, Subramanian H, Zhang D , Maneval C, Chandler J et al. (2015) Nanocytological Feltet Karsinogenese gjenkjenning til å dempe Overdiagnostikk av prostatakreft: En Proof of Concept Study. PLoS ONE 10 (2): e0115999. doi: 10,1371 /journal.pone.0115999
Academic Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 07.11.2014; Godkjent: 21 november 2014; Publisert: 23 februar 2015
Copyright: © 2015 Roy et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. arbeidet ble støttet av National Institutes of Health U01CA111257 HR, VB, https://nih.gov/; National Institutes of Health R01CA156186, HR, VB, https://nih.gov/; National Institutes of Health R01CA165309, HR, VB, https://nih.gov/; National Institutes of Health R01CA128641, HR, VB, https://nih.gov/; National Institutes of Health R01CA155284, HR, VB, https://nih.gov/; National Institutes of Health R42CA168055, HR, VB, https://nih.gov/; og John og Carol Walter Senter for Urologiske Helse, CB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Drs. Roy, Subramanian og Backman er co-grunnleggerne av Nanocytomics LLC og administrert av interessekonflikten komiteer av Boston University og Northwestern University. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Overdiagnostikk er en voksende avskrekkende mot implementering av kreft befolkningen screening [1]. Påvisning av lat /klinisk ubetydelig sykdom utløser ofte en myriade av skade fra unødvendige diagnostiske /terapeutiske intervensjoner inkludert kostnader, ubehag og komplikasjoner [2]. Prostatakreft (PCA) illustrerer dette conundrum i at det resulterer i ~ 30.000 dødsfall i amerikanere, men ~ 60% av alle menn 80 år gammel forresten havna denne malignitet [3]. Den utstrakte bruken av serum prostata spesifikt antigen (PSA) for PCa screening har aksentuert påvisning av klinisk-indolente kreft. Siden skadene av behandling tidlig stadium (T1c /T2a), lavgradig (Gleason 6) sykdom (den vanligste PCa presentasjon) generelt oppveier fordelene, mange kliniske samfunn nå anbefaler å utsette operasjonen til fordel for aktiv overvåking, noe som innebærer tett overvåking med serie prostatabiopsier [4]. Dessverre, gitt tilfeldighetene forutsi oppførselen til en persons PCa (med potensial progresjon til dødelig sykdom), bare ~ 10% av godkjente menn faktisk gjennomgå aktiv overvåking [5]. Derfor blir bedre prognostication verktøy sterkt behov for å gjøre denne strategien mer akseptabel for både pasienter og deres leger [6].
En voksende metode for risikovurdering er gjennom å utnytte feltet kreftutvikling. Feltet kreftutvikling (aka feltet cancerization, etiological felt effekt, felt av skader etc.) er en veletablert fenomen i kreft biologi som et samlings neoplastisk lesjon utvikler seg i en ettergivende mutasjons miljø fra samspillet mellom genetisk underlaget og eksogene faktorer (kosthold, fedme , røyking, diabetes osv) [7-9]. Disse endringer kan forekomme i den epiteliale og /eller stroma [10]. Fra et klinisk perspektiv, er feltet cancerization med tilhørende synkrone /metachronous lesjoner mye brukt for behandling av neoplasi i tykktarm, lunge, hode og nakke etc. Mens mindre godt utforsket i prostata, det er overbevisende bevis for feltet kreftutvikling som multi- focality og abnormiteter i molekylære markører (f.eks genekspresjon, metylering, mikroRNA, fisk, mitokondrielle endringer) sett i mikroskopisk normal epitel hos pasienter som harbor dette malignitet. [11-15]
Vår gruppe har utviklet en ny optikk teknologi, delvis bølge spektroskopiske mikroskopi (PWS), eller nanocytology, som tillater kvantifisering av cellestruktur på nanometer lengdeskala. [16] Vi har benyttet PWS nanocytology for påvisning av nano arkitektoniske konsekvensene av de diffuse genetiske /epigenetiske forandringer som er kjennemerket på feltet kreftutvikling. Vi har tidligere vist at PWS utspørring av normal epitel nøyaktig forut risikoen for tykktarms [17] lunge [18], spiserør [19], bukspyttkjertel [20] og eggstokk-kreft [21]. For å tilpasse denne BioPhotonic gjennombrudd for å PCA ønsket vi å målrette den mest irriterende problemet, styring av tidlig stadium (Gleason 6 sykdom). Siden dette er vanligvis diagnostisert ved nålebiopsi, hypotese vi at nanocytological avhør av mikroskopisk normal prostata epitel ville forutsi prognose hos menn med tidlig stadium (Gleason 6) sykdom som gjennomgår aktiv overvåking.
Materialer og Metoder
Pasienter
Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board på Northshore Universitetet Health. Prøvene ble hentet fra Northshore Universitetet aktiv overvåking rettssaken startet i november 2008. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra deltakerne. Inklusjonskriteriene for kohort av pasienter som følger med: 1) alder ≥60; 2) klinisk stadium ≤T2a; 3) score Gleason (grad) 7; 4) ≤ 3/12 positive kjerner på initial biopsi; og 5) 50% lineær involvering av en enkelt kjerne. Pasientene gjennomgikk sin første overvåking biopsi 6-12 måneder etter innmelding. Progresjon ble definert som enhver endring i kriteriene 3, 4 eller 5. Trettiåtte pasienter ble tilfeldig valgt fra databasen pasienter avgjøres som progressors og ikke-progressors av Chief studien urolog (CBB).
Prøve Procurement og klargjøring
transrectal biopsier ble oppnådd under tredimensjonale (3-D) ultralyd veiledning. Fire av disse kjernene ble utpekt som forskningsbasert og ble løst i en alkohol-basert fiksativ og parafin-embedded. Fire mikrometer seksjoner ble kuttet ut ladde glassplater og deparaffinized for PWS. Hematoxylin og eosin (H & Co. E) delene ble gjennomgått av studien patologen (MP) for å lede den PWS analyse mot ikke-maligne vev
Oversikt over PWS
I korthet, som tidligere beskrevet. PWS markør uorden styrke (Ld), er proporsjonal med middelverdi og standardavvik av de romlige variasjoner av den makromolekylære tettheten av de grunnleggende cellulære byggesteinene (proteiner, nukleinsyrer, lipider). Dermed Ld, på folkemunne, kan beskrives som å måle «clumpiness» av nanoskala struktur. Vi har vist at PWS er følsom for strukturer fra 20 til 200 nm gjennom spektralanalyse av interferens spektra av lys reflektert fra intracellulære brytningsindeks-variasjoner innenfor mikroskopisk rom-tid-koherens volum, i motsetning til typiske lysmikroskopi hvis oppløsning er begrenset 200- 500 nm, diffraksjonsgrensen av lys. Således er histologi ufølsom for mange strukturer som er kjent for å være involvert i begynnelsen av karsinogenese (makromolekylære komplekser, ribosomer, mitokondrier av høy orden kromatin etc.) som kan være PWS påvisbar. Tidligere har vi vist at PWS var i stand til å forutsi risikoen for tykktarm, lunge, spiserør, bukspyttkjertel og eggstokkreft [22].
PWS datainnsamling og analyse
PWS analyse ble utført som tidligere rives. Regioner av interesse ble identifisert (histologisk normale kjertler) av patologen og beregnet over ~ 30 regioner per pasient lysbilde undersøkt (~ 50K-75K piksler eller ~ 150 celler). Operatøren har ikke klinisk informasjon til noen av de 38 prøvene. Men klinisk informasjon var tilgjengelig for teknologiske etterforskere i den første 18 ( «blindet»), men ikke de siste 20 ( «blindet») prøver ble utført i de første 18 pasientene, men ikke den siste 20.
Statistisk metoder
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SAS 9.3 (SAS Inc., Cary, NC). Pasient demografi ble sammenlignet mellom progressors og ikke-progressors bruker t-test (for kontinuerlige variabler) og Chi-kvadrat test. En standard to-halet t-test (forutsatt at ulike variasjoner) og analyse av kovarians (ANCOVA) ble utført for å sammenligne Ld mellom progressors og ikke-progressors med en p-verdi ≤0.05 ansett statistisk signifikant. Effektstørrelsen ble beregnet ved hjelp av Cohens
d
: der
μ
1 og
μ
2 er midlene for progressors og ikke-progressors og
σ
1 og
σ
2 er tilsvarende standardavvik, henholdsvis. Studien statistiker (CHW) også utført mottaker operatør karakteristikk (ROC) for å vurdere sensitivitet og spesifisitet av PWS i differensiere progressors og ikke-progressors for PCa i aktiv overvåking.
Resultater
Cohort
Vi har registrert to sett med pasienter, en innledende kohort av 18 pasienter (8 ikke-progressors og 10 progressors) der PWS operatøren ble blindet klinisk status, men, etterfulgt av en distinkt gruppe av 20 pasienter (10 Progressor og 10 ikke-progressors) der vår PWS analyse ble utført av etterforskere blindet til gruppen. De demografiske faktorene er oppført i fig. 1. Median lengde oppfølgingstid var 34,2 måneder, gjennomsnittsalder 66,5 ± 5,6 år, og mener BMI 28,1 ± 4,0. Det var ingen signifikante forskjeller i pasientens karakteristika mellom progressors og ikke-progressors.
PWS Analyse av prostatavevet §§
PWS ble utført i histologisk normale kjertler identifisert av vår patolog. Som det fremgår av lyse felt bildebehandling, vi primært rettet epitel inntil kjertler for den definerte regionen av interesse. Mens det var ingen synlig forskjell på den lyse feltet, var det en markert økning i Ld (mer rødt i pseudocolor kart) i progressors versus ikke-progressors (Fig. 2).
De lyse felt bilder fra ikke- progressors (a) og progressors (b) er utvisket på de første overvåkings biopsier. Men PWS bildene i progressors viser markant høyere Ld (f.eks røde områder) sammenlignet med ikke-progressors, indikerer dype nano arkitektoniske forandringer i patologisk normal prostata epitel. Median lengde oppfølgingstid var 34,2 måneder.
Mean per pasient Ld i progressors versus NonProgressors
Vi beregnet gjennomsnittlig Ld fra regionen av interesse per pasient. Forhøyet Ld har vært et kjennetegn på neoplastisk transformasjon i en rekke organer [20]. Cohen d effekt størrelsen på gjennomsnittlig celle Ld i denne case-control studie var 110% (Fig. 3) med en signifikant forskjell mellom progressors og ikke-progressors (p = 0,002). Vi analyserte halve datasettet i en blindet mote og bemerket at AUC var tilsvarende blindet prøver (0,81 versus 0,75, henholdsvis), som støtter robustheten metodikk. Den kombinerte datasettet ga en følsomhet på 88% og spesifisitet på 72%, (fig. 4), mens den forblindet datasettet alene (n = 20) ad en sensitivitet på 100% og en spesifisitet på 70%. Disse sterke diagnostikk representere minimal ytelse egenskaper, med fremtidige forbedringer (f.eks analysere separat cytoplasma versus atom Ld og epitel versus stromal Ld) lover å forbedre diskriminerende evne.
Median oppfølgingstid var 34,2 måneder.
Dette oversettes til en sensitivitet = 88% og spesifisitet = 72% for å skille mellom progressors og ikke-progressors.
Potensielle confoundere
Siden kliniske faktorer (for eksempel alder, rase [23,24], BMI [25], og røyking [26]) kan modulere PCa aggressivitet, utførte vi analyser av samvariasjon (ANCOVA) som sammenligner Ld mellom progressors og ikke-progressors mens kontrollere for disse potensielle confounders. Noe overraskende (basert på tidligere litteratur) [27], serum prostata spesifikt antigen var kjent for å være mer opphøyet i progressors enn nonprogressors, selv om statistisk analyse viste at dette ikke innvirkning på Ld diagnostiske evne.
Diskusjoner
den kliniske behov for å differensiere aggressive fra lat PCa er klart siden det er anslått at 233.000 amerikanske menn er diagnostisert årlig med PCA men bare 29 480 er anslått til å dø (fortsatt den nest største årsaken til mannlige kreftdødsfall) [28] . Mens PSA screening har blitt mye praktisert, skadene knyttet til diagnostisering og behandling av klinisk indolent sykdom har ført USA Preventive Services Task Force til nylig anbefale mot PSA screening [29].
Spørsmålet om overdiagnostikk presenterer nå et stort hinder for kreft screening i andre kreftformer også, inkludert mammografi for brystkreft og lavdose computertomografi (LDCT) scanning for lungekreft [1]. Faktisk, mens LDCT resulterte i en 20% reduksjon i lungecancerdødsfall i en høy risikogruppen, mer enn 95% av positive var falsk positiv [30]. Viktigere, har nanocytological felt karsinogenese deteksjon blitt vist å være nyttige i screening for en rekke kreftformer som manifest felt carcinogenese (colon, lunge, spiserør, bukspyttkjertel, eggstokk etc) [19-22,31]. En av de viktigste nye aspekter av denne studien er at det er den første til ikke bare å vurdere tilstedeværelse /fravær av tumor (screening), men heller prognose. Dette har blitt fostret av vår evne til å overvinne tekniske utfordringer og faktisk utfører PWS nanocytology på intakte vevssnitt (de tidligere rapporterte studiene var alt fra cytologiske pusseøkter). Således representerer PWS nanocytology en plattform teknologi som kan anvendes for screening /forutsigelse av et stort antall av maligniteter.
Vår fremgangsmåte for å utnytte feltet karsinogenese er spesielt apropos for PCa gitt sin multifokal natur. Faktisk er Gleason score beregnes ved å vurdere karakteren av de vanligste og nest mest vanlige (eller mest aggressive) klone. Mens vurdere enkelte kreft kloner (f.eks 3-genet immunhistokjemiske signatur) kan korrelere med den naturlige historien til noen PCa [32], gitt klonal heterogenitet mest PCa og semi-kvantitativ natur av disse testene, kan de ha begrenset klinisk nytte. Intuitivt er potensielt mer attraktivt enn å fokusere på genetiske signaturer hentet fra prøver som inneholder bare PCa analyse feltet kreftutvikling innen prostata prøver med eller uten PCA som for tiden tilbys av tester som Oncotype Dx, Prolaris, Decipher etc. [33]. Det har vært mange andre felteffektmarkører (metylering, mikroRNA, genekspresjon) med antatt prognostisk evne, om enn resultatene hittil har vært beskjeden [13,33,34]. Vurdere nano-arkitektur er spesielt kraftig siden det gjenspeiler den endelige fellesnevner utover konvergerende ulike molekylære stier. Mens andre modaliteter (transmisjonselektronmikroskopi [35] eller karyometry [36] har notert unormalt, deres utnyttelse som klinisk verktøy er ikke gjennomførbart. Evnen til å destillere PWS informasjon til én biomarkør (LD) har betydelig appell fra både en praktisk og robust perspektiv . videre kvantifiserer PWS nano-arkitektur av spesifikke avdelinger samt hele cellen
Vårt tidligere arbeid på nanocytological feltet kreftutvikling har vært å vurdere tilstedeværelse av neoplasi,. dermed representerer denne rapporten et nytt stort program for denne tilnærmingen, dvs. prognostication. Intuitivt det virker logisk å tro at feltet kreft profilering kan være mer lovende enn å fokusere på svulsten alene på grunn av multi-klonalitet som er kjennetegn for prostatakreft. Faktisk er Gleason score basert på karakteren av de vanligste og deretter enten neste vanligste eller mest aggressive klone. Dermed ville det være uklart hvilke klone å analysere eller hvordan å syntetisere genuttrykk data fra en rekke kloner. Vårt arbeid paralleller noen av dataene med leverkreft (en annen hyppig multifokal sykdom) som profilering av uninvolved hepatocytter spådd tilbakefall i leveren etter reseksjon. [37]
Biologisk, er økt cellulær nano-arkitektoniske lidelse nært knyttet til molekylære hendelser. Fra et fysisk perspektiv, innebærer en økt Ld «clumpiness» på 20-200 nm lengdeskala. Disse lengdeskalaer omfatte strukturer som strekker seg fra makromolekylære komplekser til små organeller. I kjernen, er uorden styrke (Ld) et mål på høy orden kromatin organisasjon, som påvirker på flere prosesser som kontrollerer genekspresjon. ,, I å holde denne dette, har vi vist at atom Ld korrelerer med transkripsjonen aktivitet [38]. I feltet carcinogenesen er det vel etablert at genuttrykk endres [37,39]. Videre har forskjellige gen forandringer blitt vist å bli forandret i prostata felt karsinogenese. Imidlertid, gitt den genetiske heterogenitet i tumorer, å finne den nøyaktige genet matrisen er vanskelig. Siden det ser ut til at nano-arkitekturen kan være en «endelig fellesnevner» til mylderet av genetiske /epigenetisk endringer tidlig i kreftutvikling, bør det være spesielt kraftig. [20] I cytoplasma, de faktorer som bestemmer er mer variert, men et overordnet tema er cytoskeletal organisasjon [40]. Tallrike cytoskeletal proteiner (f.eks glatt muskulatur gamma-aktin) har vist seg å være dysregulerte i prostata epitelet, noe som ytterligere støtter relevansen til PCa [41].
Det er mange sterke sider av denne undersøkelse, inkludert den innovative natur og brønn -characterized, prospektivt fulgt kohort av menn som gjennomgår aktiv overvåking. Den kliniske nyhet inkluderer bruk av feltet kreft å forutsi naturhistorie i tidlig stadium PCa. Fra et biologisk perspektiv, gir dette viktig innsikt i forandringer nano byggverk i tidlig kreftutvikling. Teknologisk denne studien ikke bare brukes PWS å vurdere prognose, snarere enn bare tilstedeværelse av svulst, men også overvant utfordringen med å utføre nanocytology på hele vevssnitt.
Svakheter som trenger å bli anerkjent omfatte beskjedne gruppestørrelse og følge opp. På den annen side er denne studien representerer gullstandarden med prøvene som er samlet inn i en sonde lignende måte (eksempler fremad oppsamlet og siste halvdel av datasettet blindet, gitt at selv i blindet datasettet undersøkeren ansvarlig for datainnsamling var uvitende om den kliniske status, det er ingen mulighet for skjevhet). En annen potensiell svakhet med denne studien var mangel på klinisk entydige endepunkter, f.eks metastaser eller død fra PCa. Begge disse endepunktene, men ville kreve minst 10 år med oppfølging og ville derfor være upraktisk. Videre vår definisjon av progresjon (økt Gleason scorer eller økt volum av kreft) er godt validert og mye brukt i klinisk praksis.
I konklusjonen, viser vi at det er dyptgripende nano arkitektoniske endringer i kreft feltet prostata kreftutvikling. Vurdering av dette gjennom PWS nanocytology kan representere en kraftig biomarkør for å forutsi utviklingen for menn med tidlig stadium PCa. Denne tilnærmingen kan gjøre PCa befolkningen screening mer levedyktig ved å dempe skadene knyttet til identifisering av lat sykdom. Dessuten, denne bevis på prinsippet studie antyder at PWS nanocytology potensielt kan ha en rolle i den kliniske armamentarium mot screening diagnostikk conundrum for en rekke kreftformer.
Takk
Forfatterne takker Ms Beth Parker for god støtte i manuskriptet forberedelse.
