Abstract
cardiotonic steroider brukes til å behandle hjertesvikt og arytmier og har lovende kreft effekter. Den prototypiske cardiotonic steroid ouabain kan også være et hormon som modulerer epitelceller vedheft. Kardiotoniske steroider består av en steroidkjerne og en laktonring, og deres biologiske effekter er avhengig av binding til sin reseptor, Na, K-ATPase, gjennom hvilken, de hemmer Na
+ og K
+ ionetransport og aktivere av flere intracellulære signalveier. I denne studien, tilsatte vi en styren gruppe til laktonringen av den kardiotoniske steroid digoksin, for å oppnå 21-benzyliden digoksin (21-BD), og undersøkte effekten av denne syntetiske kardiotonisk steroid i forskjellige cellemodeller. Molekylær modellering viser at 21-BD binder seg til målet Na, K-ATPase med lav affinitet, vedta en annen pharmacophoric konformasjon når de er bundet til sin reseptor enn digoksin. Følgelig, 21-DB, ved relativt høye uM mengder hemmer aktiviteten til Na, K-ATPase-a
1, men ikke a
2 og a
3 isoformer. I tillegg er rettet mot 21-BD andre proteiner utenfor Na, K-ATPase, begrenser for multi eksportør Pdr5p. Når den anvendes på hele celler ved lave uM-konsentrasjoner, gir 21-BD flere effekter, inkludert: 1) oppregulering av Na, K-ATPase-ekspresjon og aktivitet i HeLa og RKO kreftceller, som ikke er funnet for digoksin, 2) celle spesifikke endringer i cellenes levedyktighet, og reduserer den i HeLa og RKO kreftceller, men øker den i normale epitelceller MDCK-celler, som er forskjellig fra responsen til digoksin, og 3) endringer i celle-celle-interaksjon, å endre den molekylære sammensetning av tett veikryss og heve transepitelial elektrisk motstand av MDCK-monolag, en effekt som tidligere er funnet for ouabain. Disse resultater indikerer at modifikasjon av laktonringen av digoxin bringer nye egenskaper til forbindelsen, og viser at den strukturelle endring innføres kunne brukes til utforming av kardiotonisk steroid med nye funksjoner
relasjon:. Rocha SC, Pessoa MTC, Neves LDR, Alves SLG, Silva LM, Santos HL, et al. (2014) 21-benzyliden Digoksin: En proapoptotiske Cardenolide av kreftceller som oppregulerer Na, K-ATPase og Epithelial tett veikryss. PLoS ONE 9 (10): e108776. doi: 10,1371 /journal.pone.0108776
Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA
mottatt: 07.04.2014; Godkjent: 25 august 2014; Publisert: 07.10.2014
Copyright: © 2014 Rocha et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av FAPEMIG (Fundação de Amparo en Pesquisa do Estado de Minas Gerais) APQ-01114-12, APQ-02596-12 , CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) 472394 /2012-6 og NIH DK081431. Forfatterne er takknemlige for den finansielle og strukturelle støtte som tilbys ved University of São Paulo gjennom NAP-CatSinQ (Research Kjerne i Katalyse og kjemisk syntese). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
cardiotonic steroider er vanlige stoffer i planteriket som gi et konkurransefortrinn mot rovviltskader, enten til anlegget som syntetiserer dem, eller til dyrene som samler dem fra kostholdet [1]. Noen eksperimentelle bevis viser at dyrene kan endogent syntetisere hjerte steroider, og at disse stoffene spiller en viktig rolle i reguleringen av blodtrykket, celleproliferasjon og celledød [2], [3]. Den grunnleggende strukturen av kardiotoniske steroider består av en steroidskjelettet med et cis /trans /cis-konfigurasjon og en lakton rest i posisjon 17β, også kjent som aglykon. I tillegg er disse forbindelser har ofte en sukker festet i posisjon 3β av steroidkjernen, for hvilke de er kjent som hjerteglykosider. Naturen av laktonringen skiller de cardenolides, som har en umettet butyrolakton ring, fra bufadienolides, som presenterer en α-pyron ring. Den eneste strukturelle forskjellen mellom de to hoved cardenolides som brukes terapeutisk, digoksin og digitoksin, er en enkelt ekstra hydroksylgruppe (-OH) på digoksin, som vesentlig endrer dens farmakokinetikk. Digitoksin, er mer lipofilt, viser sterk binding til plasmaproteiner, er nesten utelukkende metaboliseres i leveren og oppviser en meget lang halveringstid. I motsetning til digoksin viser svake binding til plasmaproteiner, er det ikke i stor grad metabolisert og skilles ut i et hovedsakelig uforandret form via nyrene [2], [3].
Hoved farmakologiske effekten av terapeutiske doser av digoksin og digitoksin er deres positive inotrope effekt. Dette er mediert gjennom hemming av det myokardiale cellen Na, K-ATPase, noe som resulterer i en økning i nivåene av cytosoliske Na
+ og sekundært Ca
2+, på grunn av reduksjon i transport av Na
+ avhengige Na
+ /Ca
2 + leren. Den økte Ca
2+ i den myokardiale cellens cytosol fører til ytterligere fylling av det sarkoplasmatiske retikulum med Ca
2+, som vil være lett tilgjengelig for sin utløsning ved stimulering for å frembringe forbedret muskelsammentrekning [3] – [5 ]
i sammenheng med cellebiologi, er det to områder hvor hjerte steroider er av potensiell interesse:. kreft og celleadhesjon. Begge disse fenomener er nært beslektet, som vist ved tap av celleadhesjon som finner sted i løpet av kreft proliferasjon og metastase. Effekten av hjerte steroider på celle adhesjon er dårlig forstått, og er fokus for intens forskning [6] – [8]. Siden 1960-tallet har flere interessante antitumor effekter er observert for digitalis [9], [10], så vel som for andre cardenolides [11] – [15] og de relaterte hjerteglykosider, de bufadienolides [16] – [19].
human kreft hovedsakelig påvirker epitel [20], hvilke celler er sterkt polarisert og bundet til hverandre gjennom synaptiske komplekser, deriblant tett veikryss (TJs). Denne siste struktur overfører epitel deres evne til å fungere som effektive barrierer i separeringen av biologisk kamrene [21]. Tap av TJs er involvert i kreftutvikling og metastase [6], [22], for eksempel, en reduksjon i ekspresjonen av det stramme koblings proteinet claudin (CLDN) -7, er involvert i formidling av brystkreftceller [23] . Videre har betydningen av Na, K-ATPase for dannelse av synaptiske komplekser blitt godt etablert [24], [25], som er kravet om celle-celle-kontakter for den polariserte ekspresjon av Na, K-ATPase i lateral plasmamembranen til epitelceller [26]. Interessant, β
en subenhet av Na, K-ATPase i seg selv virker som et celleadhesjonsmolekyl i astrocytter [27] og epitel [28] – [31]
En reduksjon i celleoverflate-ekspresjon av. den β
en subenhet har vært forbundet med epitelial-til-mesenchymale overgang, en prosess som er involvert i tumor invasivitet og metastase [25], [32]. Behandling med flere typer hjerte steroider fører til ulike effekter på celle veikryss. Høye konsentrasjoner av ouabain (≥300 nM) og andre hjerte steroider forstyrre stramt, adherens og kommuniserende veikryss samt desmosomes av epitelceller [24], [33], [34]. Tvert imot, lave konsentrasjoner av ouabain (10 nM) øke tetningen av TJS [35], akselerere celle polaritet (som bestemt ved utviklingen av primær cilia [36]), og øke cellekommunikasjon gjennom kommuniserende veikryss [30].
Selv om studier på de biologiske effektene av tilgjengelige hjerte steroider på kreftceller er i rask utvikling, er dette ikke tilfelle for nye syntetiserte kardio steroider. Noen syntetiske kardiotoniske steroider har blitt testet for deres antikreft-aktivitet [17], [37] – [44]. Oleandrin og 9-hydroxy-2 «oxovoruscharin, en hemi-syntetisk cardenolide, er under kliniske forsøk og har vist anticancer aktivitet både
i
vitro Hotell og
i
vivo
, i multiresistens kreftceller kulturer [15], [43], [44]. Andre studier har vist at en rekke modifikasjoner av sukkerdelen av digoksin og digitoksin, kan øke den anticancer virkning av disse forbindelser [45] -. [48]
Flere forfattere har beskrevet syntesen av digoxin-derivater, i hvilken tilsetn av styren-grupper til laktonringen delen produsert noen interessant biologisk aktivitet [49], [50]. Men det er ennå ikke meldt om anticancer aktivitet eller effekten av disse digoksin derivater på Na, K-ATPase aktivitet.
Formålet med dette arbeidet var å studere biologiske effekter av 21-benzylidene digoksin (21 -BD), en digoksin-derivat med ytterligere styren gruppe i C21 karbon av laktonringen, i kreft og normale celler.
Materialer og metoder
Generell fremgangsmåte for syntese av 21- benzyliden digoksin
Benzaldehyd (0,18 ml, 1,8 mmol), digoksin (0,469 g, 0,6 mmol), vannfritt K
2CO
3 (0,249 g, 1,8 mmol) og 60 ml metanol ble det tilsatt inn i en rundbunnet kolbe. Etter omrøring i 6 timer ved 70 ° C, oppløsningsmidlet ble avdampet i en rotasjonsfordamper. Det urene produkt ble fortynnet med 20 ml vann og ekstrahert med varm etylacetat (3 x 30 ml). Det organiske laget ble vasket med saltoppløsning, tørket over vannfritt Na
2SO
4 og konsentrert under vakuum. Det urene produkt ble deretter renset ved silikagel-kolonnekromatografi (CH
2 Cl
2 /MeOH 11:01). Etter rensing ble det rene produkt fortynnet i tetrahidrofurano (THF), utfelt med heksan og konsentrert under redusert trykk for å gi 21-BD (0,325 g, 0,37 mmol, 62%) som et hvitt, fast stoff.
Cellekultur
HeLa (human cervix-karsinom, ATCC CCL2) og RKO-AS45-1 (colon carcinoma, ATCC CRL-2579) celler ble dyrket i RPMI eller i DMEM /HAM F-10 (01:01) medium (Sigma , St. Louis, MO, USA). CHO-K1 (ATCC CCL61) og MDCK-II-celler (hundenyre; ATCC CCL-34) ble dyrket i DMEM. Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone) (CDMEM), 60 mg /ml streptomycin og 100 mg /ml penicillin. Celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
5 celler /cm
2 og inkubert i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. Dyrkningsmediet ble skiftet hver 48 timer for å unngå næringsutarming.
insektcellekultur og virale infeksjoner
Sf-9 insektceller ble dyrket i Grace medium med 3,3 g /l lactalbumin-hydrolysat, 3,3 g /l yeastolate, og supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 0,25 ug /ml Fungizone. Celler ble dyrket i suspensjonskulturer og ble overført til 150 mm vevkulturplater før infeksjon. Infeksjoner ble utført som tidligere beskrevet [51]. Etter 72 timer ved 27 ° C, ble cellene skrapet fra kulturplater, sentrifugert ved 1500 x
g
i 10 min og suspendert i 10 mM imidazol-hydroklorid (pH 7,5) og 1 mM EGTA. Celler ble homogenisert på is ved anvendelse av en Potter-Elvehjem-homogenisator og lysatet ble sentrifugert i 10 minutter ved 1000 x
g
. Supernatanten ble fjernet, sentrifugert i ytterligere 10 min ved 12.000 x
g
, og den endelige pelleten ble suspendert i 250 mM sakkarose, 0,1 mM EGTA og 25 mM imidazol-HCl, pH 7,4.
cytotoksisitet assay
forbindelse cytotoksisitet virkning ble vurdert ved anvendelse av MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) tetrazoliumsalt kolorimetrisk metode (Sigma, St. Louis , MO, USA). I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater (1 x 10
5-celler /brønn) og inkubert i 24 timer ved 37 ° C til konfluens. Deretter ble brønnene vasket med kulturmedium og digoksin eller 21-BD ble tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner (0,05 til 500 uM). Etter inkubering i 24 eller 48 timer ble platene behandlet med MTT. Målingene ble utført i en Spectramax M5E mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) ved 550 nm. Cytotoksisitet ble scoret som den prosentvise reduksjon i absorbans i forhold til ubehandlede kontrollkulturer [52]. Alle forsøk ble utført in triplo. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittet av LC
50 (legemiddelkonsentrasjonen som redusert celleviabilitet til 50%).
apoptose analysen
Comet assay.
enkeltcelle gelelektroforese assay (komet assay) ble utført i henhold til tidligere publiserte protokoller [53], [54]. For dette ble CHO-K1-celler ble behandlet med 20, 35 eller 50 uM digoksin eller 21-DB, som er konsentrasjonen som ikke endrer cellenes levedyktighet i henhold til MTT-analysen. Cellene ble sådd ut i 24-brønners plater. Den neste dagen ble cellene vasket to ganger med PBS, og inkubert i 3 timer med de tilsvarende forbindelser i kulturmedium uten serum. De negative og positive kontrollgrupper som ble behandlet med PBS, og metylmetansulfonat (400 uM), respektivt. Etter 24 timer ble cellene vasket to ganger med PBS og frittliggende ved hjelp av en trypsin-EDTA-oppløsning. Trypsin ble inaktivert med 3,0 ml komplett medium, etterfulgt av sentrifugering (5 minutter, 150 x
g
). Pelleten ble deretter resuspendert i 500 ul PBS, og 30 pl aliquoter av cellesuspensjoner ble blandet med 70 ul av lavt smeltepunkt agarose (0,5%). Disse blandingene ble plassert på objektglass på forhånd belagt med normal smeltepunkt agarose (1,5%) og dekkes med dekkglass. Objektglassene ble tatt ut etter fem minutter, og objektglassene ble nedsenket over natten i lyseringsoppløsning (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, Tris 10 mM, pH 10, Triton X-100 1% DMSO og 10%). Deretter Objektglassene ble vasket med PBS og holdt i 40 minutter i en horisontal elektroforese boks fylt med kald alkalisk buffer (EDTA 1 mM, NaOH 300 mM, pH 13). Elektroforese ble utført ved 0,86 V /cm og 300 mA (20 minutter), og objektglassene ble deretter nøytralisert (0,4 M de Tris, pH 7,5), fiksert med metanol og farget med etidiumbromid. Visuelle analyser ble utført under fluorescens [55], [56].
Phosphatidylserine trans.
HeLa-celler ble sådd ut i 60 mm diameter petriskåler ved samløpet og inkubert over natten i CDMEM. De ble deretter behandlet med 2 uM digoksin eller 50 uM 21-BD i CDMEM til 6, 12 eller 24 timer. Etter inkubering ble cellene suspendert gjenvunnet fra mediet ved sentrifugering ved 150 x
g
, 20 ° C i 5 minutter. Festede celler ble oppnådd ved en mild behandling protease 1 ml Accutase pluss 3 ml PBS), sentrifugert som angitt ovenfor og tilsatt til cellene oppnådd fra mediet. Annexin-V bundet til den ytre paknings av plasmamembranen ble målt med en kommersielle kit (annexin-V-Fluos Stainig kit, Roche, Tyskland) ved å følge produsentens instruksjoner. I korthet, ble cellesuspensjonen inkubert med en blanding av Annexin-F-FITC og propidiumjodid i saltvannsbuffer i 15 min. Cellesuspensjonen ble analysert ved flowcytometri (FACSCalibur flowcytometer, Fow Jo programvare).
transepitelial elektrisk motstand (TER)
MDCK celler ble dyrket på Transwell permeable støtter (3415, Corning Inc., NY, USA) den transepitelial elektriske motstanden ble målt med en EVOM og EndOhm-seks system (World presisjonsinstrumenter, Sarasota, FL, USA). Endelige verdier ble oppnådd ved å subtrahere motstanden i badeløsningen og den tomme innsatsen. Resultatene er uttrykt i ohm cm ·
2 (Ω · cm
2) i prosent av kontrollen.
Immunofluorescence
Etter TER målinger, MDCK monolagene ble vasket tre ganger med iskald PBS /Ca
2+, fiksert med 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved 4 ° C, permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i 5 minutter, blokkert i 30 minutter med 3% BSA og behandles for 1 time ved 37 ° C med et spesifikt primært antistoff. Monolagene ble så renset 3 ganger med PBS /Ca
2+, inkubert med en passende FITC eller trict-merkede antistoffer for 30 minutter ved romtemperatur og renset som angitt ovenfor. Filtre med cellene ble skåret med en skalpell og montert i Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA, USA). Preparatene ble undersøkt med en Leica konfokal SP5 mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Bildene ble importert til FIJI, versjon 2.8 (National Institutes of Health, Baltimore, USA), for å oppnå maksimal anslag og inn i GNU Image Manipulation Program (GIMP) å normal lysstyrke og kontrast på alle bildene og lage figurer.
Immunoblotting
Western blot-analyse av hel-celle-proteinekstrakter ble utført som beskrevet tidligere [57]. Kort sagt ble MDCK og HeLa-celler vasket med PBS og oppløseliggjort med radioimmunopresipitasjonsanalyse analyse (RIPA) buffer [10 mM piperazin
N
,
N «
-bis (2-etansulfonsyre), pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM etylen-(EDTA), 1% Triton X-100, 0,5% natrium deoxicholate, og 10% glycerol] inneholder proteasehemmere (Komplett Mini, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Proteininnholdet av cellelysatet ble målt (BCA-proteinanalyse-reagens; Pierce Chemical, Rockford, Illinois) og fremstilt for SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (PAGE) ved koking i prøvebuffer. De løste proteiner ble electrotransfered til en polyvinylidendifluorid membran (Hybond-P; GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Storbritannia). Proteinene av interesse ble deretter påvist med den spesifikke polyklonale eller monoklonale antistoffer som er angitt i hvert enkelt tilfelle, fulgt av arts passende konjugert antistoff (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) og kjemiluminescens deteksjon (ECL PLUS, GE Healthcare).
Påvisning av Na, K-ATPase og claudin uttrykk via real-time kvantitativ RT-PCR
for sanntids kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR), ble total RNA ekstrahert fra cellen prøver ved hjelp TRIzol (Life-teknologi, USA). Konsentrasjonen ble beregnet via spektrofotometri med et Nanodrop ND2000 (Thermo Scientific, USA). Alle revers transkriptase reaksjoner ble utført ved anvendelse av 5 ug av RNA med Superscript III settet (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Alle RNA-prøvene ble reverstranskribert samtidig for å minimalisere interanalysevariant knyttet til reverstranskripsjonsreaksjon. Sanntids kvantitativ PCR ble utført på en ABI Prism 7500 rask rekkefølge deteksjonssystem (Applied Biosystems) under anvendelse av Taq-Go qPCR masterblanding (Promega, USA). Følgende primere og konsentrasjoner ble benyttet (Murphy et al, 2004): Na, K-ATPase α
en underenhet (GenBank tiltredelse antall NM_000701): Fw (300 nM): 5′-TGTCCAGAATTGCAGGTCTTTG-3, Rv (300 nM ): 5′-TGCCCGCTTAAGAATAGGTAGGT-3 «; Na, K-ATPase β
en subenhet (GenBank tilgangsnummer NM_001677): Fw (300 nM): 5′-ACC AAT CTT ACC ATG GAC ACT GAA-3 «, Rv (300 nM): 5»-CGG TCT TTC TCA CTG TAC CCA AT-3 «; CLDN-2 Fw GGTGGGCATGAGATGCACT, Rv CACCACCGCCAGTCTGTCTT; CLDN-4 Fw TGCACCAACTGCGTGGAGGATGAG, Rv ACCACCAGCGGGTTGTAGAAGTCC. De anvendte PCR-betingelsene var som følger: 50 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min. Hver av disse primersett som genereres et unikt PCR-produkt, noe som bekreftes av de oppnådde smeltekurver. PCR-analyser ble utført i tre eksemplarer, og dataene ble slått sammen. Relativ kvantitativ måling av mål-genet nivåene ble utført ved hjelp av fremgangsmåten ifølge ΔΔCt Livak et al. [58]. Som endogene rengjøring kontrollgener, anvendes vi den glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH, GenBank tilgangsnummer NM_002046) og ribosomalt 18S subenheten gener (GenBank aksesjonsnummer NR_003286) [59]. De følgende primere og konsentrasjoner ble anvendt: GAPDH Fw (300 nM): 5»- ATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3 «, GAPDH Rv (300 nM): 5′-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′, 18S Fw (300 nM): 5»-CAGCCACCCGAGATTGAGCA- 3 «, 18S Rv (300 nM): 5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3».
molekylær modellering analyser
I utgangspunktet, digoksin, ouabain, og 21-BD (figur 1A) ble generert og raffinert via semi-empiriske PM6 metoden [60] implementert i Gaussian 09 W programvare [61]. Den krystallografiske struktur av Na, K-ATPase (målproteinet) kompleksdannet med ouabain ble oppnådd fra Protein Data Bank (PDB ID: 4HYT [62] med en 3,40 Å-oppløsning, ved hjelp av α
en subenhet av Na, K- ATPase). Magnesiumionet og tre mellomliggende vannmolekyler ble holdt i bindingssetet. Deretter ble en stiv re-dock av ouabain utført for å validere systemet vårt. Deretter digoksin og 21-BD var forankret mot ATPase. De docking Analysene ble utført ved bruk av Autodock Vina 1.0.2 [63]. Den påførte søkealgoritmen ble gjentok Local Search Globalt Optimizer for global optimalisering. I denne prosessen ble en rekke trinn med mutasjon og lokal optimalisering (den Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno [BFGS] metode) gjennomførte, og hvert trinn fulgte Metropolis kriteriet [64]. I denne studien ble en gitterboks konstruert utforske alle aktive seter, som ble definert som en terning med det geometriske sentrum i ouabain, med dimensjoner på 20 x 20 x 24 Å, adskilte punkter på 1 A og X, Y og Z koordinater av -27,065, 20,469 og -69,469, henholdsvis. Alle molekylære modellering tallene ble bygget ved hjelp av DS Visualizer 3.1 [65].
(A) Kjemisk struktur av ouabain, digoksin, og 21-BD. (B) Venstre: hele strukturen av Na, K-ATPase (PDB: 4HYT) viste i fast bånd representasjon, der alfa-helix, beta-ark og svinger er i rødt, blått og grått, henholdsvis; høyre: Høydepunktet på bindingssetet med ouabain vist på tube representasjon. Stiplede røde linjene indikerer hydrogenbindinger. Bare polare hydrogenatomer var viste for en bedre visualisering. Pharmacophoric konformasjon av, (C) digoksin og (D) 21-BD; polare og ikke-polare interaksjoner er avbildet av magenta og grønne farger, henholdsvis. Stiplede linjene indikerer hydrogenbindinger. Rester interaksjoner er fargekodet som angitt i den innsatte skala.
Utarbeidelse av Pdr5p plasmamembraner
Plasma membraner som inneholder uttrykt Pdr5p protein ble fremstilt fra
Saccharomyces cerevisiae
mutant stamme AD124567 som tidligere rapportert [66].
Fraksjonering av cellelysatene og utarbeidelse av membran fraksjoner
i alt 2,5 × 10
5 celler ble dyrket i 75 cm
2 kulturflasker og behandles med digoksin og 21-BD. Etter 48 timers behandling, ble cellene vasket tre ganger med kald PBS og kasserte fra kulturflaske med en gummispatel i en membranprepareringsbuffer (6 mM Tris [pH 6,8], 20 mM imidazol, 0,25 M sukrose, 0,01% SDS, 3 mM EDTA og 2 mM PMSF). Cellene ble homogenisert i en Potter-Elvehjem-homogenisator, ved hjelp av ti Stokes i is. Deretter ble de sonikert i et ultrasonisk celle disruptor på is i 10 s ved 45% effekt. Prøven ble underkastet sentrifugering ved 20000 x g i 90 min ved 4 ° C. Supernatanten ble kastet og pelleten resuspendert i 250 ul av membranprepareringsbuffer. Til slutt ble denne prøven ultralydbehandlet i 10 s ved 25% effekt til fullstendig homogenisering.
Na, K-ATPase forberedelse fra rottehjernehalvdelene
hjernehalvdelene fra voksne Wistar hannrotter ble raskt innhentet etter dietyleter anestesi og halshogging. Protokollene som brukes for bruk av rotter ble godkjent av Institutional Kommisjonen for etikk i bruk av dyr, prosesskode DFBCICB011 og dannet Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, utgitt av amerikanske National Institute of Health (NIH publikasjon Nei . 85-23, revidert i 1996). De hjernevev, som brukes som en kilde for ouabain-sensitive (α
2 /α
3) Na, K-ATPase-isoformer, ble homogenisert i 250 mM bufret sukrose, 2 mM ditiotreitol, 0,1 mM PMSF og 5 mM Tris /HCl (pH 7,4) med en motordrevet teflon Potter-Elvehjem-homogenisator. Deretter ble kaotropisk behandling med 2 M KI utført i 1 time under konstant omrøring, etterfulgt av sentrifugering tre ganger ved 100.000 x
g
i 1 time. Den endelige pellet ble resuspendert i 250 mM sakkarose, 0,1% natriumdeoksycholat og 20 mM maleat /Tris (pH 7,4), og deretter lagret over natten ved -20 ° C og underkastes differensiell sentrifugering etter tining [67]. Pelletene ble resuspendert i den samme buffer uten PMSF og lagret i flytende N
2.
Na, K-ATPase-preparat fra mus nyre
Nyre vev ble isolert fra voksne mus og var homogenisert i 250 mM sakkarose, 0,1 mM EGTA og 25 mM imidazol-HCl, pH 7,4, ved hjelp av en motordrevet teflon Potter
–
Elvehjem homogenisator. Prøven ble deretter utsatt for sentrifugering ved 4500 ×
g
i 10 min. Den resulterende supernatant ble sentrifugert ved 70.000 x
g
i 1 time. Den endelige pellet ble resuspendert i den homogenisering oppløsning og anvendt for Na, K-ATPase-aktivitetsanalyser. Alle forsøksprotokoller som involverer mus ble godkjent av University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care og bruk komité.
NTPase Analyser
enzymatiske aktiviteter ble analysert ved hjelp av ATP som et substrat i standard medium (50 pl sluttvolum) inneholdende 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 4 mM MgCl
2, 75 mM KNO
3, 7,5 mM NaN
3, og 0,3 mM ammonium-molybdat i nærvær av 3 mM ATP. Reaksjonen ble initiert ved tilsetning av 13 ug /ml av plasmamembranpreparater, deretter holdt ved 37 ° C i 60 minutter og stoppet ved tilsetning av 1% SDS, som tidligere beskrevet [68]. Den frigjorte uorganisk fosfat (Pi) ble målt som beskrevet andre steder [69]. Ved hjelp av stamløsninger i DMSO, 21-BD og digoksin ble tilsatt til en 5% volum /volum sluttkonsentrasjon. Forskjellen i ATPase-aktivitet i nærvær eller fravær av 3 uM oligomycin tilsvarte en Pdr5p-mediert ATPase-aktivitet.
Måling av effekten av 21-BD på Na, K-ATPase-aktivitet
de hjernehalvdel preparatene ble inkubert ved 37 ° C i 2 timer i medium inneholdende 87,6 mM NaCl, 3 mM KCl, 3 mM MgCl
2, 3 mM ATPNa
2, 1 mM EGTA, 10 mM natriumazid og 20 mM maleinsyre /Tris (pH 7,4), og cellemembranpreparater ble inkubert ved 37 ° C i 1 time i 120 mM NaCl, 20 mM KCl, 2 mM MgCl
2, 3 mM ATPNa
2 og 50 mM HEPES (pH 7,5), både i fravær og nærvær av 1 mM ouabain eller økende konsentrasjoner av 21-BD og digoksin. Na, K-ATPase-aktivitet ble bestemt ved å måle Pi sluppet ifølge en kolorimetrisk metode som er beskrevet tidligere [69], og spesifikk aktivitet ble betraktet som forskjellen mellom total og ouabain-resistente ATPase-aktivitet [70].
Ouabain bindende
HeLa-celler ble sådd ut på 24 multi brønners plater ved samløpet og kultivert over natten. Monolag ble deretter hurtig vasket tre ganger med kalium-fri saltbuffer (140 mM NaCl, 1,8 mM CaCl
2, 5 mM sukrose, 10 mM Tris-HCl pH 7,4 ved romtemperatur) og inkubert 30 minutter med total binding-oppløsning (0,1 x 10
-6
3H-ouabain pluss 0,9 x 10
-6 kald ouabain i kalium fri saltvannsbuffer) under forsiktig omrøring og ved romtemperatur. Deretter monolagene ble vasket fire ganger, 1 min hver, med iskald 0,1 M MgCl
2 og oppløst med 400 ul av SDS 1%.
3H-aktivitet ble målt i prøver av 350 ul ved scintillasjonstelling. Total
3H-ouabain-binding ble konkurrert ved å tilsette til den totale bindingsløsning den nødvendige mengden av 21-BD for å nå de konsentrasjoner som er angitt i resultatene. En undergruppe av monolag ble utsatt for konkurrerte bindende løsning (total binding løsning pluss 0,5 × 10
-4 M kaldt ouabain) for å måle uspesifikk binding og trekke den til den totale bindingsverdier.
Statistiske analyser
Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism programvare, ble versjon 5. resultatene uttrykt som gjennomsnitt ± feil standard av gjennomsnittet. Statistisk signifikans i en en-veis analyse av varians (ANOVA), fulgt av en Bonferroni er valgt parvis sammenligning test, ble satt til
P
0,05 (*),
P
0,01 (**) eller
P
. 0,001 (***) vs. kontroll tilstand, og «n» representerer antall uavhengige eksperimenter
Resultater
Vi syntetiserte 21-BD via en enkel stereo-selektiv vinyloge aldolreaksjon, ifølge Xu et al. [50], og preget det endelige produktet gjennom vanlige NMR, HRMS og IR-analyse (Figur 1A, Figur S1 og Data S1).
For å utføre molekylær modellering analyserer vi startet med den geometriske optimalisering av ligander, gjennom en semi-empirisk tilnærming, for å korrigere geometriske parametre som bindingslengder og raffinere strukturen. Re-dock struktur oppnås med programvaren Autodock Vina, viser at den raffinerte og krystallografiske ligand deler den samme konformasjon på det aktive nettstedet, med et kvadratisk middelavvik verdi på 2,24 Å for den beste løsningen, som indikerte nøyaktigheten av metoden som er benyttet (se figur S2A). Figur 1B viser en simulering av dokking av ouabain til dets bindingssete i Na, K-ATPase α
en isoform. Som vist, bevarer enzymet de sekundære strukturelle elementene i ATPase familien (figur 1B, venstre) og at det aktive området består av Gln111, Glu117, Pro118, Asn122, Leu125, Glu312, Ile315, Gly319, Val322, Ala323, Phe783, Phe786, Leu793, Ile800, Arg880 (figur 1B, til høyre), i samsvar med kjente strukturer [71].
Etter disse molekylmodellering analyserer vi forankret ouabain, digoksin og 21-BD til Na, K-ATPase ( Figur S2B og figur 1C og D). Simuleringer resulterte i bindende energier for ouabain, digoksin, og 21-BD fra -9,8, -1,9 og -10,0 kcal /mol, henholdsvis. Disse data tyder på at 21-BD kan ha en liknende bindingsaffinitet til Na, K-ATPase enn ouabain og digoksin. Men begge disse siste forbindelser utviser forskjellige pharmacophoric konformasjoner i bindingssetet, hovedsakelig ved nivået av laktonringen. Tall 1C og D fremheve de viktigste inter interaksjoner mellom ligander og målet protein. Digoksin bindes til enzymet via hydrogenbinding med Thr797, Asp884 og Lys905 aminosyrer. Den elektrostatiske og hydrofobe interaksjoner oppstå med Glu117, Asn120, Asp121, Asn122, Ile315, Gly319, Val322, Ala323, Arg880, Asp884, Tyr901, Glu908 og Gln111, Leu125, Phe316, Phe783, Phe786, Leu793, Arg886, Phe909, Arg972, henholdsvis (figur 1C). I motsetning til naturlige hjerteglykosider, 21-BD-komplekser til Na, K-ATPase gjennom Gln111, Glu312, og Thr797 hydrogenbinding. I tillegg, når den aromatiske ring en hydrofob lomme som dannes hovedsakelig ved Cys104, Val322, Ala323, Glu327, Ile800 (figur 1D). Dessuten er det pharmacophoric konformasjon helt forskjellig fra den til de naturlige glykosider, hvis aromatiske del binder seg til vannmolekylene og magnesium-ion.
For å direkte bestemme bindingen av 21-BD til ouabain området av Na, K- ATPase, vi først testet om syntetisk steroid kunne konkurrere med
3H-ouabain bindende i HeLa-celler som uttrykker den α
1 isoformen av Na, K-ATPase [72]. Som vist på fig.
