Abstract
Bakgrunn
Vitamin D-binding protein-makrofag aktiverende faktor ( DBP-MAF) er en potent hemmer av tumorvekst. Virksomheten har imidlertid blitt tilskrevet indirekte mekanismer som øker immunresponsen ved å aktivere makrofager og hemme veksten nødvendig blodkar for veksten av svulster.
Metoder og funn
I denne studien viser vi for første gang at DBP-maf utstillinger en direkte og potent effekt på prostata kreftceller i fravær av makrofager. DBP-maf demonstrerte hemmende aktivitet i sprednings studier av både LNCaP og PC3 prostata kreft cellelinjer samt metastatiske kloner av disse cellene. Flowcytometri studier med annexin V og propidiumjodid viste at denne inhiberende aktivitet ikke skyldes apoptose eller celledød. DBP-MAF også hadde evnen til å hemme migrering av prostatakreftceller
in vitro
. Til slutt ble DBP-MAF vist seg å føre til en reduksjon i urokinase plasminogen aktivator reseptoren (uPAR) uttrykk i prostata kreftceller. Det er dokumentert at aktivering av denne reseptoren korrelerer med metastase.
Konklusjoner
Disse studiene viser sterk hemmende aktivitet av DBP-MAF på prostata kreftceller uavhengig av sin makrofagaktivering.
Citation: Gregory KJ, Zhao B, Bielenberg DR, Dridi S, Wu J, Jiang W, et al. (2010) Vitamin D Binding Protein-makrofagaktiveringsvirkningen Factor Direkte Hemmer spredning, migrasjon, og uPAR Expression av prostata kreft celler. PLoS ONE 5 (10): e13428. doi: 10,1371 /journal.pone.0013428
Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, USA
mottatt: 21 januar 2010; Godkjent: 10 september 2010; Publisert: 18 oktober 2010
Copyright: © 2010 Gregory et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Department of Defense (DOD) tilskudd PC030286 og forskningsdepartementet for å hindre blindhet Challenge Grant. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
vitamin D bindende protein (DBP) er den viktigste transportør av vitamin D i blodet. Den har en molekylvekt mellom 52-59 kDa og er funnet i blodstrømmen på et nivå mellom 300-600 mikrogram /ml [1], [2]. DBP er morselskap molekyl av DBP-MAF [3]. DBP-maf er produktet av selektive deglykosylering av DBP og er blitt vist å være en potent antiangiogen og antitumorigenic molekyl [4] – [6]. Vi har vist tidligere i en xenograft musemodell som DBP-maf er en potent inhibitor av humane pankreatiske tumorer, og at dens evne til å hemme tumorvekst
in vivo
skyldes delvis til sine antiangiogene egenskaper [4] . I den studien ble det vist at DBP-maf er antiangiogen basert på reduksjon av skip i dama chorioallantoic membranen, og basert på redusert microvessel tettheten i svulster. Det har blitt foreslått i andre studier at dens primære antitumor-mekanismer er immunologisk, på grunn av aktivering av makrofager. Nyere kliniske studier av Yamamoto
et al
har vist potent anti-tumor-aktivitet, samt aktivitet mot HIV [7] – [10]. Denne aktiviteten ble målt som en funksjon av redusert serumnivåer av enzymet α-N-acetylgalactosaminidase (nagalase). Nagalase deglykosylering av DBP hindrer den fra å aktivere makrofager, og undertrykker dermed immunresponsen [11]. Den grunnleggende mekanismen som foreslås i alle tilfeller i hovedsak er aktiveringen av makrofager og de påfølgende immunresponser. HIV er det blitt foreslått at defekte antigen presentasjon er en faktor i immunsvikt [12]. Tilstedeværelsen av forhøyet nagalase i plasma hos HIV-pasienter antyder at makrofagaktivering kan hemmes hos disse pasientene [13]. I tillegg har nagalase vist seg å være en integrert komponent av et envelopeprotein fremme fusjon for initiering av infeksjon [11]. Plasmakonsentrasjonen av nagalase i pasienter med systemisk lupus erythematosus ble også funnet å være forhøyet. I lupus, antistoffer dannes patogene immunkomplekser og er deponert i vev. Clearance av disse kompleksene av makrofager er hemmet hvis makrofagaktivering blir forstyrret [14]. Kreftceller er blitt vist å produsere nagalase [15] og forhøyede konsentrasjoner i serum er tatt opp i et antall kreftpasienter som lider av melanom [16], prostata, kolorektal, og metastatisk brystcancer [7] – [9]. En grundig forståelse av DBP-MAF aktivitet er ennå ikke oppnådd, men dens potensial som en antiangiogen og immunogen terapi er klar
Fire prostatakreft cellelinjer ble brukt i denne studien for å inkludere.; androgen sensitive (LNCaP) og ufølsomme (PC3M) linjer, samt høyt metastatiske linjer (LNCaPLN3 og PC3MLN4) avledet fra hver foreldrelinjen, henholdsvis.
Evnen DBP-MAF å ha en direkte effekt på tumorceller har ikke blitt rapportert. Denne studien undersøkte rollen DBP-MAF i direkte hemming av aktiviteter som spredning, migrasjon, og uttrykk for uPAR som er relatert til tumorvekst og metastasering.
Materialer og metoder
Syntese av DBP-maf
(a) Fremstilling av (1-3) β-D-galaktosidase-agarosekuler.
Fremstilling av perler ble utført ved anvendelse av en modifikasjon av metoden ifølge Yamamoto
et al product: [17]. Cyanogenbromid-aktivert kuler (0,5 g) ble vasket med en mM HCl (3X, 10 ml per vask) ved hjelp av sugefiltrering. Perlene ble deretter vasket med DDI vann og resuspendert i 2 ml koblingsbuffer (0,1 M NaHCO
3, 0,5 M NaCl, pH 8,3). (1-3) β-D-galaktosidase (1000 enheter) ble tilsatt til perlene /koblingsbuffer og deretter ristet med en over og under blander i 2 timer ved romtemperatur. Perlene ble deretter vasket med koblingsbuffer og resuspendert i blokkeringsbuffer (koblingsbuffer pluss 0,2 M glycin). Suspensjonen ble ristet over natten ved 4 ° C. Perlene ble deretter vasket med koblingsbuffer, etterfulgt av 0,1 M natriumacetat, 0,5 M NaCl, pH 4,0, og vaskingene ble gjentatt for totalt fire ganger. Kulene ble vasket med en endelig vask med koblingsbuffer og deretter spunnet ned og resuspendert i 1,0 M NaCl.
(b) Bestemmelse av (1-3) β-D-galaktosidase-agarose-perle-aktivitet.
Bestemmelse av vulst-aktivitet ble utført ved anvendelse av en modifikasjon av metoden ifølge Yamamoto
et al product: [17]. For å bestemme aktiviteten av de (1-3) β-D-galaktosidase-agarosekulene, ble 50 mL av perlesuspensjon tilsatt til 0,95 ml analysebuffer /kromogent substrat (PBS, 3 mM 2-nitrofenyl-β- D-galaktopyranosid, 10 mM MgCl
2, 0.1 mM β-merkaptoetanol), og suspensjonen ble ristet ved romtemperatur i 15 min. Reaksjonen ble stanset med 33 ul av 1 M natriumkarbonat, og absorbansen ble målt ved 405 nm. Aktivitet ble uttrykt som enheter /ml av perlesuspensjon, hvor en enhet er definert som antall umol p-nitrofenol dannet pr minutt. En molar absorbtivity av 18 380 l /mol cm, og en banelengde på 0,25 cm tilsvarende et 200 pl volum i en 96-brønners plate ble anvendt for å beregne konsentrasjonen av p-nitrofenol.
(c) Deglykosylering av DBP med (1-3) β-D-galaktosidase-agarose perler.
Deglykosylering av DBP ble utført ved anvendelse av en modifikasjon av metoden ifølge Yamamoto
et al product: [17]. DBP (Calbiochem, San Diego, CA) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,05 mg /mL, i PBS pH 6,0, 10 mM MgCl
2, med 0,007 U (1-3) β-D-galaktosidase-agarose og 0,004 U neuraminidase-agarose (Sigma, St. Louis) og ristet ved romtemperatur i 4 timer. Det totale reaksjonsvolumet var 1 ml. Kulene ble deretter sedimentert ved sentrifugering og fjernet. DBP-maf ble lagret i delmengder ved -20 ° C.
DBP-maf peptid
En 14 aminosyre DBP-maf peptid ble syntetisert (Ana Spec, Fremont, CA) med amino syre sekvens: Ac-TPTELAKLVNKRSE. Purity var . 90%
Cell kultur
PC3M, PC3MLN4, LNCaP og LNCaPLN3 celler ble vennlig levert av Dr. Curtis Pettaway og Dr. Jesaja J. Fidler (MD Anderson Cancer Center ). Den PC3M cellelinje ble isolert fra levermetastaser som produseres i nakne mus etterfølgende til intrasplenic injeksjon av androgen-insensitive PC3 human prostata carcinoma-cellelinjen [18]. De metastatisk underlinjer, PC3MLN og LNCaPLN, ble skapt ved å injisere foreldrecellene orthotopically inn i rygg flik av prostata på nakne mus og dyrking av cellene som hadde spredning til sentinel (paraaortic) lymfeknute. Etter dyrking i 3-5 passeringer, disse cellene ble re-injisert inn i prostata av etterfølgende nakne mus. Denne prosessen ble gjentatt i 3 sykluser å skape metastatisk linje, LNCaPLN3 og for fire sykluser for å lage metastatisk linje, PC3MLN4 [18]. Alle tumor-celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 U /ml) /streptomycin (100 ug /ml), og L-glutamin, og inkubert ved 37 ° C, 10% CO
2.
sur fosfatase kolorimetrisk analyse
Ved slutten av hvert forsøk ble cellene vasket i PBS og deretter 450 ul av sur fosfatase-buffer (10 mM p-nitrofenolfosfat, 0.1 M natriumacetat, 0,1% Triton X-100, pH 5,8) ble tilsatt til hver brønn. Celler ble inkubert ved 37 ° C i 45 minutter. Femti pl av 1 N NaOH ble tilsatt til hver brønn for å stoppe reaksjonen, og absorbansen ble målt ved 405 nm [19], [20]. Celle antallet av hver celletype ble kalibrert med absorbans ved hjelp av et hemacytometer for å sikre at sur fosfatase-nivåer korrelerte på en lineær måte med celletall. Analyser og plotting for alle analyser ble gjort ved hjelp av Origin Pro 8 (Northampton, MA).
Cell migrasjon analyser
Migrasjon analysene ble utført ved hjelp av en modifisert Boyden kammer Millicell kultur inserts (Millipore, Billerica, MA) med 8 mikrometer porer [20] – [22]. De øvre membraner ble pre-inkubert over natten med fibronektin (10 ug /ml i PBS), som ble aspirert fra brønnene følgende morgen. -Celler (150,000 celler /brønn) ble sådd ut i basalmedium with.010% gelatin, med eller uten DBP-maf eller DBP. Noen prøvebrønner ble farget ved slutten av inkubasjonstiden for å sikre at celleadhesjon på de øvre membranene var ensartet under alle forhold. Basal medium ble tilsatt til brønnene bunn med eller uten 10% FBS. Celler ble inkubert i seks timer ved 37 ° C, 10% CO
2. Celler som ikke vandrer ble fjernet fra toppen av membranen og de migrerte celler ble kvantifisert ved anvendelse av en sur-fosfatase-kolorimetrisk analyse.
proliferasjonsanalyser
Tumorceller ble opprettholdt i RPMI 1640 (Invitrogen) med 10% FBS, penicillin /streptomycin og L-glutamin, og inkubert ved 37 ° C, 10% CO
2. Cellene ble trypsinert og tilsatt til 24 brønners plater (5.000 celler /brønn) i 0,5 ml kulturmedium. Celler ble serum-sultet natten over og deretter ble mediet erstattet med RPMI 1640, 1% FBS, penicillin /streptomycin og L-glutamin, og inkubert i 72 timer med eller uten DBP-maf eller DBP [23]. Celleproliferasjon ble vurdert ved hjelp av en syre fosfatase kolo analyse [4], [23].
Flowcytometri
Celler ble dyrket til ~80% samløpet i 100 mm
2 retter. Celler ble behandlet med eller uten DBP-maf (1 pg /ml) og inkubert ved 37 ° C i 48 timer. Cellene ble trypsinert, sentrifugert, alikvotert inn i rørene og merket med annexin V og propidiumjodid ved hjelp av en apoptose deteksjonssett (APOAF, Sigma, St. Louis, MO). Annexin V og PI farging ble utført i henhold til produsentens anbefalinger. Flowcytometri analyse ble utført ved hjelp av en Cytomation MoFlo celle sorter etter produsentens anbefalinger.
revers transkripsjon og real-time kvantitativ polymerase chain reaction (RTQPCR)
Total RNA ble ekstrahert fra humane celler ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefalinger, og ble behandlet med RNase-fritt DNase (Ambion). RNA integritet og kvalitet ble vurdert gjennom 1% agarose gel elektroforese og konsentrasjonene ble bestemt spektrofotometrisk (Nanodrop 1000 spektrofotometer V3.7, ThermoFisher Scientific). Total RNA (1 pg) ble reverstranskribert som tidligere beskrevet [24] med qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences). RT produkter (cDNA) ble forsterket av sanntids kvantitativ PCR (Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR system) med Power SYBR grønn Master Mix. Oligonukleotid primere spesifikke for humant uPAR variant 1 (Genebank tiltredelse n ° NM-002659, frem 5’CAACGAGGGCCCAATCCT -3 «og omvendt 5′-GTAACACTGGCGGCCATTCT -3»), uPAR variant 2 (Genebank tiltredelse n ° NM-001005376, frem 5 «- CAACGAGGGCCCAATCCT -3′ og revers 5»- CACTGGCGGCCATTCTG -3 «), uPAR variant 3 (Genebank tiltredelse n ° NM-001005377, forover 5′- GCCGTTACCTCGAATGCATT -3′ og revers 5»- GGCCCCTCTCACAGCTCAT -3 «), og 18S rRNA (forover 5»-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3 «og 5′-revers GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3») ble anvendt. QPCR sykkelBetingelsene var 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser av en to-trinns forsterkning program (95 ° C i 15 s og 58 ° C i 1 min). Ved slutten av forsterkningen, var smeltet kurve analyse anvendt ved bruk av dissosiasjon protokollen fra Sequence Detection system for å utelukke forurensning med uspesifikke PCR-produkter. PCR-produktene ble også bekreftet ved hjelp av agarose-gel og viste bare en bestemt bånd av den forutsagte størrelse. For negative kontroller ble ingen RT produkter brukes som maler i qPCR og ikke bandet ble oppdaget på gelen.
Relative uttrykk for målgener ble bestemt av to
-ΔΔCt metoden [25]. De ubehandlede celler ble valgt som kalibrator.
Immunoblotting
Immunoblotting ble utført ved anvendelse av en modifikasjon av metoden til Besch
et al product: [26]. Cellene ble dyrket i 100 mm
2 retter og vokst til ~80% samløpet deretter serum-sultet over natten. Mediet ble erstattet med RPMI (1% FBS). DBP eller DBP-maf tilsatt ved indikerte konsentrasjoner. Celler ble inkubert i 24 eller 72 timer ved 37 ° C og deretter lysert ved hjelp av HTG-buffer (20 mM HEPES, pH 7.4,10% glycerol, 1% Triton X-100) og høstet ved hjelp av en celleskrape. Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) tilsatt (100 mikrometer). Lysater ble separert ved hjelp av SDS-PAGE. Lanes ble normalisert ved hjelp av lik protein lasting (40 mikrogram /kjørefelt). Protein nivåer ble bestemt ved hjelp av en BCA assay (Pierce, Rockford, IL). Bånd ble overført til en PVDF-membran. Membranen ble blokkert over natten i 10% pulverformet ikke-fettholdig melk og 0,10% Tween 20 i PBS. Membranen ble hybridisert med et anti uPAR-antistoff (Santa Cruz, CA), etterfulgt av hybridisering med et pepperrot peroksidase-koblet sekundært antistoff, og visualisert ved hjelp av kjemiluminescens. Vinculin ble anvendt som en kontroll lasting.
Statistisk analyse
Virkningen av DBP-maf ble testet separat for cellemigrering og proliferasjonsanalyser. En ensidig t-test ble anvendt for å måle den statistiske signifikans av reduksjon av tumorvekst på forskjellige nivåer. En to-sidig Z-test ble anvendt for å måle effekten av DBP-maf i apoptose eller nekrose. Alle analyser ble gjort ved hjelp av SAS Statistiske programvareversjon 9.1 (SAS Institute, Cary, North Carolina) og en
P
-verdi ≤0.01 ble brukt til å identifisere statistisk signifikans.
Resultater
DBP-maf hemmer migrasjon av tumorceller
Invasion og migrering av tumorceller er viktige skritt i tumorvekst og metastasering. DBP-maf ble testet for sin effekt på cellemigrering i fire tumor linjer-to foreldreprostatakreft linjer (LNCAP og PC3M) og to metastatiske kloner av disse linjer (LNCaPLN3 og PC3MLN4), ved hjelp av et modifisert Boyden kammer. Basalnivået av migrasjon mellom hver foreldrelinje og dens respektive metastatisk klon forble uendret. Ved alle doser som ble testet, ble det observert inhibering av migrering (figur 1).
LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) eller PC3MLN4 (D) celler ble tilsatt (150 000 /brønn) i toppen kammer i et modifisert Boyden kammer (+/- DBP-MAF) med 10% FBS i bunnkammeret. Etter 6 timer ble cellene fjernet som ikke hadde migrert, og gjenværende celler ble kvantifisert ved anvendelse av en sur fosfatase analyse. Resultatene ble normalisert til kontroll. Eksperimenter ble utført minst tre ganger, og feilen er vist som +/- SD. Sammenlignet med cellevekst uten DBP-maf, tilsetning av DBP-maf hadde en statistisk signifikant total reduksjon av cellemigrering ved 30% (P = 0,0003) for de kombinerte fire tumorcelletyper. Individuelle betydelig reduksjon rater ble funnet med hver av disse tumorcelletyper. Sammenlignet med kontrollen, ble betydelig reduksjon sett med DBP-MAF på (A) 20% P = 0,0022 (B) 20% P = 0,0029 (C) 10% P = 0,0045 (D) 30% P = 0,0094. n = 3.
En DBP-maf peptid hemmer tumorcellemigrasjon
Utarbeidelse av DBP-MAF involverer flere trinn enzymatiske prosesser. Den selektive deglykosylering er et nødvendig skritt i prosessen fordi uttrykket av DBP-MAF i E. coli produsert et protein uten aktivitet [4]. En aktiv men lettere formulert versjon av molekylet ville gjøre fremstillingen av DBP-MAF enklere og mindre kostbart. Av disse grunner en DBP-maf Peptidet ble syntetisert ved anvendelse av en sekvens fra modermolekylet som har vist aktivitet i andre studier [27]. Peptidet ble testet for å bestemme dets evne til å hemme tumorcellemigrering. Som vist i figur 2, peptidet viste signifikant evne til å inhibere migreringen av alle tumorlinjer. Den hemmende effekten ikke øker ved høyere doser, noe som tyder på sin IC
50 ble lavere enn doseområdet testet.
LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) eller PC3MLN4 (D) -celler ble tilsatt (150 000 /brønn) til toppkammeret i et modifisert Boyden kammer (+/- DBP-MAF) med 10% FBS i bunnkammeret. Etter 6 timer ble cellene fjernet som ikke hadde migrert, og gjenværende celler ble kvantifisert ved anvendelse av en sur fosfatase analyse. Resultatene ble normalisert til kontroll. Eksperimenter ble utført minst tre ganger, og feilen er vist som +/- SD. Sammenlignet med migrasjon uten DBP-MAF, og legger DBP-MAF hadde en statistisk signifikant reduksjon av migrasjon på 40% (P 0,0001) for kombinasjonen av alle fire tumorcelletyper. Individuelle betydelig reduksjon rater ble funnet med hver av disse tumorcelletyper. Sammenlignet med kontrollen, ble betydelig reduksjon sett med DBP-MAF på (A) 30% P = 0,0038 (B) 40% P = 0,0016 (C) 20% P = 0,0038 (D) 40% P = 0,0005. n = 3.
DBP-maf hemmer tumor celleproliferasjon
De fire cellelinjer ble så testet for å bestemme deres følsomhet for DBP-MAF i spredningsstudier. Som vist i figur 3A, DBP-maf ved 1 ug /mL redusert spredning til basislinjenivåer eller lavere i alle cellelinjer med unntak av PC3M. Det var interessant at selv om PC3M cellene ikke var følsomme for DBP-maf i denne analysen, metastatisk klon PC3MLN4 hadde utviklet følsomhet til det.
LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) eller PC3MLN4 (D) celler ble sådd i 24 brønners retter over natten, deretter medium +/- DBP-MAF ble lagt med 1% FBS. Etter 72 timer celler ble kvantifisert ved anvendelse av en sur fosfatase analyse. Resultatene ble normalisert til kontroll. Eksperimenter ble utført minst tre ganger, og feilen er vist som +/- SD. Sammenlignet med kontrollen, ble betydelig reduksjon sett med DBP-MAF på (A) 50% P = 0,0001 (B) 50% P = 0,0001 (C) ingen signifikant reduksjon (D) 40% P = 0,0073. n = 3.
På 1 mikrogram /ml, DBP-MAF hadde en statistisk signifikant reduksjon av cellevekst på 40% (P = 0,0073) for kombinasjonen av alle tumorcelletyper. Individuelle betydelig reduksjon priser (uten DBP-maf vs.1 mikrogram /ml) ble også funnet blant disse tumorcelletyper unntatt PC3M der ingen signifikant reduksjon ble funnet (figur 3).
Formerinasanalyse studier bruker DBP- maf peptid viste ingen reduksjon i proliferasjon med en hvilken som helst av de cellelinjer (data ikke vist). Dette tyder på at evnen til å inhibere migrering og proliferasjon kan ligge i forskjellige områder av proteinet, og at dette peptid sekvensen ikke har noen rolle ved inhibering av proliferasjon. Det er også mulig at området er ansvarlig for hele DBP-maf aktivitet er mer komplisert og krever at det selektivt deglykosylert sekvensen av proteinet til å være til stede.
For å bestemme hvorvidt inhibering av tumorcellevekst var på grunn celledød eller apoptose, strømningscytometri-analyse ble gjort ved hjelp av propidiumjodid og annexin V-markører. Disse studiene viste ingen tegn til enten betydelig celledød eller giftighet som følge av DBP-MAF behandlede celler (tabell 1), og med unntak av PC3M foreldrelinjen, viste en reduksjon.
RT-PCR viser reduksjonen av uPAR-ekspresjon i celler behandlet med DBP-maf
ekspresjon av urokinase plasminogen aktivator reseptor (uPAR) er blitt vist å korrelere med økt metastase i tumorceller [28] – [30] og med legemiddelresistens [31] (for oversikt se [32]). RT-PCR ble utført på alle celletyper ved hjelp av tre kjente isoformer av uPAR-forløpere, inkludert den oppløselige reseptor, isoform 2 (se Metoder). Som vist i figur 4D, ble redusert RNA-ekspresjon ble observert for LNCaPLN3 i nærvær av DBP-maf både 0,001 og 1 ug /ml DBP-maf for både uPAR1 og uPAR2 isoformer. Isoformene uPAR2 og uPAR3 viste tilsvarende reduksjon av uttrykk med DBP-maf behandling av PC3M celler. Interessant, selv om PC3MLN4 celler viste ingen signifikant respons på DBP-maf (figur 5D), var det en statistisk signifikant reduksjon av uPAR2 med DBP på 1 ug /ml. I nesten alle forhold undersøkes, etter 72 timer uPAR nivåer hadde kommet tilbake til kontrollverdiene (data ikke vist). Peptidet ble også testet ved anvendelse av cellelinje (LNCaPLN3), som var aktiv i alle analyser og (PC3M), som var aktiv i migrasjon, men ikke i proliferasjon. De viste ingen signifikant endring i hvilken som helst av de uPAR isoform nivåer med peptidet (figur 6A og 6B). Tumorlinjene ble deretter testet for å observere effekten av DBP-maf på uPAR-ekspresjon på proteinnivået. Cellene ble høstet etter 24 timer og lysater ble immunoblottet. Som vist i figur 4, har DBP-maf ikke inhiberer ekspresjonen av uPAR i noen cellelinjer etter 24 timer (figur 7a), men en reduksjon ble observert etter 72 timer bare i LNCaPLN3 celler (figur 7B). DBP behandlede celler viste ingen signifikant endring i reseptorekspresjon.
LNCaP og LNCaPLN3 ble cellene behandlet med DBP eller DBP-MAF (0,001 og 1 pg /ml) og inkubert i 24 timer og deretter høstet. RT produkter (cDNA), identifisert som uPAR1, 2 og 3, ble forsterket av sanntids kvantitativ PCR.
PC3M og PC3MLN4 celler ble behandlet med DBP eller DBP-MAF (0,001 og en ug /ml) og inkubert i 24 timer og deretter høstet. RT-produkter (cDNA), identifisert som uPAR1, 2, og 3, ble amplifisert ved sanntids-kvantitativ PCR. p. 0,05
LNCaPLN3 (A) og PC3M celler (B) ble behandlet med DBP eller DBP-MAF (0,001 og 1 mikrogram /ml) og inkubert i 24 timer og deretter høstet. RT-produkter (cDNA), identifisert som uPAR1, 2, og 3, ble amplifisert ved sanntids-kvantitativ PCR. p. 0,05
LNCaP, LNCaPLN3, PC3M, og PC3MLN4 ble behandlet med DBP eller DBP-MAF og inkubert i 24 timer (A) da høstet og immunoblottet hjelp av en anti-uPAR antistoff. LnCaPLN3 celler ved 72 timer (b). p. 0,05
Diskusjoner
vitamin D bindende protein DBP-MAF, har vist seg å hemme både svulsten og vekst av blodkar. Vi viser her, for første gang, en direkte effekt på prostata kreftceller i fravær av makrofager, noe som øker omfanget av DBP-maf utover dens allerede vist antiangiogene og immuno-modulerende egenskaper. DBP-maf demonstrert potent hemming av både spredning og migrering av kreftceller.
Det er interessant å merke responsen fra foreldre PC3M celler i forhold til metastatisk klone. PC3M celler viste ikke følsomhet for DBP-MAF i spredning analyser, men deres migrasjon ble hemmet av DBP-MAF. Det var en nedgang på uPAR uttrykk som oppdages ved RT-PCR, men protein uttrykk for uPAR isotyper testet dukket uendret. Til slutt, DBP-maf forårsaket en svak økning i tap på grunn av apoptose eller nekrose (tabell 1), mens de andre cellelinjene viste redusert apoptose eller nekrose. Den metastatiske klon PC3MLN4 oppviste en kraftig respons på behandling i både proliferasjon og migrering selv ved en lav dose (1 ng /ml), men viste ingen reduksjon i uPAR uttrykk enten ved mRNA eller proteinnivå. Ytterligere studier spredning ble gjort for å finne ut om avviket i respons mellom foreldrenes og metastatisk klone skyldes en generell endring i celle følsomhet. Calcitriol viste potent og konsekvent hemming blant alle celletyper innenfor identiske doseringsnivået. PC3M og PC3MLN4 celler ble også testet med etoposid og deres svar var lik (data ikke vist), noe som tyder på at metastatisk klone fått følsomhet for DBP-MAF at foreldre linjen ikke demonstrere. Effekten av DBP-maf på PC3MLN4 celler forårsaket den høyeste signifikante reduksjon forekomst av proliferasjon og migrering i forhold til de andre cellelinjer. Undersøkelser viste alle tumorcellelinjer for å være følsomme for DBP-maf i migreringstester.
Våre observasjoner i dyrking av disse cellene var at metastatiske kloner av både PC3M og LNCaP var mer følsomme for trypsinering enn foreldrelinjene. Mange faktorer kan regulere migrasjon av celler, og selv om uPAR er en mediator mulig, kan det ikke være den eneste mekanisme ved hvilken DBP-maf hemmer migrering. Peptidet var effektiv i migrasjonsstudier, men viste ingen evne til å påvirke proliferasjon eller uPAR uttrykk. Siden peptidet utgjør bare en del av proteinet det ikke innehar alle domenene av det native DBP-maf, slik som vitamin D-bindende region. Det er mulig at evnen til å regulere migrasjon og proliferasjon befinner seg i ulike domener i proteinet. Selv om alle cellelinjene svart på DBP-maf i ett eller flere av analysene, bare LNCaPLN3 viste reduksjon av uPAR proteinnivå. Det er imidlertid mulig at antistoffet ikke gjenkjenner alle isoformer av uPAR.
Det er nå vanlig akseptert at svulsten mikromiljøet, og ikke bare på tumorcelle alene, representerer et effektivt mål for terapi. I tillegg til undersøkelse av anti-tumor-effekter, blir fremgangsmåten for levering av disse stoffene blir utforsket. Biotilgjengeligheten er en viktig komponent i enhver terapeutisk strategi. Dårlig absorpsjon, internalisering, kort halveringstid i omløp, og en rekke andre mangler kan gjøre en behandling som har vist store løftet
in vitro
, ineffektive i klinikken. Den effektive
in vivo
doser for DBP-MAF (s-ng) har hatt en tendens til å være lavere enn
in vitro
doser (ng-mikrogram range) [4], [6] – [10]. Kanskje dette er på grunn av flere mekanismer for sin aktivitet. Potensial til å påvirke vekst av blodkar og tumor cellevekst, samt stimulere til en potent immunrespons gjennom makrofagaktivering er vanskelig å måle
i toto
bruker
in vitro
tilnærminger. De gjør imidlertid gi en måte å karakterisere disse effektene individuelt.
Effekten av DBP-MAF behandling på uPAR uttrykk i prostata kreftceller var tidligere ukjent. uPAR-ekspresjon har blitt korrelert med tumormetastase i et antall av tumorer [26], [28] – [30], [32]. Studier av spiserøret tumorer viste PAI-1 og uPA ble uttrykt i hele tumorer, men ikke i normalt vev og esophageal at uPAR ble uttrykt på tumorgrensene [33], [34]. En kobling mellom kreft i bukspyttkjertelen og uPA er påvist, noe som kan forklare den kraftige effekten av DBP-MAF i våre tidligere bukspyttkjertelen kreftstudier [33].
Forholdet mellom plasmin relaterte proteiner PAI-1, uPA og uPAR er sammensatt [35]. Selv om PAI-1 inhiberer ekspresjonen av uPA, som ville være antatt å hemme tumorprogresjon, PAI-1 også fremmer tumorvekst og angiogenese i seg selv [36], [37]. I denne forstand, vil en behandling som ville dempe uPAR uttrykk uten å fremme tumorvekst være verdifull. Siden metastase er den primære årsaken til død hos kreftpasienter, kan uPAR følsomhet for DBP-maf representerer en attraktiv vei for videre studier.
Takk
Forfatterne ønsker å takke Jayakrishna Ambati og Royce Mohan for sine nyttige diskusjoner.
