Abstract
transformerende vekstfaktor β (TGFB) avledet fra svulstens mikromiljø induserer maligne fenotyper som epitelial-mesenchymale overgang (EMT) og avvikende cellemotilitet i lungekreft. TGFp-indusert translokasjon av β-catenin fra E-cadherin kompleksene inn i cytoplasma er involvert i transkripsjon av EMT målgener. PTEN (fosfatase og tensin homolog slettet fra kromosom 10) er kjent for å utøve fosfatase-aktivitet ved å binde seg til E-cadherin komplekser via β-catenin, og nyere studier tyder på at fosforylering av PTEN C-terminale halen kan føre til tap av denne PTEN fosfatase-aktivitet . Men om TGFfi kan modulere både β-catenin trans og PTEN fosfatase aktivitet via fosforylering av PTEN C-terminalen fortsatt ukjent. Videre har rollen til fosforylering av PTEN C-terminus i TGFp-indusert ondartet fenotyper ikke er blitt evaluert. For å undersøke om modulering av fosforylering av PTEN C-terminalen kan regulere ondartede fenotyper, her etablerte vi lungekreftceller uttrykker PTEN protein med mutasjon av fosforyleringsseter i PTEN C-terminalen (PTEN4A). Vi fant ut at TGFB stimulering ga en dobling i fosforylert -PTEN /PTEN-forhold. Uttrykk for PTEN4A trykt TGFB-indusert EMT og cellemotilitet selv etter sneglen uttrykk. Våre data viser at PTEN4A kan undertrykke EMT ved fullstendig blokkering av β-catenin translokasjon inn i cytoplasma, i tillegg til inhiberende virkning av PTEN4A på TGFp-indusert aktivering av Smad-uavhengige signalveier. I en xenograft modell, ble tumorvekst forholdet trykt i celler som uttrykker PTEN4A. Samlet utgjør disse data tyder på at fosforyleringsseter i PTEN C-terminalen kan være et terapeutisk mål for TGFB-indusert maligne fenotyper i lungekreftceller
Citation. Aoyama D, Hashimoto N, Sakamoto K, Kohnoh T , Kusunose M, Kimura M, et al. (2013) Involvering av TGFB-indusert fosforylering av PTEN C-terminalen på TGFB-Induced Oppkjøp av Ondartede fenotyper i lungekreft celler. PLoS ONE 8 (11): e81133. doi: 10,1371 /journal.pone.0081133
Redaktør: Yulia Komarova, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 8. mai 2013, Godkjent: 18 oktober 2013; Publisert: 22.11.2013
Copyright: © 2013 Aoyama et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Kowa Life Science Foundation og Grant-i-Aid for Scientific Research (C) (21590987 og 24591162). Denne studien ble delvis støttet av en bevilgning til Diffuse lungesykdommer forskergruppe fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferdsdirektoratet, Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Monterings bevis antyder viktigheten av tumoren mikromiljøet i hvilket lungekreftceller kommuniserer med karsinom-assosiert fibroblaster (kafeer) og den ekstracellulære matriks (ECM) og dermed skaffe forskjellige maligne fenotyper inkludert epitelial-mesenkymale overgang (EMT) og avvikende celle motilitet [1,2]. Transformerende vekstfaktor β (TGFfi), en av de mest kritiske vev-avstivningsdel faktorer avledet fra tumor-mikromiljøet, fører til anskaffelse av ondartede fenotyper, ledsaget av den endrede ekspresjon av EMT-relaterte gener som sneglen [3]. En fersk studie antyder at TGFB-indusert transkripsjon av EMT målgener som fibronectin og vimentin blir akselerert av translokasjon av β-catenin fra E-cadherin komplekser på cellemembranen til cytoplasma [4]. TGFp stimulering forårsaker også avvikende celle motilitet skjønt Smad-uavhengige reaksjonsveier, slik som de som involverer fokal adhesjonskinase (FAK) og fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) [5,6]. Selv om mange Smad-uavhengige baner i svulsten mikromiljøet er negativt regulert av felles lipid og protein fosfatase aktiviteter PTEN (fosfatase og tensin homologe slettet fra kromosom 10) [7], lungekreft, der mutasjon av PTEN genet er sjelden observert [8,9], ofte viser hyperaktive av disse banene [9-11]. Selv PTEN utøver sin fosfatase-aktivitet ved å binde seg til E-cadherin komplekser via β-catenin [12], har nyere studier antydet at fosforylering av PTEN C-terminal hale kan være nært forbundet med tap av PTEN aktivitet [13]. Rahdar et al. antydet at substitusjon med fire alanin (Ala) rester, noe som resulterer i eliminering av de tilsvarende serin /treonin fosforyleringsseter (S380A, T382A, T383A, og S385A), forbedret membran sammenslutning av PTEN med en åpen konformasjon [14]. Noen signalveier som kan modulere ekspresjon PTEN, som resulterer i redusert PTEN fosfatase-aktivitet [15,16]; Men om TGFfi kan modulere både β-catenin trans og PTEN fosfatase aktivitet via fosforylering av PTEN C-terminalen fortsatt ukjent. Videre er den nøyaktige rollen til fosforylering av PTEN C-terminus i TGFp-indusert EMT og avvikende cellebevegelighet har ikke fullt ut undersøkt. I denne studien undersøkte vi om TGFB kan modulere fosforylering av PTEN C-terminalen i lunge kreftceller, og om fire-Ala substitusjon på PTEN C- endestasjonen (PTEN4A) kunne hemme TGFB-indusert EMT og relaterte avvik cellemotilitet. Videre undersøkte vi den underliggende mekanisme, det vil si hvorvidt PTEN4A kan modulere cadherin junctional komplekser og signalveier. Vi evaluerte også effekten av den kompenserende induksjon av PTEN4A på tumorvekst
in vivo
.
Materialer og metoder
Etisk erklæringen
Alle dyrestudier er gjennomgått og godkjent av Universitetet komité for bruk og vedlikehold av dyr ved Nagoya universitet Graduate School of Medicine.
De ble også gjennomført i samsvar med institusjonelle retningslinjer, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Alle mus ble huset individuelt i et sterilt barriere anlegg med fade-in /fade-out 12 timer lys: 12 timer mørke. Når musene ble avlivet etter eksperimentene ble musene avlivet med bedøvelse overdose, etterfulgt av umiddelbar cervikal dislokasjon, for å minimere lidelse.
Material
Monoklonale mus anti-PTEN antistoff (klone 6H2.1) var fra Cascade Biovitenskap (Winchester. Storbritannia). Renset kanin anti-fosfo-PTEN (Ser380 /Thr382 /Thr383) antistoff, kanin-anti-pan Akt antistoff, kanin anti-fosfo-Akt (Thr308) antistoff, kanin anti-fosfo-Akt (Ser473) antistoff, kanin-anti-FAK-antistoffet , kanin anti-fosfo-FAK (Tyr397) antistoff, anti-mus smad2 antistoff og kanin anti-fosfo-smad2 (Ser465 /467) antistoff var fra Cell Signaling Technology (Boston, MA). Renset anti-fibronektin-antistoff var fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Renset muse anti-E-cadherin antistoff og anti-β-catenin antistoff var fra BD Biosciences (San Diego, CA). Streptavidin (SAV) -Alexa 594 (SAV-594) konjugert anti mus antistoff var fra Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, California). Monoklonalt mus anti-vimentin antistoff var fra Millipore (Cambridge, Storbritannia). Affinitets-isolert kanin-anti-actin-antistoff og SB 431542, er en potent inhibitor av TGFp type I reseptor kinaser, var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Kan få signal var fra Toyobo Co (Tokyo, Japan). Doxycycline var fra Clontech (Mountain View, California). PhosSTOP og WST-en var fra Roche Applied Science (Mannheim, Tyskland). Hoechst33342 var fra Dojindo (Kumamoto, Japan). 1,2,4,5-Benzenetetramine -tetrahydroklorid (FAK hemmer 14) var fra Tocris Biovitenskap (Bristol, Storbritannia).
Plasmider og genet transfeksjon
Menneske PTEN (NM_000314) cDNA ble subklonet inn i pEGFP-C1 vektor (Clontech, Mountain View, California). GFP eller en fusjon-genet av GFP-PTEN ble plassert i pTRE-Tight vektor (Clontech, Mountain View, CA), henholdsvis. QuikChange seterettet mutagenese Kit (Stratagene, La Jolla, CA) ble benyttet for etablering av fire-Ala substitusjon (S380A, T382A, T383A, og S385A) på PTEN C-terminal hale (PTEN4A). Til slutt, GFP i pTRE-Tight vektor (GFP), GFP-PTEN i pTRE-Tight vektor (GFPPTENWt), og GFP-PTEN4A i pTRE-Tight Vector (GFPPTEN4A) ble etablert i denne studien. Etter etableringen av H358-celler, menneske lungekreft cellelinje, som frakter pTet-On Advanced (H358ON), GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A ble ko-transfektert med Linear Hygromycin Marker (Clontech, Mountain View, CA) , ved hjelp av Nucleofector ™ II (Amaxa Biosystems, Gaithersburg, MD). Etter valget med hygromycin, enkelt kloner ble isolert. Menneskelig PTEN ble også plassert i pcDNA4 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California). H1299 celler, den andre menneskelige lungekreft cellelinje, ble electroporated med pcDNA4 bare (4HC), pcDNA4 med PTENWt (PTENWt) eller pcDNA4 med PTEN4A (PTEN4A) ved hjelp Nucleofector ™ II. Etter valget med zeocin ble enkelt kloner isolert.
Cells
Den menneskelige lungecellelinjer, H358 og H1299, ble opprettholdt i RPMI supplert med 2 mmol /L L-glutamin, 100U /ml penicillin , 100 ug /ml streptomycin, 0.25μg /ml Fungizone, og 10% FCS [17]. For å evaluere effekten av TGFp på disse cellene, ble cellene behandlet med TGFp ved 2 ng /ml, og analysert med hensyn på mRNA-nivåer og proteinnivåer ved de angitte tidspunkter, og som beskrevet nedenfor. For å evaluere effekten av PTEN transduksjon på TGFfi stimulering, ble H358ON celler som uttrykker Dox-avhengige GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A inkubert med Dox ved 1 ug /ml i 24 timer før TGFp behandling som beskrevet ovenfor. For å undersøke de direkte effektene av TGFB stimulering på modulering av p-PTEN /PTEN forholdet ble cellene inkubert med kjøretøy eller SB 431 542 for en time før TGFB behandling. For å undersøke rollen til FAK-fosforylering på TGFp-indusert EMT, ble cellene inkubert med bærer eller FAK-inhibitor 14 i 24 timer før behandling TGFp.
Cellemigrering assay
A-8 um porestørrelse Boyden kammer ble anvendt for in vitro-migrasjonsanalyse [18]. Etter å ha blitt behandlet med Dox i 24 timer ble cellene (3×10
4 celler) i RPMI-medium inneholdende 0,5% serum og TGFp ved 2 ng /ml sådd ut i det øvre kammer, og 15% føtalt bovint serum (FCS) i RPMI ble tilsatt til det nedre kammer som et kjemotiltrekkende.
PCR-analyse for uttrykket av målrettede gener
Real-time PCR ble utført ved hjelp av en TaqMan ABI 7300 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Foster City, California). Snegle (NM_005985), vri (twist1: NM_000474), og glyceraldehydes-3-phophate dehydrogenase (GAPDH) mRNA ble påvist ved å anvende en blanding av oligonukleotidprimere og prober fra Nippon EGT, Inc (Toyama, Japan). mRNA-nivåer ble normalisert til GAPDH mRNA signal [19].
Western blot analyse
For hel-celle ekstrakter ble cellene høstet i iskald lysebuffer og klarert av sentrifugering [20,21]. Prøvene ble deretter utsatt for SDSPAGE og analysert ved immunblotting. For å oppdage fosforylering nivåer av målrettede proteiner, ble Phosphostop tilsatt til den lyseringsbuffer og kan få Signal ble også tilsatt til fortynning løsning for primært antistoff og sekundært antistoff. β-aktin ble evaluert som en lasting kontroll.
WST-1-analysen
celleproliferasjon reagens WST-1 ble anvendt for kvantitativ måling av celle proliferasjon [18]. Absorbansen av prøvene ble målt ved 450 nm ved anvendelse av en spectrofluorophotometer (Wallac 1420 ARVO-SX, PerkinElmer, Inc., Waltham, MA). Med mindre annet er angitt, ble medium alene målt som bakgrunn kontroll.
immunfluorescens og konfokal laser scanning mikros
Immunochtochemistry ble utført som tidligere rapportert [22]. For å evaluere effekten av PTEN4A transduksjon på TGFp-indusert translokasjon av β-catenin, ble H358ON celler som uttrykker Dox-avhengige GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A inkubert med anti-β-catenin antistoff, etterfulgt av SAV-594-konjugert anti mus antistoff. Nuclear farging ble utført ved Hoechst 33342. For å bestemme nivåene av β-catenin distribusjon, konfokal laser scanning mikroskopi (LSM 5 PASCAL, Carl Zeiss Co., Ltd, Jena, Tyskland) ble benyttet. Fluorescensstyrkene til β-catenin og kjerne ble evaluert ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer (LSM Programvare ZEN 2008, Carl Zeiss Co., Ltd, Jena, Tyskland). For å utføre den visuelle observasjon av fluorescens, ble fluorescerende intensitet enn en vilkårlig tverrsnitt av cellene plottet [23,24]. For å bestemme nivåene av PTEN subcellulære fordeling, ble konfokal laser scanning mikros også utnyttet. Intensitetsnivåer GFP fluorescens både i cytoplasma og kjernen ble også kvantifisert ved hjelp av bildebehandling. Et minimum av 5 tilfeldig utvalgte høy effekt felt ble undersøkt per prøve å måle fluorescens intensitet i kjernen og cytoplasma [25].
Mus xenograft modell
3×10
6 H358ON celler som uttrykker Dox avhengig GFP, GFPPTENWt, eller GFPPTEN4A, ble inokulert subkutant (sc) i flanken av seks uker gammel kvinne naken mus og deretter opprettholdes på vann med Dox ved endelig konsentrasjon 2 mg /ml og autoklavert mate ad libitum. Veksten ble fulgt over tid ved å ta kalibermålinger ved de angitte tider som tidligere beskrevet [26,27]. Hvert eksperiment brukte 5 hårløse mus for GFPPTENWT, 7 hårløse mus for GFP, og syv nakne mus for GFPPTEN4A. Tre uavhengige eksperimenter ble utført.
Statistisk analyse
Resultatene ble analysert ved hjelp av Mann-Whitney test for sammenligning mellom to grupper, og av ikke-parametriske ekvivalenter av variansanalyse (ANOVA) for multiple sammenligninger. En verdi på p. 0.05was anses å indikere statistisk signifikans
Resultater
TGFB modulerer fosforylering nivåer av PTEN C-terminalen i PTEN uttrykk i H358-celler, etterfulgt av EMT og avvikende cellemotilitet
for å evaluere TGFB-indusert EMT i lungekreftceller [28,29], western blotting analyse for fibronektin [4,30] og E-cadherin [4,29] ble utført. Western blot-analyse viste at TGFp behandling induserte en omtrent 12 gangers økning i fibronektin ekspresjon i H358-naive celler sammenlignet med bærer, mens E-cadherin ekspresjon i celler behandlet med TGFβdecreased med mer enn 20% sammenlignet med de som ble behandlet med vehikkel; således, TGFp stimulering ga mer enn en 15-ganger høyere fibronektin /E-cadherin-forholdet i H358-naive celler sammenlignet med bærer (figur 1A). Å vurdere sammenhengen mellom TGFB-indusert EMT og migrasjon evne, ble en migrering analyse utført. H358 naive celler behandlet med TGFβat 2 ng /ml, oppviste en omtrent 20-ganger større evne til å migrere mot en kjemoattraktant, sammenlignet med de som ble behandlet med bærer (figur 1B). Nyere studier tyder på at translokasjon av β-catenin inn i cytoplasma induserer direkte
de novo
uttrykk for mesenchymale gener i epitelceller [4,31]. Derfor lokalisering av β-catenin ble også evaluert i TGFp-behandlede lungekreftceller ved immunfluorescens. Immunfluorescens bildene innhentet av konfokal mikroskopi antydet at β-catenin ble lokalisert på cellemembranen i H358-naive celler behandlet med ingen TGFp (figur 1C og 1D), mens β-catenin translokasjon inn i cytoplasma ble observert i TGFp-behandlede H358-naive celler, fulgt av ko-lokalisering av β-catenin med Hoechst33342 (figur 1C og 1D). For å evaluere TGFB-indusert signalveier, ble western blotting utført. TGFp induserte en økning i fosforylering smad2 begynner på 5 minutter, og nådde et maksimum på 1 time, hvoretter fosforylert smad2 ekspresjon ble opprettholdt på et jevnt nivå i opptil 6 timer (figur 1E). For å evaluere effekten av TGFp stimulering på Smad-uavhengige veier, aktivering av Akt og FAK ble også analysert ved western blotting. TGFp behandling indusert økning fosforylering av Akt ved Thr308 og Ser473 (Akt308 og Akt473) begynner på 20 minutter, og nådde en maksimal nivå på 1 til 3 timer (figur 1F); I motsetning til dette var øker fosforylering av FAK ved Tyr397 observert ved 6 timer og nådde et maksimalt nivå av 12 til 24 timer (figur 1G). Videre evaluerte vi virkningen av TGFp på begge PTEN ekspresjonsnivåer og fosforylering av PTEN (p-PTEN) på sin C-terminale ende i lungekreftceller. Resultatene viste at TGFp behandling litt, men betydelig økt fosforylering av PTEN på sin C-terminale ende, og også redusert total PTEN nivåer i H358 naive celler, for således å gi en to-gangers økning i p-PTEN /PTEN-forhold 24 timer etter TGFp behandling ( Figur 1 H). For å vurdere om TGFB kan direkte modulere p-PTEN /PTEN-forhold, ble H358-celler behandlet med SB 431 542, en potent hemmer av TGFB type I reseptorkinasene [32]. Behandling med SB 431542 vellykket inhiberte TGFp-induserte økning i p-PTEN /PTEN-forhold (figur 1I), et funn understøttes av data som viser at behandling med 10 uM SB 431542 inhibert smad2 aktivering (data ikke vist). Dermed kan en TGFfi-indusert økning i p-PTEN /PTEN-forholdet være involvert i TGFB-indusert kjøp av ondartede fenotyper i lungekreftceller.
(A) H358-celler som ble behandlet med bærer eller TGFp ble høstet for analyse av fibronektin og E-cadherin. Den relative ekspresjon av fibronektin til E-cadherin (F /E) er vist i forhold til den i celler behandlet med bærer. Viste data representerer middel ± SE. Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. *: P 0,05 (B) En migrerings Analysen ble utført for H358-cellelinjen ble behandlet med bærer eller TGFp. Data som er vist representerer gjennomsnitt ± SD. Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. *: P 0,05 fluorescensstyrkene til β-catenin (rød) i de behandlede celler ble evaluert ved hjelp av konfokal laser-skanning mikroskopi og bildebehandling. Nukleær farging ble utført ved Hoechst33342 (blå). Den venstre bildet i (C) viser celler uten TGFB stimulering. Bildet til høyre i (C) viser celler stimulert med TGFB. Cellene inkubert med isotype-matchet kontroll IgG er vist i den innfelte i (C). Den øvre panel i (D) plotter fluorescensintensiteten av β-catenin (rød) og kjerne (blå) over et tverrsnitt av celler uten TGFp stimulering. Det nedre panel i (D) plotter fluorescensintensiteten av β-catenin (rød) og kjerne (blå) over et tverrsnitt av cellene stimulert med TGFp. Disse tallene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. (E, F og G) Celleekstrakter ble høstet ved de angitte perioder etter behandling med TGFp for analyse av nivåene av total og fosforylert smad2 (E), Akt473 (F), Akt308 (F), og FAK (G). Resultater er vist for H358-naive celler ved 0 minutter (kolonne 1), 5 minutter (kolonne 2), 20 minutter (kolonne 3), 1 time (felt 4), 3 timer (kolonne 5), 6 timer (kolonne 6), 24 timer (kolonne 7) og 48 timer (felt 8) etter behandling med TGFp (til venstre i E, F og G). Forholdet mellom fosforylert protein til totalt protein presenteres som intensitetsnivået i forhold til den for H358-naive celler ved 0 minutter (kolonne 1) etter behandling med TGFp (til høyre i E, F og G). Viste data representerer middel ± SE. Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. *: P 0,05 (H) celler behandlet med bærer eller TGFp i 0 minutter eller 24 timer ble høstet for analyse av fosforylert PTEN (pPTEN) og total PTEN. Den relative uttrykk for pPTEN til totalt PTEN (pPTEN /PTEN forhold) er vist i forhold til den i cellene behandlet med bærer for 0 minutter. En representant blot fra tre uavhengige eksperimenter er vist. Viste data representerer middel ± SE. Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. *: P 0,05 N.S. indikerer «ikke signifikant». (I) H358 naive celler ble inkubert med bærer eller SB 431542 10 uM i en time før behandling TGFp. pPTEN /PTEN-forholdet er vist i forhold til den i celler behandlet med bærer. En representant blot fra tre uavhengige eksperimenter er vist. Viste data representerer middel ± SE. Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. *: P 0,05 N.S. indikerer «ikke signifikant».
Mutasjon av fosforyleringsseter i PTEN C-terminale undertrykker TGFB-indusert EMT og aberrance cellemotilitet i H358-celler
For å bekrefte de biologiske effektene av TGFB indusert fosforylering av PTEN C-terminalen i lungekreftceller, undersøkte vi om mutasjon av fosforyleringsseter i PTEN kan påvirke både TGFB-indusert EMT og migrasjon evne lungekreftceller ved hjelp av en Dox avhengig genuttrykksystem fordi flere PTENWt rekonstituering modeller har antydet at PTENWt transduksjon kan indusere en langsom vekst forhold i glioma celler [15]. Først for å bekrefte at fire-Ala substitusjon hemmer fosforylering av PTEN C-terminalen i
de novo
PTEN protein indusert av Dox ble western blotting utført på H358ON celler som uttrykker Dox avhengig GFP, GFP-PTENWt, eller GFP -PTEN4A i fravær eller nærvær av Dox. Selv
de novo
GFP-PTEN-ekspresjon ble observert i celler som uttrykker H358ON Dox-avhengig GFP-PTENWt eller GFP-PTEN4A da Dox ble tilsatt, ble fosforylert GFP-PTEN detektert bare i H358ON celler som uttrykker Dox-avhengige GFP- PTENWt (Figur 2A). Fordi nyere studier tyder på at ufosforylerte PTEN kan være gjenstand for ubiquitinering, noe som resulterer i trans inn i kjernen [21], vurderte vi lokalisering av GFP fluorescens i H358ON celler uttrykker Dox avhengig GFP, GFP-PTENWt og GFP-PTEN4A. GFP alene ble diffust uttrykt både i cytoplasma og kjernen (til venstre i figur 2B og 2C), mens GFP-PTENWt og GFP-PTEN4A ble hovedsakelig lokalisert i cytoplasma med svak atom uttrykket (midtre og høyre i figur 2B henholdsvis, og 2C). Det var ingen forskjell i kjernen /cytoplasma-forhold på GFP fluorescens mellom GFP-PTENWt og GFP-PTEN4A (figur 2C). For å vurdere hvorvidt TGFB-indusert EMT kan moduleres av
de novo
GFP-PTEN uttrykk, ble utført western blotting analyse av fibronektin og E-cadherin. Det var ingen reduksjon i fibronektin /E-cadherin-forholdet i celler som uttrykker GFP alene og en delvis reduksjon (31,8%) i de som uttrykker GFP-PTENWt; imidlertid,
de novo
GFP-PTEN4A protein indusert ved Dox forårsaket en signifikant nedgang på omtrent 75% i fibronektin /E-cadherin-forhold (figur 2D). For å vurdere om GFP-PTEN4A kan påvirke TGFB-indusert cellemotilitet, ble en migrering analyse utført. I H358ON celler ble TGFfi-indusert økning i migrasjon mot en kjemotiltrekkende ikke hemmet av enten GFP eller GFP-PTENWt protein indusert av Dox, mens
de novo
GFP-PTEN4A protein trykt cellemigrasjon indusert av TGFB stimulering ( Figur 2E). Disse resultater indikerer at inhibering av fosforylering av PTEN C-terminalen kan undertrykke TGFp-indusert EMT og blokk avvikende celle motilitet i lungekreftceller, utover effekten av PTEN transduksjon seg observert i celler som uttrykker PTENWt.
(A) H358ON celler som uttrykker Dox avhengig GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A ble inkubert med kjøretøy eller Dox for 24hours før TGFB behandling. Cellene ble deretter behandlet med bærer eller TGFp for en ytterligere 24 timer i fravær eller nærvær av Dox. Cellene ble høstet for analyse av pPTEN (øvre panel), total PTEN (midtre panel) og β-aktin (nedre panel) ved western blotting. En representant blot fra tre uavhengige eksperimenter er vist. (B) Ved hjelp av konfokal laser scanning mikroskopi, lokalisering av GFP fluorescens i H358ON celler uttrykker Dox behandlet GFP (venstre panel), GFP-PTENWt (midtre panelet) og GFP-PTEN4A (høyre panel) ble evaluert. (C) Den intensitetsnivåer av GFP fluorescens både i cytoplasma og kjernen ble også kvantifisert ved bildebehandling. Fluorescensintensiteten ble uttrykt som kjerne /cytoplasma-forhold for hver prøve. Data som er vist representerer middel ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. *: P 0,05 N.S. indikerer «ikke signifikant». (D) H358ON celler som uttrykker Dox-avhengige GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A ble behandlet med bærer eller TGFp for 48 timer i fravær eller nærvær av Dox, og deretter høstet for analyse av fibronektin, E-cadherin, og β aktin av western blotting. F /E-forholdet er vist i forhold til den i celler behandlet med bærer i fravær av Dox. En representant blot fra tre uavhengige eksperimenter er vist. Viste data representerer middel ± SE. Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. *: P 0,05 N.S. indikerer «ikke signifikant». (E) En migrerings Analysen ble utført for H358ON celler som uttrykker Dox-avhengige GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A i fravær eller nærvær av Dox og /eller TGFp stimulering. Data som er vist representerer gjennomsnitt ± SD. Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. *: P 0,05 N.S. indikerer «ikke signifikant».
Mutasjon av fosforyleringsseter i PTEN C-terminale hemmer TGFB-indusert Smad uavhengig trasé, men ikke Smad avhengige veien i H358-celler
for å belyse de underliggende molekylære mekanismer, ble effekten av GFP-PTEN4A på TGFp-induserte signalveier evaluert. Verken
de novo
GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A uttrykk indusert av Dox trykt økningen i smad2 fosforylering i TGFB-behandlede H358ON celler (figur 3A). Økningen i Akt fosforylering i TGFB-behandlede H358ON celler uttrykker Dox avhengig GFP-PTENWt og GFP-PTEN4A tilbake til basalnivået eller lavere når Dox ble lagt, mens det i TGFB behandlet H358ON celler som uttrykker Dox avhengig GFP ikke endring når Dox ble tilsatt (figur 3B). Det skal bemerkes at GFP-PTEN4A jevnt trykt fosforylert Akt nivåer, sammenlignet med GFP-PTENWt (GFP-PTEN4A, 88% reduksjon i Akt473 og 79% reduksjon i Akt308, GFP-PTENWt, 74% reduksjon i Akt473 og 68% reduksjon i Akt308) (figur 3B). Nivået av fosforylert FAK i TGFB behandlet H358ON celler som uttrykker enten GFP eller GFP-PTENWt ble ikke endret da Dox ble lagt, mens det i TGFB-behandlede H358ON celler uttrykker GFP-PTEN4A hell tilbake til basalnivået når Dox ble lagt (figur 3C).
Cell ekstrakter fra H358ON celler som uttrykker Dox avhengig GFP, GFP-PTENWt, eller GFP-PTEN4A i fravær eller nærvær av Dox ble høstet for analyse av nivåene av total og fosforylert for smad2 (A), Akt473 (B), Akt308 (B), og FAK (C) ved de indikerte periode etter behandling med bærer eller TGFp (1 time for smad2, 1 time for Akt473, 1 time for Akt308, og 24 timer for FAK, henholdsvis). En representant blot fra tre uavhengige forsøk er vist (øverst i A, B og C). Forholdet mellom fosforylert protein til totalt protein presenteres som intensitetsnivået i forhold til den i H358ON celler som uttrykker Dox-avhengig GFP ble behandlet med bærer i fravær av Dox (nederst i A, B og C). Viste data representerer middel ± SE. Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. *: P 0,05 N.S. indikerer «ikke signifikant».
En FAK inhibitor målretting Tyr397 blokker TGFB-indusert avvik cellemotilitet, men ikke TGFfi-indusert EMT i H358-celler
Fordi PTEN4A trykt nivåer av fosforylert FAK på Tyr397 indusert av TGFfi, bestemt vi om hemming av TGFB-indusert FAK aktivering kan redde EMT og blokkere avvikende celle motilit. Først ble cellene behandlet med FAK-inhibitor 14, rettet mot Tyr397 området av FAK [33], som med hell hemmet TGFp-indusert FAKfosforylering ved Tyr397 på en doseavhengig måte (figur 4A). Hemming av TGFB-indusert FAK aktivitet ved FAK inhibitor 14 ga trykt TGFB-indusert cellemotilitet (figur 4C), men det gjorde ikke påvirke oppkjøpet av EMT fenotyper forble vedvarende (figur 4B). Videre fikk vi bekreftet at TGFB-indusert β-catenin trans inn i cytoplasma og kjernen ble ikke blokkert av behandling med FAK-hemmer 14 (figur 4D-4G).
For å undersøke hvilken rolle FAKfosforylering på Tyr397 på TGFB-indusert EMT, ble Dox-behandlede H358ON celler som uttrykker Dox avhengig GFP inkubert med bil eller FAK inhibitor 14 for 24hours før TGFB behandling. (A) Celleekstrakter ble høstet 24 timer etter behandling med TGFp for analyse av nivåene av total og fosforylert FAK. Dox-behandlede H358ON celler som uttrykker Dox-avhengig GFP ble behandlet med vehikkel (spor 1) eller TGFp (spor 2, 3, 4 og 5). Cellene ble også inkubert med bærer (kolonne 1 og 2), eller FAK-inhibitor 14 ved 0,1 nM (spor 3), 1 nM (felt 4), og 5 nM (spor 5) (øverst i A). Forholdet mellom fosforylert protein til totalt protein presenteres som intensitetsnivået i forhold til den i Dox-behandlede H358ON celler som uttrykker Dox-avhengig GFP ble behandlet med vehikkel (nederst i A). En representant blot fra tre uavhengige eksperimenter er vist. Viste data representerer middel ± SE. Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. *: P 0,05 (B) Dox-behandlede H358ON celler som uttrykker Dox-avhengig GFP ble behandlet med bærer eller TGFp for 48 timer i fravær eller nærvær av FAK-inhibitor 14 på 5nM, og deretter høstet for analyse av fibronektin, E-cadherin og β-actin av western blotting. F /E-forholdet er vist i forhold til den i celler behandlet med vehikkel (nederst i B). En representant blot fra tre uavhengige eksperimenter er vist. Viste data representerer middel ± SE. Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. *: P 0,05 N.S. indikerer «ikke signifikant». (C) En migrasjonsanalyse ble utført for Dox-behandlede H358ON celler som uttrykker Dox-avhengig GFP behandlet med bærer eller TGFp for 48 timer i fravær eller nærvær av FAK-inhibitor 14 på 5nM. Data som er vist representerer gjennomsnitt ± SD. Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. *: P 0,05 For å evaluere virkningen av FAK-inhibitor 14 på lokalisering av β-catenin i Dox-behandlede H358ON celler som uttrykker Dox-avhengig GFP behandlet med bærer eller TGFp, ble intensitetene av fluorescensen av β-catenin i cellene vurdert. Cellene ble behandlet med bærer (D og E) eller FAK-inhibitor ved 5nM (F og G). Det venstre bildet i (D og F) viser celler uten TGFB stimulering. Bildet til høyre i (D og F) viser celler stimulert med TGFB. Cellene inkubert med isotype-matchet kontroll IgG er vist i den innfelte i (D).
