Abstract
Stadig flere rapporter har vist at ulike microRNAs er involvert i tumordannelse og tumorprogresjon. Vi utførte denne studien å identifisere nye mirnas som kan være involvert i lungekreft og studier på sine funksjoner. Vi testet ekspresjon av 450 mirnas i lunge tumorvev og tilstøtende ikke-cancervev. Vi fant ut at miRNA-545 var mindre rik på kreft lunge vev enn i tilstøtende ikke-kreft vev. Våre videre studier viste at MIR-545 trykt celleproliferasjon
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi fant også at MIR-545 forårsaket cellesyklus arrest i G0 /G1 fase og indusert celle apoptose i lungekreftceller ved å målrette cyclin D1 og CDK4 gener. Virkningene av cyklin D1 CDK4 og ned-regulert av MIR-545 var lik de som er forårsaket av sirnas av cyklin D1 og CDK4, og overekspresjon av cyclin D1 CDK4 og kunne avskaffe MIR-545-indusert inhibering av celleproliferasjon. I konklusjonen, MIR-545 trykt celleproliferasjon ved å hemme uttrykk for cyclin D1 og CDK4. Våre funn gir ny kunnskap om rollen som MIR-545 i utvikling av lungekreft og indikerer potensiell anvendelse av MIR-545 i kreftbehandling
Citation. Du B, Wang Z, Zhang X, Feng S Wang G, Han J et al. (2014) mikroRNA-545 Undertrykker Cell Proliferation av målretting Cyclin D1 og CDK4 på lungekreft celler. PLoS ONE 9 (2): e88022. doi: 10,1371 /journal.pone.0088022
Redaktør: Liang-Hu Sandsvær, Sun Yat-sen-universitetet, Kina
mottatt: 12. august 2013, Godkjent: 02.01.2014; Publisert: 05.02.2014
Copyright: © 2014 Du et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 30870535 og 90913017), kombinasjonen Prosjekt i Guangdong-provinsen og Kunnskapsdepartementet (No. 2009B090300080 og 2011B090400478), den Introdusert Innovative R D team Program i Guangdong-provinsen (No . 201001Y0104789252) og 863 Program of China (No. 2012AA022501). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Shipeng Feng er ansatt i Guangzhou RiboBioCo, Ltd. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
microRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-kodende RNA som er omtrent 22 nukleotider i lengden [1], [2], og mirnas kan undertrykke posttranskripsjonelt gen-ekspresjon ved binding til de 3′-utranslaterte regioner (3’UTRs) av mRNA, som induserer translasjonell hemming eller mål-mRNA degradering [3].
Cyclin D1 CDK4 og arbeider sammen i samme kompleks for å regulere cellesyklusen G1 /S overgang. Tidligere studier har vist at cyklin D1 CDK4 og er mer rikelig i lunge tumorvev enn i normalt lungevev [4], [5]. En økende mengde av bevis støtter en sentral rolle for cyklin D1 CDK4 og i å fremme kreftcelleformering. Oliver et al. rapportert cyclin D1 som en «sentral element» av malign transformasjon i lungekreft [6]. Følgelig tie cyklin D1 med antisensoligonukleotider kan hemme proliferasjonen av ikke-småcellet lungecancerceller [7]. Disse studiene tyder på at cyklin D1 CDK4 og kan være viktige gener for lungekreft-celleformering.
mirnas er involvert i celleformering [8], differensiering [9], og apoptose [10], og avvikende miRNA uttrykk er knyttet til tumordannelse og progresjon [11] – [14]. Mange studier har vist at mirnas kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener i lungekreft. For eksempel er MIR-17-92 klynge overuttrykkes i lungekreftceller og fremmer celleformering i en lungecancer cellelinje [15]. Videre kan antisensoligonukleotider komplementære til MIR-17-5p og MIR-20a, som er medlemmer av MIR-17-92 klynge, indusere celle apoptose [16]. Men la-7 miRNA fungerer som en tumor suppressor genet i lungekreft og er mindre rik på lungekreftceller enn i normale lungeceller [17]. Overekspresjon av la-7 undertrykker cellevekst i flere lungekreftcellelinjer og transplantater i immunsvikt mus [18]. MIR-34a er en annen viktig tumor suppressor miRNA. MIR-34a er underexpressed i grunnskolen ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) tumorvev sammenlignet med sammenkoblede normalt vev [19]. I tillegg MIR-34a kan hemme NSCLC celleproliferasjon [20]. MIR-210 er overuttrykt ved sene stadier av NSCLC og er involvert i endring av cellelevedyktighet i lunge adenokarsinom A549-cellelinjen [21]. MIR-23 nivå er forhøyet i sera fra NSCLC pasienter sammenlignet med de fra friske personer [22]. Disse rapportene viser at ulike mirnas er involvert i reguleringen av lungekreft.
Målet med denne studien var å identifisere nye mirnas assosiert med lungekreft og å belyse deres funksjoner. Vi benyttet kvantitativ real-time polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR) analyser for å studere miRNA profilen i lungekreft, og resultatene viste at MIR-545 ble underexpressed i lunge tumorvev sammenlignet med tilstøtende ikke-kreft lungevev. Vi fant ut at MIR-545 undertrykker celleproliferasjon ved direkte rettet mot cyclin D1 og CDK4 gener i lunge kreft cellelinjer. Våre resultater tyder på at Mir-545 fungerer som en tumor suppressor i lungekreft.
Resultater
MIR-545 er redusert i Human Lung Cancer Vev
Vi sammenlignet uttrykk for 450 mirnas mellom lungekreft vev og tilstøtende ikke-kreft lunge vev fra 15 pasienter, og vi fant ut at 31 mirnas ble underexpressed (P 0,05, foldendring 0,5) i lungekreft vev sammenlignet med tilstøtende ikke-kreft lunge vev (Fig . S1, Tabell S1 og S2).
for å bekrefte uttrykket av MIR-545, testet vi Mir-545 uttrykk i ytterligere 10 pasienter. Vi fant at MIR-545 nivåer i lunge cancer vev var mindre enn 50% av de i tilgrensende ikke-kreft lungevev hos 14 av de 25 pasientene, mens MIR-545 nivåer i lunge cancer vev var mer enn to ganger de i tilstøtende ikke- kreft lungevev i to av de 25 pasienter (fig. 1a). Analysen av flere sett med sammenlignbare kreft og tilstøtende ikke-kreft lunge vev indikerte at MIR-545 var mindre rik på lungekreft vev enn i tilstøtende ikke-kreft vev (Fig. 1B). Dette tyder på at Mir-545 ble underexpressed i lungesvulster og kan fungere som en tumor suppressor.
(a) Relativ Mir-545 uttrykk i 25 parvise lungekreft tumorvev og tilstøtende ikke-kreft vev. (B) Uttrykk for MIR-545 i lungekreft vev sammenlignet med tilstøtende ikke-kreft vev. 5S rRNA ble anvendt som en intern kontroll. Dataene ble analysert ved hjelp av 2
-ΔΔCt metode. *, P . 0.05 (Wilcoxon test)
MIR-545 Hemmer Cell Proliferation in vitro og in vivo
For å identifisere mirnas som kan være involvert i celledeling, brukte vi CCK-8 kit for å undersøke gjennomførbarheten av A549-celler transfektert med hver av de 31 miRNAs. Vi har funnet at A549-celler transfektert med MIR-545 hadde den laveste celle-levedyktighet (fig. 2).
A549 cellelevedyktighet ble målt ved hjelp av CCK-8 ved 72 timer etter transfeksjon med hver miRNA. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. NC, no-target kontroll; *, P 0,05; **, P . 0,01 (Student t-test)
For å bekrefte at MIR-545 kan undertrykke celleproliferasjon, vi utførte celleviabilitet analysen med tre cellelinjer. A549 og H460 celler transfektert med Mir-545 etterligner viste lavere celleviabilitet enn de transfektert med et nei-target kontrollen (fig 3A og 3B.); Men HFL1 lunge fibroblaster transfektert med en MIR-545 inhibitor viste en mer effektiv celleproliferasjon sammenlignet med de tilført med (Fig. 3 C) en kontroll hemmer.
Transfeksjon med Mir-545 etterligner undertrykker levedyktighet (en ) A549 celler og (b) H460 celler. (C) Transfeksjon med en MIR-545 inhibitor øker levedyktigheten til HFL1 celler. (d) Tumor bilder fra naken mus xenograft modell. (e) Volumer og (f) vekter av tumorer i en naken mus xenograft modell. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05; **, P . 0,01 (Student t-test)
neste brukte en svulst xenograft mus modell for å teste effekten av MIR-545 på tumorprogresjon. De A549-celler ble forbehandlet med MIR-545 etterligner, eller en ikke-target-kontroll og ble deretter injisert i atymiske nakne mus. Tumorvolumet i mus som mottok cellene forbehandlet med MIR-545 etterligner var signifikant (P 0,05) som er mindre enn i mus som mottok celler behandlet med en ikke-target-kontroll. Disse forskjellene i volum og vekt ble observert i tumorer som er høstet fra mus avlivet på dag 48 (fig. 3D, 3E og 3F). Resultatene viser at MIR-545 kan hemme lungekreft cellevekst i en naken mus xenograft modell.
MIR-545 induserer cellesyklus arrest i G0 /G1 fase
En Edu analyse avslørte at både A549 og H460 celler transfektert med Mir-545 etterligner innlemmet mindre edu enn de transfektert med et nei-target-kontroll (fig. 4A-C). I motsetning HFL1 celler transfektert med MIR-545 hemmer innlemmet mer Edu enn de transfektert med kontroll inhibitor (fig. 4D). Disse resultater antyder at MIR-545 kan hemme DNA-syntese. For ytterligere å undersøke reguleringsmekanisme (r) av MIR-545, gjennomførte vi en celle-syklus analysen. En høyere andel av A549 og H460 transfektert med Mir-545 etterligner var i G0 /G1 fase sammenlignet med dem transfektert med et nei-target kontrollen (fig. 4E og 4F). I motsetning til dette, en mindre andel av HFL1-celler transfektert med en MIR-545-inhibitor var i G0 /G1 fasesammenlignet med de transfektert med en kontrollanti miRNA inhibitor (fig. 4G). Disse resultater viser at MIR-545 arrestert cellesyklus i G0 /G1 fase, noe som hemmer DNA-syntese og celledeling. Videre fant vi at MIR-545 indusert celle apoptose og død i A549 og H460-celler (fig. 4H og 4i).
(a) Edu innlemmelse i A549 celler målt ved konfokal laser mikroskopi. Transfeksjon med MIR-545 hemmer DNA-syntese i (B), A549-celler, og (c) H460-celler. (D) Transfeksjon av HFL1 celler med MIR-545 inhibitor øker DNA-syntese. Transfeksjon med MIR-545 øker prosentandelen av celler i G0 /G1 fase i (e) A549 celler og (f) H460-celler (g) Transfeksjon av HFL1 celler med MIR-545 reduserer prosentandelen av celler i G0 /G1 fase . MIR-545 induserer apoptose i (h) A549 og (i) H460 celler. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. NC, no-target miRNA kontroll; *, P 0,05; **, P . 0,01 (Student t-test)
MIR-545 Mål Direkte Cyclin D1 og CDK4
Vi brukte Targetscan programvare for å forutsi mulige mål fra Mir-545 . Blant hundrevis av predikerte mål, valgte vi CASP8AP2, DDX58, cyclin D1, MAF, CDK4 og PRKCE som de antatte mål fordi de kan være involvert i cellesyklus eller apoptose. Vi klonet 3’UTRs av disse gener i plasmidet pmirGlo og undersøkt hvorvidt MIR-545 kan undertrykke ekspresjonen av disse genene av luciferase-assay. Luciferase-analysen viste at MIR-545 etterligner inhiberte aktiviteten av to rapportør konstruksjoner som inneholdt 3’UTR av enten cyklin D1 eller CDK4 (Fig. 5A). Videre, for å teste om cyclin D1 og CDK4 er direkte mål av MIR-545, muterte vi spådde bindingssetet av MIR-545 i 3’UTRs av både gener. Vi fant at MIR-545 ikke hemmer aktiviteten av rapportør konstruksjoner som inneholdt de mutante 3’UTRs (Fig. 5B).
(a) MIR-545 hemmet aktiviteten av luciferase som inneholdt 3’UTR av den cyclin D1 eller CDK4 genet. pmirGlo plasmider som inneholder villtype (WT) 3’UTRs av CASP8AP2, DDX58, cyclin D1, MAF, CDK4, eller PRKCE genet ble ko-transfektert inn i A549 celler med kontroll miRNA eller MIR-545. Luciferase-aktiviteten ble målt 48 timer etter transfeksjon. Den normaliserte forholdet mellom luciferase aktivitet ble beregnet som (Rluc
MIR-545 /Luc
MIR-545) /(Rluc
NC /Luc
NC). (B) MIR-545 ikke hemmer aktiviteten av luciferase-konstruksjoner inneholdende det muterte (Mut) 3’UTR av cyklin D1 eller CDK4-genet. (C) mengde av cyklin D1 CDK4 og proteiner ble analysert på A549, H460, og HFL1 celler ved western-blotting etter transfeksjon behandlinger. (D) Nivåer av cyclin D1 og CDK4 proteiner ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 (Student t-test)
Vi har også undersøkt uttrykk for den endogene cyclin D1 og CDK4 gener på både mRNA og protein nivå.. Vi fant at MIR-545 reduserte nivået av CDK4 mRNA i A549-celler, men påvirket ikke nivået av Cyclin D1 mRNA (fig. S2). Men observerte vi at A549 og H460 celler transfektert med MIR-545 hadde lavere nivåer av både cyclin D1 og CDK4 proteiner enn de transfektert med et nei-target-kontroll (Fig. 5C og 5D). Videre HFL1 celler transfektert med MIR-545-hemmer hadde høyere nivåer av både cyclin D1 og CDK4 proteiner enn de transfektert med NC-hemmere (Fig. 5C og 5D).
MIR-545 undertrykker Tumor spredning av målretting Cyclin D1 og CDK4
for å undersøke om MIR-545 hemmer celle levedyktighet ved å målrette cyclin D1 og CDK4, brukte vi sirnas å hemme uttrykk for cyclin D1 og CDK4 gener; Resultatene var tilsvarende de som er beskrevet ovenfor for MIR-545. For eksempel vil bruken av sirnas taushet enten cyklin D1 CDK4 eller redusert levedyktighet av A549-celler (Fig. 6A). SiRNA-mediert hemming av cyclin D1 og CDK4 gener forårsaket cellesyklus arrest i G0 /G1 fase (Fig. 6B), hemmet Edu innlemmelse (Fig. 6C og 6D) og indusert apoptose i A549-celler (fig. 6E). Dessuten kan overekspresjon av cyclin D1 og /eller CDK4-gener i betydelig grad oppheve MIR-545-indusert inhibering av A549 cellevekst (fig. 6F). Samlet utgjør disse resultatene viser at de cyclin D1 og CDK4 gener er direkte mål av MIR-545.
(a) MIR-545 etterligner og sirnas hemmet A549 celle levedyktighet på 72 timer etter transfeksjon. (B) Den cellesyklus arrestert i G0 /G1 fase etter transfeksjon av A549-celler med MIR-545 og sirnas målretting cyklin D1 CDK4 og. MIR-545 og siRNA induserte hemming av DNA syntese som bestemt ved innlemmelse EDU-analyse ved bruk av (c) konfokal lasermikroskopi og (d) flowcytometri. (E) Underexpression av cyclin D1 CDK4 og induserer celleapoptose i A549-celler. (F) Overuttrykte cyclin D1 og CDK4 opphever hemming forårsaket av MIR-545. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. Student «s t-test ble anvendt for (a) – (e); enveis ANOVA ble brukt for (f).
Diskusjoner
Vår studie viser at MIR-545 er underexpressed i lungekreftsvulster, og MIR-545 har blitt rapportert å være underexpressed i magekreft [23]. Videre MIR-545 hemmer spredning av lungekreftceller både
in vitro Hotell og
in vivo
. Disse resultatene indikerer MIR-545 kan fungere som en tumor suppressor i lungekreft.
Videre undersøkelser viser at cyclin D1 og CDK4 gener er direkte mål av MIR-545. MIR-545 hemmer cyclin D1 og CDK4 genuttrykk ved å gjenkjenne sekvenser i sine 3’UTRs. Dessuten kan overekspresjon av cyclin D1 CDK4 og avskaffe inhibering av proliferasjon forårsaket av MIR-545 etterligner. Disse data tyder på at Mir-545 hemmer celleproliferasjon ved direkte rettet mot cyclin D1 og CDK4. Tidligere studier rapporterer at ekspresjon av cyclin D1 CDK4 og i humane lungekreft vev er betydelig høyere enn i normalt lungevev [7], [8]. Våre resultater tyder på at overekspresjon av cyclin D1 CDK4 og i lungekreft vev kan delvis skyldes den underexpression av MIR-545.
I konklusjonen, miRNA profilerings resultatene viser at MIR-545 er mindre rik på human lungekreft vev enn i tilstøtende ikke-kreft lunge vev. MIR-545 hemmer spredning av lungekreftceller ved å undertrykke uttrykket av cyclin D1 og CDK4 gener. En forbedret forståelse av MIR-545 feilregulering i lungekreftceller bidrar til vår forståelse av de molekylære mekanismene som er ansvarlig for lungekreft. Videre kan MIR-545 være et potensielt mål for lungekreft terapeutisk behandling.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Vi har innhentet skriftlig informert samtykke fra alle pasienter, og alle protokoller ble godkjent av Institutional Review Board of First Affiliated Hospital i Guangzhou Medical College. Alle menneskelige materialer ble brukt i samsvar med politikken til Institutional Review Board. Den dyrestudie Forslaget ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Guangzhou Institutes of biomedisin og helse (IACUC 2.012.010). Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer dyr ble utført i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og ble utført i henhold til de institusjonelle etiske retningslinjer for dyreforsøk.
Cellelinjer
Den menneskelige lunge kreft cellelinjer A549 (ATCC) og NCI-H460 (H460, ATCC) ble hentet fra Dr. Duanqing Pei Lab på Guangzhou Institutes of biomedisin og helse og ble dyrket i RPMI-1640 medium (1640, GIBCO, NY, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone, Utah, USA). Den normale lunge fibroblastcellelinje HFL1 ble kjøpt fra Chinese Academy of Sciences Cell Bank of Type Culture Collection (CBTCCCAS, Shanghai, Kina) og ble dyrket i F-12K medium (Jinuo, Hangzhou, Kina) supplert med 10% FBS. Alle celler ble dyrket i en fuktig atmosfære som inneholder 5% CO
2 ved 37 ° C.
vevsprøver innhentet fra lungekreftpasienter
Begge kreft og tilstøtende ikke-kreft lunge vevsprøver ble hentet fra Guangzhou Institute of Respiratory Disease, som er forbundet med den første Affiliated Hospital i Guangzhou Medical University (Guangzhou, Kina). Kirurgisk fjernet prøver ble lagret i flytende nitrogen inntil bruk. De relevante kjennetegn ved de studerte fagene er vist i tabell S3.
Transfeksjon
Alle sirnas, miRNA etterligner og miRNA hemmere ble kjøpt fra Guangzhou RiboBio (RiboBio, Guangzhou, Kina) og transfekterte inn celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Life Technologies, CA, USA) som anbefalt av produsenten. -Celler ble transfektert med miRNA etterligner og inhibitorer ved en konsentrasjon på 50 nM. Sekvensene til sirnas er som følger: si-cyclin D1 forstand, 5′-UGG UGG AAU AAU AGC UUC UdTdT-3 «, antisense, 3′-dTdAA CCU UAU CGA AGA CCU UAA-5′; si-CDK4 forstand, 5»-CAG CCG AAA CGA UCA AGG AdTdT-3 «, antisense, 3′-dTdTG UCG GCU UUG CUA Guu CCU-5».
Cell Proliferation Assay
celleproliferasjon ble målt ved hjelp av celletelling Kit 8 reagens (CCK-8, DOJINDO, Kyushu, Japan) eller CellTiter-Glo reagens (Promega, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
edu Cell Proliferation Assay
inkorporering av tymidinanalog 5-etynyl-2′-deoksyuridin (eDU) i DNA ved DNA-replikasjon kan brukes til å måle celler som gjennomgår DNA-replikasjon. Prosentandelen av celler som omfatter Edu ble evaluert ved hjelp av Cell-Light Edu bildebehandlings påvise sensoren ved å følge produsentens instruksjoner (RiboBio, Guangzhou, Kina).
Cell Cycle analysen
Cellene ble høstet 72 timer etter transfeksjon og faste over natten i 70% iskald etanol. Etter fiksering ble cellene behandlet med 500 ng /mL av RNase A i 30 minutter og deretter farget med 50 ng /ul av propidiumjodid (PI) i 20 min. Cellene ble kvantifisert ved bruk av fluorescens aktivert celle sortering (FACS, BD, NJ, USA), og dataene ble analysert ved FlowJo programvare (Tre Star, OR, USA).
Cell apoptose analysen
celle apoptose analyse ble utført med PE Annexin V apoptose Detection Kit i (BD, NJ, USA) i henhold til produsentens protokoll, og cellene ble analysert ved hjelp av FACS (BD, NJ, USA).
RNA utvinning og QRT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra cellelinjer og vevsprøver ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Life Technologies, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Syntese av cDNA ved anvendelse av M-MLV revers transkriptase (Promega, WI, USA) ble utført som foreslått av fabrikanten, og tilfeldige primere (Takara, Shiga, Japan) ble brukt for mRNA. QRT-PCR-analyser ble utført ved hjelp av SYBR Grønn RealMasterMix kit (Tiangen, Beijing, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Revers transkripsjon og QRT-PCR for miRNA ble utført ved hjelp av Bulge-Loop miRNA QRT-PCR Primer Set (RiboBio, Guangzhou, Kina). Dataanalyse ble utført ved hjelp av to
-ΔΔCt metoden [24]. De følgende primere ble brukt for analyse: cyklin D1 forover-primer, 5′-CAA ATG GAG CTG CTC CTG GTG-3 «, revers primer, 5′-CTT CGA TCT GCT CCT GGC AGG-3′; CDK4 forover-primer, 5»-TGC CAA TTG CAT CGT TCA CCG AG-3 «, revers primer, 5′-TGC CCA ACT GGT CGG CTT CA-3′; aktin forover-primer, 5»-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3 «, revers primer, 5′-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′; og 5S rRNA fremover primer, 5»-ACG GCC ATA CCA CCC TGA AC-3 «, reverse primer, 5′-GGC GGT CTC CCA TCC AAG TA-3».
Plasmid Construction
de 3’UTRs av cyclin D1 og CDK4 gener ble klonet inn i pmirGlo plasmid (Promega, WI, USA) mellom
Xho
jeg og
Xba
i områder ved hjelp av følgende primere: cyclin D1 villtype 3’UTR forover-primer, 5′-ATA TCT CGA GCA GGT GCT CCC CTG ACA GTC CCT-3 «, revers primer, 5′-TAA AGA TCT TGG AAA CAT GCC GGT TAC ATG TTG GT-3′; CDK4 villtype 3’UTR forover-primer, 5»-ATA TCT CGA GGC AAT GGA GTG GCT GCC ATG GAA-3 «, revers primer, 5′-TAA AGA TCT TTG ACA CAG AGT CTT GCT CTG TTG CCC A-3» .
pmirGlo plasmider som inneholder muterte cyclin D1 eller CDK4 3’UTR ble bygget ved hjelp av KOD-plus mutagenese kit (Toyobo, Osaka, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner.
den åpne lese ramme uttrykk vektorer pReceiver_M02_cyclin D1, pReceiver_M02_CDK4, og kontrollvektor pReceiver_M02 ble kjøpt fra FulenGen Corporation (GeneCopoeia, MD, USA). Alle sekvensene innsatt eller muterte ble bekreftet ved sekvensering.
Dual-luciferase-analysen
Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater 1 dag før transfeksjon. Mirna ligner (50 Nm) og plasmid (5 ng /mL) ble co-transfektert inn i A549 celler. På 48 timer etter transfeksjon, ble luciferase aktivitet målt ved hjelp av Dual-Glo luciferase assay kit (Promega, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Western Blotting
Celler ble høstet og resuspendert i SDS buffer (Beyotime, Shanghai, Kina) for utarbeidelse av totale proteinekstrakter. I korthet, ble total proteinekstrakt adskilt av 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese og overført til en Immobilon-P overføring polyvinylidenfluorid-membran (Millipore, MA, USA). Membranen ble inkubert ved romtemperatur i 5% bovint serumalbumin (BSA) fremstilt med TBS-T-buffer i 2 timer. Membranen ble inkubert med primært antistoff fortynnet 1:1,000 med 1% BSA ved 4 ° C over natten. På den følgende dag, ble membranen inkubert med sekundær pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert antistoff fortynnet 1:5,000 med 1% BSA ved 4 ° C i 6 timer. Membranen ble visualisert etter inkubasjon i HRP-substrat (BeyoECL pluss A /B, Beyotime, Shanghai, Kina). Antistoffene som brukes i denne studien var anti-cyclin D1 (sc-8396, Santa Cruz, CA, USA), anti-CDK4 (sc-260, Santa Cruz, CA, USA), anti-β-aktin (A2066, Sigma, MO, USA), HRP-konjugert anti-mus IgG (sc-2005, Santa Cruz, CA, USA), og HRP-konjugert anti-kanin IgG (sc-2004, Santa Cruz, CA, USA).
tumorxenografter
at 6 timer etter transfeksjon av MIR-545 etterligner eller kontrollere miRNA, ble A549-cellene høstet og suspendert i fosfat-bufret saltløsning ved en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler /ml og injiseres inn i hver side av den bakre flanke av den samme BALB /c atymiske nakne mus (5-6 uker gamle) med 100 ul cellesuspensjon. Tumorvekst ble målt hver 4. dag. Tumorvolum (V) ble overvåket ved å måle lengden (L) og bredden (W) av tumoren med målepunkter, og ble beregnet ved hjelp av formelen V = (L x W
2) /2 [25].
Statistical Analysis
dataene er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). P 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 16.0 programvare (Chicago, IL). Students t test ble benyttet for å analysere betydningen mellom to grupper. Én-veis analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å teste den betydning mellom mer enn to grupper. Analysen av miRNAs uttrykk i klinisk prøve ble utført ved hjelp av Wilcoxon test.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
miRNA uttrykket i lungekreft vev og tilstøtende ikke-kreft vev. Uttrykk for mirnas måles med QRT-PCR. 5S rRNA ble anvendt som en intern kontroll. Heatmap representerer overekspresjon (rød) og underexpression (grønn) av miRNAs. Manglende data er representert med grå farge
doi:. 10,1371 /journal.pone.0088022.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Cyclin D1 CDK4 og mRNA ble målt ved QRT-PCR. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 (Student t-test)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0088022.s002 plakater (TIF)
Tabell S1. .
Uttrykk for miRNAs i lungekreft vev og ikke-kreft lunge vev
doi: 10,1371 /journal.pone.0088022.s003 plakater (DOC)
Tabell S2.
Relativ uttrykk for 450 mirnas
doi:. 10,1371 /journal.pone.0088022.s004 plakater (XLS)
tabell S3. Bedrifter Den kjennetegn ved kliniske pasienter lungekreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0088022.s005 plakater (DOC)
Takk
Vi er takknemlige til Dr. Pei Duaquing for gaven av A549 og H460 cellelinjer.
