Abstract
Tykktarmskreft er den tredje største årsaken til kreft-dødsfall i den vestlige verden.
In vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter viste at omega-3 flerumettede fettsyrer (n-3 PUFA) kan dempe spredning av kreftceller, inkludert tykktarmskreft, og øke effekten av ulike kreft narkotika. Men disse studiene møte effektene av n-3 flerumettede fettsyrer på hoveddelen av tumorceller og ikke på de udifferensierte tykktarmskreft stilk-lignende celler (CSLCs) som er ansvarlig for tumordannelse og vedlikehold. CSLCs har også vært knyttet til oppkjøpet av kjemoterapi motstand og til tumor tilbakefall. Colon CSLCs har immunophenotyped bruke flere antistoffer mot cellulære markører inkludert CD133, CD44, EpCAM, og ALDH. Anti-CD133 er blitt brukt for å isolere en populasjon av tykktarmskreftceller som beholder stamceller egenskaper (CSLCs) fra begge etablerte cellelinjer og primære cellekulturer. Vi demonstrerte at n-3 flerumettede fettsyrer, eicosapentaensyre (EPA), var aktivt inkorporert i membranlipider av COLO 320-celler DM. 25 um EPA redusert celle nummer av den samlede befolkningen i kreftceller, men ikke av de CD133 (+) CSLCs. Også, observerte vi at EPA indusert nedregulering av ekspresjon CD133 og oppregulering av kolonepitelet differensieringsmarkører, Cytokeratin 20 (CK20) og mucin 2 (MUC2). Til slutt, demonstrerte vi at EPA økte følsomheten av COLO 320-celler (DM total populasjon) til både standard-of-care kjemoterapier (5-fluorouracil og oksaliplatin), mens EPA økt sensitivitet av CD133 (+) CSLCs til bare 5- fluorouracil
Citation:. De Carlo F, Witte TR, Hardman WE, Claudio PP (2013) Omega-3 eikosapentaensyre Reduserer CD133 Colon Cancer Stem-Like Cell Marker Expression Mens øker følsomhet for kjemoterapi. PLoS ONE 8 (7): e69760. doi: 10,1371 /journal.pone.0069760
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 14 februar 2013; Akseptert: 12. juni 2013, Publisert: 16.07.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Forfatterne ønsker å takke for den Marshall University biokjemi og mikrobiologi Kirurgiske avdelinger for deres støtte. De foreliggende studiene ble støttet av en bevilgning av Bean Foundation, og delvis av NIH tilskudd CA131395, CA140024, og WV-INBRE 5P20RR016477 (til PPC) og delvis av NIH gi R01CA114018 og DOD tilskuddet W81XWH-10-1-0697 ( til WEH). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Cancer Institute eller National Institute of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje største dødsårsaken av kreft i den vestlige verden, og hvert år er ansvarlig for en halv million dødsfall på verdensbasis [1], [2]. Til tross for mottak kirurgisk reseksjon og kjemoterapi, nesten 50% av pasientene utvikler resistens, tumor tilbakefall, eller metastatisk sykdom [2], [3]. Nyere funn har vist at dette kan skyldes, i hvert fall delvis, til eksistensen av kreft stamceller lignende celler [4], og dette understreker behovet for bedre behandling som kan målrette dem.
En økende mengde bevis understøtter ideen om at human kreft kan betraktes som en stamcelle sykdom. Kreften stamceller modell foreslår at bare en fraksjon av celler i en tumor har kreft initiere potensial og at disse kreft stilk-lignende celler (CSLCs) er i stand til å initiere og opprettholde tumorvekst [5], [6]. Ricci-Vitiani [4] og O’Brian [7] var den første til å gi uavhengige bevis for eksistensen av kolon CSLCs. De isolerte en CD133 (+) populasjon av celler i tumoren som var i stand til å vokse som udifferensierte kolon-kuler i et serumfritt medium, som kan bli differensiert i den heterogene tumorcellepopulasjon. De viste at bare den CD133 (+) subpopulasjonen var tumorigen i en serie xenograft analyse i immunsvikt NOD /SCID-mus. Nylig har det blitt vist at CD133 kan også brukes til å identifisere CSLCs i etablerte cellelinjer. CD133 (+) celler isolert fra cancercellelinjer er blitt funnet å være mer tumorigen enn CD133 (-) cellulær fraksjon begge
in vitro
og
in vivo product: [8]. I tillegg, CD133 (+) celler, dyrket i kuler, opprettholde ekspresjon av denne markøren selv ved langtids sfære kultur [9]. Nyere bevis fra kliniske studier viste at CD133 uttrykk var negativt korrelert med pasientens prognose i avansert tykktarmskreft [10], [11].
Epidemiologiske studier har vist en økt forekomst av tykktarmskreft i populasjoner forbruker en vestlig diett, rik på rødt kjøtt, animalsk fett, og lite korn. Denne forekomst er redusert hos personer som bruker større mengder av frukt, grønnsaker, fibre, og, enda viktigere, n-3 flerumettede fettsyrer (PUFA) av marin opprinnelse [12], [13]. Den overordnede n-3 PUFA α-linolensyre (ALA) er funnet i vegetabilsk olje, mens dens metabolitter eikosapentaensyre (EPA) og decosahexaenoic syre (DHA) oppnås hovedsakelig fra kaldtvanns fet fisk. Mye data har blitt publisert om evnen til n-3 PUFA å redusere spredning, for å utøve en pro-apoptotisk effekt, og for å hemme angiogenese i flere
in vitro
modeller av tykktarmskreft [14] – [17] . Omega-3 PUFA er også blitt vist å øke sensitiviteten til kjemoterapi av flere humane cancer-cellekulturer avledet
in vitro
slik som bryst [18], hjerne og lunge [19], lymfocytisk [20], og colonic [15]. På lignende måte, n-3 PUFA sensibiliserte
in vivo
modeller av brystkreft [21], sarkom [22], og leukemi [23] til anticancerterapi. Men alle disse studiene adressert effekten av PUFA behandlinger på mesteparten av kreftceller, ikke på CSLCs.
Den antitumor aktivitet av n-3 PUFA har ikke bare vært knyttet til deres virkninger på spredning og apoptose men også på differensiering i forskjellige cellemodeller. En kobling mellom omega-3 PUFA og fremming av celledifferensiering er allerede blitt beskrevet i normale og maligne celler [24] – [28]. Omega-3 flerumettede fettsyrer har vist seg å differensiere myeloide forløperceller i benmargen hos mus uten å endre antallet hvite blodceller i omløp [24]. På lignende måte er det blitt vist at langvarige behandlinger av EPA og DHA, som ikke endrer morfologi eller gjennomsnittlig antall av celler i krypten delen av normal tarmslimhinnen hos rotter, fikk redusere cellulær proliferasjon, forbedre differensiering og apoptose [29].
i tillegg er behandling av humane brystcancerceller med n-3 flerumettede fettsyrer ført til deres veksthemming, som var proporsjonal med melkekjertelen differensiering [27], og en pro-differensierende virkning ble også observert i DHA behandlede humane melanomceller
in vitro product: [26].
formålet med vår studie var å undersøke om
in vitro
konsentrasjoner av EPA lik plasmanivåer oppnåelig i menneske~~POS=TRUNC kroppen~~POS=HEADCOMP følgende tilskudd av dietten med 2,4 g n-3 /dag [30], var i stand til å påvirke differensiering status og kjemosensitivitet av den samlede befolkningen i tykktarm kreft celler og spesielt av de CD133 (+) CLSCs.
Materialer og metoder
Cell kultur
den menneskelige tykktarms adenokarsinom cellelinje COLO 320 DM (CCL-220, Duke C) ble oppnådd fra America Type Culture Collection (Rockville, MA). Colo320DM celler ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, penicillin 100 enheter /ml og streptomycin 100 ug /ml (HyClone, South Logan, UT). Celler ble subdyrket ved en tetthet på 1 x 10
5 /ml to ganger i uken i en fuktig atmosfære ved 37 ° C, 5% CO
2.
kjemikalier og medikamenter
eikosapentaensyre, EPA (omega-3 flerumettede fettsyrer, 20:05) ble kjøpt fra Cayman Chemicals (Ann Arbor, Michigan) og stearinsyre (SA, mettede fettsyrer, 18:0) fra Sigma-Aldrich (St. Louis , MO). 100 mm lager løsninger av EPA og SA i absolutt etanol ble gjort og fortynnet til endelig konsentrasjon med kulturmedier.
oksaliplatin og 5-Fluorouracil ble kjøpt av Alexis Biochemicals (Farmingdale, New York). 12.6 mM stamløsninger av oksaliplatin og 384,3 mM 5-Fluorouracil i DMSO ble laget og fortynnet til den endelige konsentrasjon med kulturmedier.
Kontrollceller ble behandlet med den samme mengde av kjøretøy, etanol eller DMSO (CTRL VH). Sluttkonsentrasjonene kjøretøy aldri oversteg 0,1% v /v.
gasskromatografi
COLO 320 DM ble sådd ut i 100 mm petriskåler (1 x 10
6 celler) og behandlet etter fire timer med bærerkontroll eller en rekke konsentrasjoner av EPA og SA (6,25 uM 12,5 uM, 25 uM). Fettsyresammensetninger av COLO 320 DM ble vurdert ved hjelp av gasskromatografi. CTRL VH og behandlede celler ble høstet etter 96 timer, vasket i PBS1X for å fjerne overflate lipider, deretter homogenisert i destillert vann med 0,1% BHT (3,5-di-
tert
-butyl-4-hydroksy-toluen ) i metanol for å forhindre fettsyreoksidasjon. Lipidene ble ekstrahert med kloroform /metanol, og deretter transmetylert. Metylerte lipider ble separert og identifisert ved hjelp av gass-kromatografi, som tidligere publisert [31]. Fettsyremetylester standarder (Nu-Chek-Prep, Elysian, MN) ble anvendt for topp identifikasjon.
De enkelte fettsyremetylestere av EPA, DPA (decosapentaenoic syre), DHA og, SA ble rapportert som den prosent av summen av de totale fettsyrene metylerte (areal under kurven).
Metabolsk aktivitetsanalyse (MTT måle) tidsforløpet
COLO 320 DM-celler ble sådd ut i 96-brønners plater (3000 celler /brønn). Etter 4 timer ble cellene behandlet med en rekke konsentrasjoner av EPA og SA (6,25 uM 12,5 uM, 25 uM) eller bærerkontroll (CTRL VH) i 0-4 dager. Cellene ble så analysert daglig i metabolsk aktivitet ved MTT-analyse. I korthet ble 10 ul av 5 mg /ml MTT (3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i 2 timer i en fuktig atmosfære ved 37 ° C, 5% CO
2. Etter denne tid mediet ble fjernet, ble formazan salt dannet oppløst med DMSO og absorbansen ble avlest ved 570 nm med en mikroplateleser.
Celleantall og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse
COLO 320 DM ble sådd i en 24-brønns plate (2,5 x 10
4 /brønn) og behandlet etter 4 timer med en rekke konsentrasjoner av EPA eller SA (6,25 uM 12,5 uM, 25 uM) i 96 timer. Levedyktige celler ble telt ved bruk av en trypan blå eksklusjon metode. Deretter ble cellene suspendert i kald FACS-buffer (PBS1X, 2 mM EDTA, 0,1% BSA) og porsjoner av celler, 2 x 10
5 celler /50 ul, ble merket med den passende konsentrasjon av monoklonalt antistoff mot CD133 /2 ( 293C3), phycoerytrin konjugert (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland). En isotype antistoff ble anvendt som en kontroll-antistoff for bakgrunn normalisering. Analysen ble utført med en Accuri-C6 Flowcytometer (BD Accuri cytometere, Ann Arbor, MI). Etter at prosentandelen av positivitet til CD133 ble bestemt antall CD133 (+) og CD133 (-). Negative celler i den totale befolkningen ble beregnet
Real Time PCR
COLO 320 DM var sådd ut i 100 mm petriskåler (1 x 10
6 celler) og behandlet med bærer, EPA, eller SA (25 uM). Cellene ble høstet etter 48 og 96 timer, og total RNA ble ekstrahert fra prøvene ved hjelp av Trizol i henhold til produsentens protokoll (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). RNA ble oppløst i ddH2O og nukleinsyre-konsentrasjonen ble målt ved hjelp av et Nano-Drop 2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). RNA (1 ug) ble utsatt for reverse-polymerase chain reaction ved hjelp av en High Capacity cDNA transkripsjon Kit (Applied Biosystems, Foster City, California) og Real-time PCR ble utført med RT2 SYBR Grønn /ROX qPCR Master Mix ved hjelp av en ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California). Relative endringer i genuttrykk ble beregnet ved hjelp av to-ΔΔCt metode, beskrevet av Livak og Schmittgen [32]. β-Actin ble brukt som husholdningsgenet
β
aktin-F
. GGT TCC GCT GCC CTG AGG;
β
aktin-R
: GTC CAC GTC ACA CTT CAT G.
Spesifikke par av primere ble brukt til å forsterke gener av interesse:
CD133-F
: TTG GCT CAG ACT GGT AAA TCC C;
CD133-R
: ATA GGA AGG ACT CGT TGC TGG T;
CK20-F
: ACC TCC CAG GCC TTG AGA T;
CK20-R
: TGG CTA ACT GGC TGC TGT AA;
MUC2-F
: GGG ACT GTG AGT GCT TCT GC;
MUC2-R
: AGT GGA TGC CGT TGA TGG T.
Western blotting
COLO 320 DM ble belagt i 100 mm petriskåler (1 x 10
6 celler) og behandlet med bærer, EPA eller SA (25 uM) i 48 og 96 timer. Totale proteiner ble ekstrahert fra cellene etter lyse i kald prøvebuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris /HCl, pH 8, 0,5 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1% Triton X-100). Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ble utført i henhold til Laemmli-metoden [33]. Like mengder av de totale proteinene av hver prøve ble underkastet elektroforese og deretter overført til 0,45 um nitrocellulosemembraner. Etter blokkering i 5% fettfri melk i TBS-T, ble membraner inkubert med følgende antistoffer: Anti-CD133 /1 (AC133 Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland), Anti-Cytokeratin 20 (EPR1622Y Abcam, Cambridge, MA ). Anti-P Actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble anvendt som kontroll lasting. Etter inkubasjonen med pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff ble visualisert ved immunokomplekser forbedret kjemiluminescens påvisningssystem (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Bilder ble ervervet ved hjelp av Luminary /FX bildesystem (Fotodyne, Hartland, WI). Densitometry ble utført med bilde j 1,45 programvare (bildebehandling og analyse i Java) (imagej.nih.gov/ij/download/).
Dot Blotting
Dot blot ble utført som tidligere beskrevet [34]. Kort sagt ble COLO 320 DM belagt, behandlet med bærer, EPA eller SA (25 uM) i 48 og 96 timer og proteinene ble ekstrahert som beskrevet i Western blot-analyse delen. Like mengder av de totale proteinene av hver prøve ble flekket på en 0,45 um nitrocellulosemembran. Et peptid kompetitive analyser ble utført for å bekrefte spesifisiteten av Muc-2-antistoff (Pierce, ThermoScientifics, Waltham, MA). 300 ug av skreddersydde peptid (CPDFDPPRQENETWW, peptid 2.0, Chantilly, VA) med en identisk sekvens med den som brukes til å generere den Muc-2-antistoff ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur med 1 ug av MUC-2-antistoff. Etter blokkering i 5% fettfri melk i TBS-T, ble membranene inkubert med anti-MUC-2 og anti-p-aktin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) som kontroll. Etter inkubasjonen med pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff, ble immunokomplekser visualisert og fotografert som beskrevet i Western blot-analyse seksjon.
Isolation of Cancer stamceller populasjons
CSCLs ble isolert ved anvendelse av en CD133 mikro kit (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland). COLO 320 DM total cellepopulasjon ble merket med et monoklonalt antistoff CD133 /2 (293C3) konjugert til mikroperler og CD133 (+) celler ble sortert magnetisk. En porsjon av cellene ble eluert fra kolonnen ble merket med et monoklonalt antistoff mot CD133 /1, phycoerytrin konjugert (AC133, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland) og en FACS-analyse ble utført for å vurdere den prosentandel av renheten av CD133 (+) celler.
Vekst-hemming analysen
COLO 320 DM celler ble belagt i 96-brønners plater (3000 celler /brønn). Etter 4 timer ble cellene behandlet i 24 timer med en rekke konsentrasjoner av oksaliplatin (0,005 til 0,1 mM) eller 5-fluoruracil (0,05 til 2 mM) for å bestemme konsentrasjonen som forårsaker 25% og 50% av veksthemning. Cellene ble deretter analysert for deres metabolske aktivitet ved en MTT-analyse.
kjemosensitivitet analysen
COLO 320 DM (3 × 10
3) celler /brønner, total befolkning eller CD133 (+) , ble platet ut i 96-brønners plater. Etter 4 timer, komplett medium supplert med kjøretøyet, EPA, eller SA ble tilsatt for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 25 uM fettsyrene. Etter 48 timer ble mediet erstattet med friskt medium supplert med et utvalg av oxaliplatin (0,005 til 0,1 mM) eller 5-fluorouracil (0.05-2 mM) konsentrasjoner. Etter 24 timers behandling en MTT-analysen ble utført for å definere den hemmende konsentrasjon som fører til en reduksjon i levedyktigheten til 25% (IC25) og 50% (IC50).
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført minst tre ganger, og presentert som gjennomsnitt ± SD. Alle data ble analysert ved bruk av Prism © programvare (Graphpad, Inc., La Jolla, CA). Én-veis analyse av varians (ANOVA) med Tukey multiple sammenligninger post-test ble anvendt for å bestemme statistisk signifikans av forskjellene mellom forsøksgruppene.:
p
-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
eikosapentaensyre er registrert og metaboliseres av COLO 320 DM celler
for å vurdere innarbeiding av fettsyrer til Colo 320 DM celler vi analyserte fettsyrer sammensetningen av gasskromatografi etter behandling med EtOH (CTRL VH) eller med en rekke konsentrasjoner (6,25 um, 12,5 um, 25 uM) av PUFA n-3, EPA, eller mettet fettsyrer SA. Etter 96 timer ble cellene høstet og de totale lipider ble ekstrahert. Først oppdaget vi at SA er 30 ganger mer representert i styre kjøretøyet total lipid cellemembranen enn EPA, DPA og DHA. Vi har observert (figur 1A) en signifikant dose som reagerer økning av EPA i cellene behandlet med denne fettsyren. Videre fraksjonen svarende til DPA, som er en metabolitt EPA, også økt etter EPA behandling. Resultatene viste at COLO 320 DM celler innlemmet og effektivt metaboliseres EPA. På lignende måte observerte vi en doseavhengig økning av SA innhold i den totale lipider fra COLO 320 DM behandlet med stearinsyre (figur 1B).
Totalt lipider ble hentet fra COLO 320 DM celler behandlet i 96 timer med kontroll kjøretøy (CTRL VH) eller et område av konsentrasjoner av (A) EPA eller (B) SA, (6.25-12.5-25 uM). Gasskromatografi ble utført for å studere den fettsyrer inkorporering og deres metabolitter av COLO 320-celler DM. Resultatene er presentert som relativ prosent i forhold til det CTRL VH. Resultatene representerer gjennomsnittet ± SD av minst tre forsøk.
Svarte striper
: sammensatte brukes til behandling oppdages med GC;
Lys grå barer
: DPA (
docosapentaensyre
, C22: 5, n-3);
Mørk grå barer: DHA (dokosaheksaensyre, C22: 6, n-3)
. (SA: stearinsyre C18: 0).
25 um eikosapentaensyre behandling redusert celle antall COLO 320 DM celler uten å påvirke CSLCs befolknings
Flere linjer av bevis har vist eksistensen av en liten populasjon av kreft stilk-lignende celler som kan initiere og opprettholde tumorer. Bruk av spesifikke markører, inkludert CD133 for kolon CSLCs, har tillatt forskere å merke disse cellene og skille mellom CSLCs befolkningen og mesteparten av svulsten [4], [7]. Omega 3 fettsyrer har allerede blitt rapportert å redusere mesteparten av kreftceller [14] -. [17], men effekten på CSLCs er ikke fastslått
Figur 2A og Tabell 1 viser at et tidsforløp behandling (0-96 timer) med 25 uM EPA betydelig redusert antall COLO 320 DM (total populasjon), som målt ved MTT-analysen med hensyn til bærerkontrollen (p 0,01 til 72 timer, og p 0,001 til 96 timer). Behandlinger med 25 uM SA redusert til en mindre grad celletallet av COLO 320 DM celler (figur 2B og tabell 1).
COLO 320 DM-celler ble behandlet i 0-96 timer med bærerkontroll (CTRL VH ) eller 6.25-12.5-25 uM av (A) og EPA (B) SA. MTT analyse av EPA og SA behandlede celler vs. kjøretøykontroll (CTRL VH) behandlede celler.
p
verdier ble beregnet med en-veis ANOVA test med en Tukey multiple sammenlignings post-test på de forskjellige behandlingene innenfor hvert tidspunkt. * P≤0.05; ** P≤0.01; *** P≤0.001; n = 5. COLO 320 DM-celler ble også behandlet i 96 timer med bærerkontroll (CTRL VH) eller et område av konsentrasjoner av fettsyrer (6.25-12.5-25 UM), (C) og EPA (D) SA. Levedyktige celler ble telt og merket med et monoklonalt antistoff anti-CD133 for å bestemme prosentandelen av CD133 (+) celler i de behandlede gruppene. Resultatene representerer CD133 (+) og CD133 (-) celletall på ± SD av minst tre forsøk.
p
verdiene ble beregnet med t-test på behandlede prøver vs. CTRL VH (* p≤0.05).
For å definere hvilket mobiltelefon befolkningen (bulk av tumor eller CSLC) ble påvirket, vi først behandlet COLO 320 DM med en rekke konsentrasjoner av EPA eller SA (6,25 um, 12,5 uM, 25 uM) i 96 timer. EPA annen måte påvirkes de to cellulære sub-populasjoner (CD133 (+) og CD133 (-) celler). En trypanblått celletall ble utført etter vi merket porsjoner av behandlede og ubehandlede celler med et monoklonalt antistoff mot CD133 /2 (glykosylert epitop 2). En fluorescens-aktivert cellesorteringsanalyse ble utført for å bestemme prosentandelen av celler positive for CD133 og for å beregne antall CD133 (+) celler i den samlede populasjonen for hver behandlet prøve. Figur 2C viser at behandling med EPA signifikant redusert (p 0,05) antallet CD133 (-) celler (bulk av tumor), ved den fysiologiske konsentrasjon på 25 uM. Interessant, CD133 (+) CSLCs populasjonen ble bare knapt påvirket av den samme konsentrasjonen av EPA (25 uM) som forårsaket en reduksjon i celletallet i CD133 (-) sub-populasjon. Behandlingen med SA, som er en mettet fettsyre, ikke i betydelig grad endre enten CD133 (+) eller CD133 (-) celle nummer (figur 2D). I konklusjonen, viste vi at 25 um EPA betydelig redusert antall COLO 320 DM parten av kreftceller, men at SA ikke.
eikosapentaensyre induserte en økning i colonic epitel differensiering markører, Cytokeratin 20 og mucin 2 , mRNA uttrykk mens avtagende CSLCs markør, CD133
mellom~~POS=TRUNC Cytokeratin 20 er uttrykt i epitelceller i mage-tarmkanalen. CK20 har vist seg å bli nedregulert eller dets ekspresjon blir helt borte i et antall av kolorektal kreft pasientprøver i forhold til den tilstøtende normal slimhinne [35] – [37]. Tilsvarende er MUC2 mindre uttrykt i kolorektal adenokarsinom, mens dets ekspresjon opprettholdes i normalt vev tilstøtende til malignitet [38] – [40]
CD133 har blitt rapportert å spesifikt merke liten udifferensiert populasjonen av tumor initiering. cellene i tykktarmskreft [4], [7], og å være assosiert med dårlig prognose i avansert kreft i tykktarmen [10], [11]. For å forstå hvis EPA endret genuttrykk av CK20, MUC2, og CD133, behandlet vi COLO 320 DM for 48 og 96 timer med 25 um EPA, SA, eller kjøretøy kontroll. Vi observerte at EPA induserte en økning i de relative mRNA-nivåer av CK20, finnes på både enterocyte og slimceller (figur 3A), og av slimceller markør MUC2 (figur 3B), sammenlignet med de bærerbehandlede celler. De observerte effektene var statistisk signifikant i begge 48 og 96 timer for CK20 og på 96 timer for MUC2. Vi observerte også at EPA induserte en nedgang i uttrykk av CD133 CSLCs markør på 48 og 96 timer (figur 3C) (p 0,05 og 0,01). SA (figur 3A, 3B) betydelig redusert CK20 ved 48 timers behandling uten å påvirke MUC2 uttrykk. Vi observerte også at SA, på den annen side øket CD133 RNA-ekspresjon (figur 3C) ved 96 timer etter behandling. Disse dataene tyder på at omega-3 har en pro-differensiering effekt på COLO 320 DM celler.
COLO 320 DM celler ble behandlet med kjøretøy kontroll (CTRL VH) og 25 uM av EPA eller SA for 48 og 96 timer . Totalt RNA ble ekstrahert og Real-Time RT-PCR ble utført for å studere den relative forandring i gen-ekspresjon av spesifikke markører når sammenlignet med p-aktin. Uttrykket av de differensieringsmarkører (A) cytokeratin-20 (CK20), en enterocytter og slimceller markør, (B) mucin-2 (MUC2) en slimceller markør, og (C) tykktarmskreft stilk-lignende celler marker CD133 var studert etter behandlinger med kjøretøykontroll (CTRL VH), EPA eller SA. Resultatene representerer gjennomsnittet ± SD av minst tre forsøk.
p
verdiene ble beregnet med t-test på behandlede prøver vs. CTRL VH (* p≤0.05, ** p≤0.01).
25 um eikosapentaensyre øker Cytokeratin 20 proteinsyntesen samtidig redusere CD133 i COLO320 DM celler
for å finne ut om endringen i mRNA uttrykk korrelert til en effekt på CK20, mucin 2, og CD133 proteinsyntesen, vi hentet den totale proteininnhold fra COLO 320 DM følgende behandling i 48 og 96 timer med bil, EPA og SA på 25 uM. Som forutsagt av Real Time PCR-analyse, ble CD133-proteinet signifikant redusert etter 96 timer med EPA behandling (figur 4A og B). Vi har observert at ved 48 og 96 timer Cytokeratin 20 protein nivåene var signifikant høyere i 25 uM EPA-behandlede celler når sammenlignet med kontroll kjøretøy eller til SA behandlingen (figur 4A og C), som demonstrert ved Western blot analyse. Vi observerte også at mucin to proteinnivåer ble ikke endret ved 48 og 96 timer ved dot-blot-analyse på 25 uM EPA-behandlede celler når sammenlignet med kontroll kjøretøy eller til SA behandlingen (figur 4A og D). For å bekrefte spesifisiteten av MUC-2-antistoff som ble brukt for dot blot-analyse, gjennomførte vi et peptid konkurranseanalyse og har vist at 300 gangers overskudd av peptid effektivt konkurrerte binding av antistoffet til den MUC-2 er til stede i cellelysatet .
(A) Total lysat ble hentet fra COLO 320 DM celler behandlet med kjøretøykontroll (CTRL VH), 25 um EPA eller SA for 48 og 96 timer. Western blot ble utført for å studere ekspresjonen av cytokeratin-20 (CK20) og CD133 etter behandling med fettsyrene. Dot blot ble utført for å studere ekspresjonen av mucin 2 (MUC2) etter behandling med fettsyrene. Et peptid som er identisk med det som ble brukt til å generere den Muc-2-antistoff ble anvendt i et peptid konkurranseanalyse for å bestemme MUC2 antistoffspesifisitet. Endringene i (B) CD133, (C) CK20, og (D) MUC2 proteinekspresjon med hensyn til p-aktin er representative for tre separate eksperimenter. Resultatene representerer gjennomsnittet ± SD av minst tre forsøk.
p
verdiene ble beregnet med t-test på behandlede prøver vs. CTRL VH (* p≤0.05, ** p≤0.01).
I konklusjonen, vi observert at EPA økte protein uttrykk for markør for differensiering CK20, og redusert uttrykk for markør for stemness CD133 i COLO 320 DM celler.
Forbehandling med 25 um eikosapentaensyre øker følsomheten av COLO 320 DM total befolkning og CSLCs til 5-Fluorouracil
evnen til omega-3 fettsyrer for å forbedre effekten av kreftmedisiner både
in vitro Kjøpe og
in vivo
på mesteparten av svulst -celler har tidligere vært rapportert [15], [18], [19], [22], [23], [31]. Men fortsatt urapportert er chemo-sensibiliserende effekter av EPA på hoveddelen av svulsten i forhold til effektene på CSLCs befolkningen følgende standard-of-care kreft behandlinger.
I dette arbeidet undersøkte vi om forbehandling med EPA øker kjemoterapi responsen fra standard-of-care kreft narkotika i både bulk av tumorceller og CSLCs befolkningen kultivert fra COLO 320 DM celler.
Vi fant at 2,5 um eller 10 um oksaliplatin resulterte i en celle levedyktighet 75,88 ± 3,23% (IC
25) eller 53 ± 1,18% (IC
50) av kontroll (figur 5A). Vi fant ut at 100 uM og 1,5 mm 5-Fluorouracil redusert COLO 320 DM celleviabilitet til 74,48 ± 4,85% (IC
25) og 52,90 ± 1,09% (IC
50) av kontroll (figur 5B).
(A) COLO 320 DM-celler ble behandlet med et utvalg av oksaliplatin (0,005 til 0,1 mM) eller 5-fluorouracil (0.05-2 mM) konsentrasjoner for å bestemme den inhibitoriske konsentrasjon på 25% (IC25) og 50% ( IC50). (B) Celler fra COLO 320 DM totale befolkningen ble forbehandlet i 48 timer med 25 um EPA eller SA. Etterpå celler ble eksponert i 24 timer med oksaliplatin (
IC25, 2,5
um, IC50, 10
uM
) og 5 fluorouracil (
IC25, 100
um, IC50, 1,5
mm
). (C) CD133 (+) celler ble magnetisk sortert fra den totale populasjon av COLO 320 DM og ble for-behandlet i 48 timer med 25 uM EPA eller SA og deretter eksponert i 24 timer til IC25 og IC50 av oksaliplatin og 5-fluorouracil. Resultatene representerer gjennomsnittet ± SD av minst tre forsøk.
p
verdiene ble beregnet med t-test på behandlede prøver vs. CTRL VH (* p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001).
for å avgjøre om n-3 PUFA var i stand til å øke følsomheten av den totale befolkningen i COLO 320 DM celler til kjemoterapi, vi belagt og pre-behandlet cellene som før med 25 um av EPA eller SA fettsyre. Etter 48 timer fjernet vi mediet og behandles cellene i 24 timer med den tidligere definerte IC25 og IC50-konsentrasjoner for oksaliplatin og 5-Fluorouracil (Figur 5 A og B). Vi fant ut at EPA, men ikke SA (figur 5C, lys grå søyler), betydelig forbedret effekt av både cellegifter (figur 5C, svarte striper), med hensyn til kontrollen bilen.
For å definere om samme behandling med 25 um av EPA fettsyren påvirket på samme måte CLSCs respons på kjemoterapi, testet vi kjemosensitivitet av magnetisk sorteres CD133 (+) COLO 320 DM celler til oksaliplatin og 5-Fluorouracil. CD133 (+) CSLCs ble forbehandlet med 25 um EPA i 48 timer, noe som ble etterfulgt av en 24-timers behandling med oksaliplatin eller 5-Fluorouracil. Som tidligere demonstrert av andre [41], observerte vi at CD133 (+) CSLCs var mer motstandsdyktig mot antineoplastiske medikamenter testet (figur 5D, mørk grå søyler) i forhold til den totale befolkningen (figur 5C, mørk grå søyler). Interessant, fant vi at EPA forbehandling (sort strek), men ikke SA (lysegrå linje) betydelig økt følsomhet for CD133 (+) CSLCs til 5-Fluorouracil, men ikke til oksaliplatin (figur 5D).
Sammen disse data tyder på at EPA potenserer effekten av 5-fluorouracil, som er en av de første linje standard-of-care antineoplastiske midler, mot tykktarmskreft.
Diskusjoner
det er
