Abstract
Til tross for nylige fremskritt i behandlingen av menneskelige tykktarmskreft, er cellegift effekt mot tykktarmskreft fortsatt utilfredsstillende. I foreliggende studie ble effekten av samtidig hemming av den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) og DNA-metyltransferase undersøkt på humane kolonkreftceller. Vi demonstrerte at decitabine (en DNA-metyltransferase-inhibitor) synergized med gefitinib (en EGFR inhibitor) for å redusere cellenes levedyktighet og kolonidannelse i SW1116 og LoVo-celler. Imidlertid viste kombinasjonen av de to forbindelser minimal toksisitet overfor NCM460 celler, en normal human colon mukosale epitel cellelinje. Kombinasjonen var også mer effektiv på å hemme AKT /mTOR /S6 kinase veien. Dessuten er kombinasjonen av decitabine med gefitinib markert hemmet tykktarmskreft cellemigrering. Videre gefitinib synergistisk øket decitabine-indusert cytotoksisitet skyldes primært apoptose som vist ved Annexin V merking som ble svekket av z-VAD-FMK, en pan caspase-hemmer. Samtidig, ble celle apoptose som følge av samtidig behandling av gefitinib og decitabine fulgt av induksjon av BAX, spaltet caspase 3 og spaltet PARP, sammen med reduksjon av Bcl-2 i forhold til behandling med enten medikament alene. Interessant, kombinert behandling med disse to stoffene øket ekspresjon av XIAP-assosiert faktor 1 (XAF1), som spiller en viktig rolle i celle-apoptose. Videre har liten interfererende RNA (siRNA) uttømming av XAF1 vesentlig svekkede tykktarmskreftceller apoptose indusert ved kombinasjonen av de to medikamenter. Våre funn antydet at gefitinib i kombinasjon med decitabine utøves forbedret celle apoptose i tykktarm kreft celler var involvert i mitokondrie-mediert sti og induksjon av XAF1 uttrykk. I konklusjonen, basert på observasjoner fra vår studie, foreslo vi at samtidig administrering av disse to stoffene kan betraktes som en roman terapeutisk regime for behandling av tykktarmskreft
Citation. Lou YF, Zou Zz, Chen Pj Huang Gb, Li B, Zheng dq, et al. (2014) Kombinasjon av Gefitinib og DNA Metylering Inhibitor Decitabine Utøver Synergistic Anti-Cancer Aktiviteten i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 9 (5): e97719. doi: 10,1371 /journal.pone.0097719
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 9 januar 2014; Godkjent: 23 april 2014; Publisert: 29. mai 2014
Copyright: © 2014 Lou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av South China Normal University Science Fund for unge forskere (Grant No. 13KJ19 til Zheng Zhi Zou), Bureau of Dongguan Science and Technology 2010 sentrale prosjekter fondet (Grant No. 201028 til Xiao-yong Luo). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de hyppigst forekommende svulster og en viktig årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, noe som understreker behovet for effektive strategier for å forebygge og behandle denne malignitet. Behandlinger tilgjengelig for behandling av tykktarmskreft omfatter kirurgi, strålebehandling, kjemoterapi, immunmodulerende terapi, og molekylært målrettede behandlinger som anti-vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor (VEGFR) og anti-epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) terapi [1], [ ,,,0],2]. Blant disse molekylært målrettet behandlingene, og EGFR-målrettet terapi som en av de viktigste kliniske strategier i økende grad blitt mye brukt i pasienter med metastatisk kreft i tykktarmen [3].
EGFR er et transmembran glykoprotein med en ekstracellulær EGF-bindingsdomene og en intracellulær region inneholdende tyrosin kinase domene som regulerer signalveier for å kontrollere celle-proliferasjon, differensiering, narkotika og strålesensitivitet, og angiogenese [4]. Ekspresjon av et høyt nivå av EGFR har blitt funnet i forskjellige typer av humane kreftformer, inkludert tykktarmskreft, magekreft, lungekreft, brystkreft, og skvamøst cellekarsinom i hode og nakke [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Overekspresjon og konstitutiv aktivering av EGFR har vært assosiert med en dårlig prognose i tykktarmskreftpasienter. Som aktivering av EGFR er korrelert med tykktarmskreft progresjon, har EGFR vært målet for kreft narkotika utviklingsarbeid. Disse strategiene rettet mot EGFR inkluderer bruk av monoklonale antistoffer som cetuximab og små molekylære tyrosinkinasehemmere (TKI) som gefitinib og erlotinib. Gefitinib er en syntetisk anilinoquinazoline og oralt aktiv selektiv EGFR-TKI som blokkerer signaltransduksjonsbane involvert i proliferasjon og overlevelse av kreftceller. I en klinisk setting, har gefitinib behandling er godkjent for ulike typer kreft, inkludert tykktarmskreft [11]. Imidlertid har den voksende klinisk erfaring skuff viste at til tross for gefitinib som viser noen antitumoraktivitet i tykktarmskreft, er det en høy grad av
de novo
resistens overfor slik behandling [12]. Derfor arbeides det kontinuerlig for utvikling av anti-tykktarmskreft regimer som ville kombinere gefitinib med andre legemidler.
epigenetiske modifikasjoner, hovedsakelig DNA metylering og histoner acetylering, er nå anerkjent som de viktigste mekanismene bidrar til kreft ondartede fenotyper [1. 3]. Som en konsekvens har flere medikamenter som påvirker epigenetiske trasé blitt godkjent for behandling av kreft og mer er for tiden i kliniske forsøk [14], [15]. Spesielt, betyr den er reversibel epigenetiske modifikasjoner av små-molekyl hemmere som off target effekter bør være minimal og reversible ved seponering av behandlingen. Nylig DNA metyltransferase hemmere er på et mer klinisk avansert stadium av utviklingen enn de hemmere av histon deacetylases eller histone metyltransferaser, har blitt grundig testet i fase kliniske I-III studier [16]. Den arketypiske DNA metyltransferase inhibitor decitabine (dvs. 5-aza-2′-deoxycytidine), en deoksyribose analog 5-azacytidin, er for tiden brukes til å behandle myelodysplastisk syndrom (MDS), og er under etterforskning for behandling av akutt myelogen leukemi (AML) og andre faststoff kreft [17], [18]. Videre decitabine og suberanilohydroxamic syre (Saha, en histondeacetylase hemmer) samarbeider om å bevisstgjøre tykktarmskreftceller til Fas ligand-indusert apoptose [19].
Foreløpig store anstrengelser har blitt gjort for å utvikle noen kreft behandlinger basert på de små molekyler som spesifikt retter DNA demethylating protein eller EGFR, mens det ikke mye informasjon er kjent om den kombinerte effekten av EGFR-hemmere og demethylating agenter i tykktarmskreft. Tidligere studier viste gefitinib kan avta kjemoterapi motstand ved å hemme trans transportører av ABC familien, inkludert P-glykoprotein (P-gp), den multiresistens protein 1 (MRP1) og brystkreft resistance protein (BCRP) [20]. Basert på disse lokalene, bestemte vi oss for å finne ut om kombinasjonen av gefitinib og decitabine har synergistisk aktivitet i tykktarm kreft celler.
I denne studien har vi forutsatt prekliniske data som viste kombinasjonen av gefitinib og decitabine var synergistisk på inhibering av celle proliferasjon, migrering og indusere apoptose i dyrkede humane tarmkreftceller. Videre har vi forutsatt at bevisene for at gefitinib kombinert med decitabine regulert celle apoptose var involvert i mitokondrie-mediert sti og induksjon av XAF1 uttrykk. Til sammen kan disse samler data lede utvikling av nye tykktarm kreft terapier.
Materialer og metoder
Cell Culture, reagenser og narkotika behandling
tykktarmskreft cellelinjer utvunnet SW1116 og LoVo ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i DMEM-medium (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator. Cellene ble dyrket i mono og passert rutinemessig 2-3 ganger i uken. decitabine og gefitinib ble kjøpt fra Selleck Chemicals LLC (Houston TX, USA). MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid], dimetylsulfoksyd (DMSO), z-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (Z-VAD-FMK), necrostatin-1 , necrostatin-5 ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). For behandling medikamenter, decitabine, gefitinib, z-VAD-FMK, necrostatin-1, og necrostatin-5 ble oppløst i DMSO henholdsvis aliquoter ble lagret ved -80 ° C. Stamløsninger ble fortynnet til de ønskede sluttkonsentrasjoner med vekstmediet like før bruk. Før medikamenter behandling, cellene ble inkubert i minst 12 timer og deretter erstattet med media inneholdende medikamenter; DMSO-behandlede celler ble brukt som en mock kontroll.
Cell Livskraftig, klonogene Cell Survival og apoptose Analyser
Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av standard MTT analyse. I korthet ble cellene sådd ut i en tetthet på 0,5-1 x 10
4 celler per brønn i 96-brønners plater og inkuberes i 12 timer i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C før behandling av eksponert medikamenter. Mediene ble deretter fjernet, og cellene ble behandlet med decitabine og /eller gefitinib. Etter at cellene ble inkubert i 48 timer ble 100 pl MTT-løsningene (2 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn og platen ble inkubert i ytterligere 4 timer ved 37 ° C. De dannede formazankrystaller ble oppløst i DMSO (200 ul per brønn) med konstant risting i 5 min. Absorbansen til oppløsningen ble deretter målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Bio-Rad, Hercules, CA) ved 495 nm. Denne analyse ble utført i triplikat
For klonogene celleoverlevelsesforsøk, de festede celler fra den samme 10 cm kulturskål som ble trypsinert med 1 ml trypsin-EDTA. (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) og inaktivert med media inneholdende 10% FBS. Cellene ble tellet ved bruk av et hemocytometer og sådd ut ved lav tetthet (1000 per brønn av seks-brønners plate). Etter 24 timer ble legemidler tilsatt i angitt konsentrasjon i 24 timer. Etter fjerning medikamenter, ble cellene tillatt å spre seg i en fuktet 5% CO
2, 37 ° C miljø i 15 dager i friskt medium. Celler ble fiksert i 70% etanol og farget med krystallfiolett 0,005% (Sigma, St. Louis, MO, USA) for analyse av klonogene celleoverlevelse, som tidligere beskrevet [21]. Den kolonidannende enheter med mer enn 100 celler ble tellet ved hjelp av et lysmikroskop.
Måling av apoptose ble utført av Annexin V-FITC (fluoresceinisotiocyanat) /PI (propidiumjodid) analyse som beskrevet tidligere [22]. I korthet ble cellene sådd ut og behandlet med legemidler i 48 timer. Etterpå ble cellene vasket to ganger med PBS og 1 x 10
6-celler ble resuspendert i 1 ml av 1 x Annexin V bindingsbuffer. Celler gjennomgår apoptotisk celledød ble analysert ved å telle celler som farget positivt for Annexin V-FITC og negativ for PI, og sent stadium av apoptose som Annexin V-FITC og PI positivt ved hjelp av FACS Calibur strømningscytometer (BD Biosciences, San Jose, CA. , USA).
kombinasjons~~POS=TRUNC
for kombinasjonsbehandling av decitabine og gefitinib, ble MTT analysedata omdannes til brøkdel av vekst påvirket av den individuelle medikament eller kombinasjons behandlede celler sammenlignet med ubehandlede celler og analysert ved hjelp CalcuSyn programvare (Biosoft, Ferguson, MO, USA) for å avgjøre om kombinasjonen var synergistisk. Dette programmet er basert på Chou-Talalay ligning [23], som beregner en kombinasjon indeks (CI). Den generelle ligning for det klassiske isobologram er gitt ved: CI = (D)
1 /(Dx)
1+ (D)
2 /(Dx)
2. Hvor Dx angir den dose av en forbindelse alene som kreves for å produsere en effekt, (D)
1, og (D)
2 er de doser av forbindelsene 1 og 2, henholdsvis, som er nødvendige for å oppnå den samme effekten i kombinasjon. Fra denne analysen, kan den kombinerte effekten av de to forbindelsene kan oppsummeres som følger: CI 1, CI = 1, CI 1 indikerer synergistisk, additiv og antagonistisk effekt, henholdsvis
Western Blot analyse
.
Celler ble lysert på is i 30 minutter i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,5% deoksykolsyre, 0,02% natriumazid, 1% NP-40, 2,0 mg /ml aprotinin, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid). Lysatene ble sentrifugert ved 12000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-fargemetode. Like store mengder (30 til 60 ug) av celleekstrakt ble underkastet elektroforese på 6 til 12,5% natriumdodecylsulfat-polyakrylamid (SDS-PAGE) og overført til PVDF-membraner (Millipore, Darmstadt, Tyskland) for antistoff blotting. Membranene ble blokkert, og deretter inkubert med p-mTOR (Ser2448), mTOR, akt1, p-AKT (Ser473), p-S6K, S6K, BAX, Bcl-2, spaltet caspase 3 (Asp175), spaltet PARP (Asp214) og Actin antistoffer (alt fra cellesignalisering Technologies, Massachusetts, USA). Og XAF1, XIAP antistoffer ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, U.K). Deretter ble membranene inkubert med et HRP-konjugert sekundært antistoff (Protein Tech Group, Chicago, IL) ved romtemperatur i 1 time. Deteksjon ble utført med ECL kit (GE Healthcare, München, Tyskland)., I henhold til produsentens instruksjoner
caspase aktivitet analysen
fluorometrisk analyser av caspase aktivitet ble utført ved hjelp av underlaget Ac -DEVD-AMC (BD Pharmingen, San Diego, CA) for caspase 3 og Ac-IETD-AMC (BD Pharmingen, San Diego, CA) for caspase 8. i korte trekk ble cellene lysert i lyseringsbuffer (10 mM HEPES, 142 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% NP-40 og pH 7,2) med 10 mM DTT. Etter inkubering i 30 minutter på is, ble prøvene sentrifugert ved 12.000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C, og proteininnholdet i supernatantene ble bestemt ved Bradford-fargemetode. Aliquoter på 10 mg /100 ml analysevolum ble inkubert med 140 mM stedsspesifikk tetrapeptid substrater Ac-DEVD-AMC for caspase 3 og Ac-IETD-AMC for caspase 8 i en caspase analysebuffer (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,01% (vekt /volum) CHAPS, 10% (vekt /volum) sukrose og pH 7,2) med 10 mM DTT i 30 min. Utgivelsen av det fluorogene gruppen AMC ble bestemt ved 37 ° C i en VersaFluor fluorometer (Bio-Rad, Hercules, CA) med eksitasjon ved 380 nm og emisjon ved 440 nm.
RNA interferens
Små interfererende RNA (siRNA) for å nedregulere genekspresjon XAF1 ble utført ved transfeksjon av RNA oligonukleotider med lipofektamin 2000 (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. En dag før transfeksjon ble SW1116 og LoVo-celler sådd ut på en 35-mm kulturskål i RPMI-1640 komplett medium. Etter cellene nådde 50% -60% samløpet, ble de tilført med siRNAs som tidligere beskrevet [24]. I korthet ble cellene plassert i 1 ml siRNA blanding med 100 nM siRNA og 5 ul lipofektamin 2000. Etter 8 timer av transfeksjon, 1 ml RPMI-1640 komplett medium ble tilsatt, og eksperimentene ble utført 48 timer etter transfeksjon. Proteinnivåer ble analysert ved hjelp av Western blot. Den negative kontrollen (NC) siRNA og siRNA mot XAF1 ble syntetisert ved Shanghai GenePharma Co. For XAF1: 5’AUGUUGUCCAGACUCAGAG-3 «[25];
Utvinning av Total RNA og Real-time kvantitativ revers transkripsjon PCR
Total RNA ble ekstrahert med TRIzol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble fremstilt fra total RNA ved hjelp av tilfeldige primere (Promega, Madison, USA) og Omniscript RT kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). De relative nivåer av mRNA ble bestemt ved sanntids kvantitativ revers transkripsjon-PCR (RT-PCR) ved bruk av en Eppendorf Realplex Mastercycler (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) og Quantitect SYBR grønn PCR-kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). XAF1 primersekvenser som ble anvendt var som følger: 5′-ATGGAAGGAGACTTCTCGGT-3 «og 5′-TTGCTGAGCTGCATGTCCAG-3» [26]. Actin (BioVision, Palo Alto, CA, USA) mRNA-nivåer ble anvendt for normalisering.
statistikker og
Alle forsøk ble gjentatt tre ganger, og ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
P
verdier ble beregnet ved hjelp av studentens t-test og
P
verdi 0,05 ble betraktet som signifikant. Statistisk analyse ble analysert ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap (SPSS) programvare (versjon 16.0).
Resultater
Synergistic Antineoplastiske effekter indusert av Decitabine og Gefitinib i tykktarm kreft celler
for å fastslå effekten av kombinasjonsbehandling av DNA metyltransferase inhibitor decitabine og EGFR-hemmer gefitinib på menneskets tykktarm tumorcelle levedyktighet, SW1116 [27] og Løvø celler [28] bærer villtype
EGFR
genet ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av decitabine eller gefitinib alene eller i kombinasjon for opp til 48 timer, etterfulgt av bestemmelse av cellenes levedyktighet ved hjelp av MTT-analysen. Som vist på fig. 1A og B, decitabine eller gefitinib alene forårsaket en konsentrasjonsavhengig hemming av celle levedyktighet med IC
50-verdier på 24,2 um (decitabine) og 4,71 um (gefitinib) i SW1116 celler, og IC
50 verdier av 21,9 mikrometer ( decitabine) og 5,33 mikrometer (gefitinib) i Løvø celler. I tillegg, fig. 1A og B viser at en kombinasjon av decitabine og gefitinib hadde en sterkere inhiberende virkning på cellelevedyktighet SW1116 og LoVo-celler enn hver komponent alene. Videre viser fig. 1A indikerte at behandling av SW1116 celler med faste konsentrasjoner av decitabine redusert IC
50 verdier av gefitinib fra 4,71 um (i fravær av decitabine) til 1,25 uM (i nærvær av 5 uM decitabine) og 0,19 um (i nærvær av 10 uM decitabine). Tilsvarende behandling av LoVo-celler med faste konsentrasjoner av decitabine redusert IC
50 verdier av gefitinib fra 5,33 um (i fravær av decitabine) til 0,63 uM (i nærvær av 10 uM decitabine) og 0,12 um (i nærvær av 20 uM decitabine) (fig. 1B).
(A) og (B) SW1116 og LoVo-celler ble dyrket i kontrollforhold (DMSO) eller i nærvær av de angitte konsentrasjoner av decitabine (DAC) og gefitinib (GEF), alene eller i kombinasjon, i 48 timer, og deretter bedømt for levedyktighet ved MTT-analyse. Resultatene er hjelp av dupliserte vurderinger fra en av tre uavhengige forsøk. (C) og (D) SW1116 celler og LoVo-celler ble sådd ut, behandlet og bearbeidet som i A og B. dose-responskurve for hvert medikament ble bestemt og kombinasjonsindeksen (CI) verdier for DAC /GEF konsentrasjonsforhold (2,5 :1 i SW1116 celler, 2:01 i Lovo-celler) ble beregnet i henhold til Chou-Talalay metode ved 48 h tidspunkt, med det biologiske respons er uttrykt som fraksjonen av angrepne celler. Rektangulært symbol og diamant symbol utpeke CI verdi for hver fraksjon påvirket (effekt). CI 1, CI = 1, CI 1 indikerer synergistisk, additiv og antagonistisk effekt, henholdsvis. Effekten varierer fra 0 (ingen inhibering) til 1 (fullstendig inhibering). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (E) Influence of SW1116 celler og LoVo-celler på antallet kolonidannende celler, som evaluert ved klonogene assay. For kolonidannende analyse, ble den klonogene analysen utført som beskrevet i materialer og metoder. Kolonner, mener av tre bestemmelser; barer, SD. Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter. **
P
0,01, ***,
P
0,001, sammenlignet med DAC-behandlede celler. ##,
P
0,01, ###,
P
. 0,001, sammenlignet med GEF-behandlede celler
Disse data antydet at to forbindelser, decitabine og gefitinib, kan synergize å hemme cellenes levedyktighet i tykktarm kreft celler. For å bekrefte denne synergisme, behandlet vi celler med en kombinasjon av de to stoffer i et konstant forhold til hverandre og brukes Calcusyn programvare for å beregne kombinasjonsindeksen (CI) etter Chou og Talalay metode som beskrevet i avsnittet Metoder. Fig. 1C og D viste en betydelig synergi mellom de to midlene (CI 1) i SW1116 og LoVo-celler. I tillegg, ved klonogene celleoverlevelse analysen, har vi funnet at decitabine og gefitinib som utøves synergistiske effekter for å inhibere aktiviteten av klonogene SW1116 og LoVo-celler (fig. 1E). Videre er de få cellene som overlevde decitabine pluss gefitinib genererte koloniene som var mye mindre i størrelse enn de som genereres av celler som overlevde begge av disse midler alene (data ikke vist). Spesielt, når det brukes sammen, behandling av NCM460 celler, en normal human colon slimhinne epitelcellelinje, med decitabine og gefitinib viste en effekt som er større enn når hver forbindelse ble anvendt hver for seg, men effekten var mindre enn additiv som tyder på antagonisme (fig. S1A og B ). Videre er kombinasjonen av lav konsentrasjon av decitabine (2,5 uM) og gefitinib (1 uM for LoVo-celler og 0,5 uM for SW1116 celler) effektivt opphevet cellemigrering på en synergisk måte (fig. S2A). Samtidig vi har oppdaget at cellelevedyktigheten av tykktarmskreftceller behandlet ved hjelp av de to midler alene eller i kombinasjon (fig. S2B), og funnet at kombinasjonen av lav konsentrasjon av decitabine og gefitinib ikke betydelig redusere cellenes levedyktighet. Disse resultatene indikerer at reduksjonen av celler migrasjon forårsaket av de to stoffene ikke var involvert i hemming av celle levedyktighet.
Decitabine og Gefitinib Kombinasjon behandling er mer effektiv ved å hemme AKT og mTOR signalveier i tykktarm kreft celler
Decitabine og gefitinib betydelig hemmet veksten av to typer tykktarmskreftceller i forhold til behandling med enten middel alene. Som AKT og mTOR signalveier spille en avgjørende rolle i cellevekst og celle apoptose, bestemt vi effekten av decitabine og gefitinib på aktivering av disse banene. Vi beregnet CI verdier for ytterligere å finne den kombinasjonen av 10 uM decitabine med 5 uM gefitinib i SW1116 celler eller 4 uM gefitinib i Lovo-celler var den mest effektive. SW1116 og Løvø celler ble behandlet med decitabine og gefitinib enten alene eller i kombinasjon. Etter 48 timer ble cellene behandlet for Western blot som beskrevet under metodene. Som vist på fig. 2A og B, decitabine (10 mm) ikke kunne føre til betydelige endringer i AKT, eller mTOR-aktivitet, som vurdert av Western blot for fosforylering av AKT, mTOR og S6K. I tillegg observerte vi minimale reduksjoner av fosforylering av AKT, mTOR og S6K med 5 mikrometer gefitinib i SW1116 og 4 mikrometer i Løvø celler. Imidlertid er kombinasjonen av de to medikamenter fullstendig opphevet AKT og mTOR aktiviteter i SW1116 og LoVo-celler (Fig. 2A og B).
(A) og (B) SW1116 og LoVo-celler ble sådd ut, behandlet i 48 t med decitabine (DAC) og gefitinib (GEF), enten alene eller i kombinasjon, og uttrykket nivåer av AKT, mTOR, S6K, og fosforylering ble bestemt ved Western blot-analyse som beskrevet i avsnittet Metoder. Uttrykk for β-actin fungert som en lasting kontroll. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Decitabine synergi Forbedrer Gefitinib-indusert apoptose i tykktarmskreft Cells
For å finne ut om den cytotoksiske effekten av gefitinib kombinert med decitabine skyldtes induksjon av apoptose, ble SW1116 og LoVo-celler behandlet med de to forbindelser, alene eller i kombinasjon, i 48 timer og deretter celle apoptose ble bestemt ved Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI) farging og strømningscytometri-analyse. Som vist på fig. 3A og C, behandling med gefitinib (2 mikrometer eller 5 mm) eller decitabine (10 mm) alene hadde svake effekter på apoptose i SW1116 celler. Men det var en signifikant høyere apoptose prisen funnet etter behandling med kombinasjonen av gefitinib og decitabine (Fig. 3A og C). Lignende resultater ble funnet i Lovo-celler (fig. 3B og C). I tillegg ble celle apoptose målt ved å detektere sub-G1 populasjon med PI farging og flowcytometri analyser. Som vist på fig. S3, sub-populasjon G1 prosent indusert av behandlinger med to medikamenter kombinasjonen var større enn de som er indusert av medikamenter individuelt.
(A) og (B) SW1116 og LoVo-celler ble dyrket i kontrollforhold ( DMSO) eller i nærvær av de angitte konsentrasjoner av decitabine (DAC) og gefitinib (GEF), alene eller i kombinasjon, i 48 timer. Og deretter ble cellene farget med Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI) og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Dette forsøk ble utført i triplikat og representative diagrammer av Annexin V-FITC analysene er vist. (C) Kvantitativ måling av Annexin V-FITC flowcytometri Analysene viste positive apoptotiske celler i respons til DAC og GEF, alene eller i kombinasjon. Kolonner, mener; barer, SD. **
P
0,01, ***,
P
0,001, sammenlignet med DAC-behandlede celler. ##,
P
0,01, ###,
P
0,001, sammenlignet med GEF-behandlede celler. (D) og (E) SW1116 og LoVo-celler ble forbehandlet med 10 pM Z-VAD-FMK (zVAD) eller 20 pM necrostatin-1 (Nec1) eller necrostatin-5 (Nec5) i 1 time, etterfulgt av behandling med den indikerte konsentrasjoner av DAC og GEF, alene eller i kombinasjon, for ytterligere 48 timer. Og da de apoptotiske celler ble bestemt ved Annexin V-FITC /PI farging og strømningscytometri-analyse. Dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger. Kolonner, mener; barer, SD. **
P
. 0,01
For å avgjøre hvorvidt gefitinib pluss decitabine forårsaket caspase kaskade, pannen kaspaseinhibitor z-VAD-FMK (10 mm) ble brukt å forbehandle SW1116 eller Løvø celler før behandling av gefitinib pluss decitabine. Som vist på fig. 3D og E, z-VAD-FMK kan bemerkelsesverdig holde celle apoptose indusert av gefitinib pluss decitabine. Imidlertid celle apoptose utløses av de to forbindelser i kombinasjon kunne ikke bli blokkert av necrostatin-1 eller necrostatin-5, en ny klasse av potente små-molekyl-inhibitorer av cellenekrose. Resultatene viste at den apoptotiske veien var involvert i celledød indusert av gefitinib kombinert med decitabine, i tykktarm kreft celler.
Decitabine og Gefitinib kombinasjonsterapi endrer uttrykk nivåer av apoptotiske regulatoriske forhold i Colon kreft celler
Siden apoptose er strengt regulert av pro- og antiapoptotic medlemmer av BCL-2 proteiner familie, proapoptotiske faktorer BAX, BID og BIM samt antiapoptotic proteiner BCL-2 og Bcl-XL ble studert i SW1116 og Løvø celler etter behandling med decitabine eller gefitinib eller deres kombinasjon av Western blot analyse. SW1116 og Løvø cellene reagerer på decitabine pluss gefitinib manifestert økte mengder av proapoptotiske BAX samt stor reduksjon i nivåene av den anti-apoptotiske proteiner BCL-2 (Fig. 4A og B). Men de to forbindelsene i kombinasjon unnlatt å påvirke uttrykket nivåer av andre medlemmer av BCL-2 proteiner familie, inkludert proapoptotiske proteiner BID og BIM samt antiapoptotic protein BCL-XL (data ikke vist).
SW1116 og LoVo-celler ble sådd ut, behandlet for 48 (DAC) og gefitinib (GEF), enten alene eller i kombinasjon. (A) og (B) uttrykket nivåer av spaltede-kaspase 3, spaltet PARP-, XAF1, XIAP, BAX, Bcl-2 ble bestemt ved Western blot-analyse som beskrevet i avsnittet Metoder. Uttrykk for β-actin fungert som en lasting kontroll. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) og (D) kaspase 3 aktivitet ble kvantifisert som beskrevet under metodene. Dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger. Kolonner, mener; barer, SD. *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
0,001. (E) og (F) for kaspase 8 aktiviteten ble kvantifisert som beskrevet i avsnittet Metoder. Dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger. Kolonner, mener; barer, SD. *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
. 0,001
hemmer apoptose protein (IAP) er et protein familie som virker gjennom hemming av caspase aktivitet. The X-bundet IAP (XIAP), et medlem av IAP, og XIAP-assosiert faktor 1 (XAF1) ble undersøkt i tykktarm kreft celler stimulert med decitabine sammen med gefitinib. Fig. 4A og B indikerte at ingen endringer i XIAP proteinnivåer ble funnet i SW1116 og LoVo-celler behandlet med decitabine og gefitinib alene eller i kombinasjon. Spesielt, kombinert behandling med både narkotika bemerkelsesverdig økt uttrykk for XAF1 sammenlignet med monoterapi behandling (Fig. 4A og B).
For å teste evnen til gefitinib kombinert med decitabine å aktivere caspases, kløyvde caspase 3 og kløyvde PARP ble studert i SW1116 og Løvø celler etter behandling med gefitinib eller decitabine eller deres kombinasjon av Western blot analyse. Betydelig økning i mengdene av begge spaltet kaspase 3 og spaltet PARP ble notert i kolon kreftceller behandlet med to medikamenter i kombinasjon sammenlignet med behandling med enkle midler (fig. 4A og B). Videre ble tykktarm kreft celler behandlet av de to forbindelser analysert for caspase 3 og caspase 8 aktiviteter ved fluorogent substrat cleavage. Som vist på fig. 4C og D, tykktarmskreftceller behandlet med to forbindelser i kombinasjon viste signifikant økning i kaspase 3 aktivitet. I tillegg decitabine pluss gefitinib utøves tidsavhengige caspase 3 aktivitets induksjoner på SW1116 og Løvø celler (fig. 4C og D). Derimot ble ingen endringer funnet i caspase 8 aktiviteter (fig. 4E og F).
XAF1 spiller en avgjørende rolle i Cellular apoptose utløst av Decitabine Kombinert med gefitinib
Dataene vist ovenfor angitt som decitabine kombinert med gefitinib økte XAF1 nivåer i SW1116 og Løvø celler. Vi spurte om de to stoffene i kombinasjon kan forbedre XAF1 mRNA nivåer i tykktarm kreft celler. Som vist på fig. 5A og B, XAF1 mRNA nivåer ble økt betydelig etter decitabine pluss gefitinib. Videre kolon kreftceller ble behandlet med de to legemidler i kombinasjon for forskjellige tidsintervaller. Vi viste at XAF1 protein og mRNA nivåer ble økt med decitabine pluss gefitinib i en tidsavhengig måte (Fig. 5C, D, E og F).
(A) og (B) SW1116 og Løvø cellene behandlet i 48 timer med de angitte konsentrasjoner av decitabine (DAC) og gefitinib (GEF), enten alene eller i kombinasjon. De mRNA ekspresjonsnivåer av XAF1 ble bestemt ved sanntids-kvantitativ PCR. Ekspresjon av β-actin tjente som kontroll. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Kolonner, mener; barer, SD. **
P
0,01; **
P
0,001. (C) og (D) SW1116 og LoVo-celler ble behandlet i de angitte tidsintervaller med de indikerte konsentrasjoner av DAC og GEF i kombinasjon. Uttrykket nivåer av XAF1 ble bestemt ved Western blot-analyse som beskrevet under metodene. Uttrykk for β-actin fungert som en lasting kontroll.
