Abstract
Denne studien hadde som mål å undersøke den anti-tumor aktivitet av RY10-4, en liten molekyl~~POS=TRUNC som ble utformet og syntetisert basert på strukturen av protoapigenone. En tidligere screening studie viste at RY10-4 besatt anti-proliferative effekter mot HepG2 menneskelige leverkreft celler. Imidlertid har hele spekteret av RY10-4 anti-kreft effekt på leversvulster og de underliggende mekanismene ikke blitt identifisert. Heri, syssels flowcytometri og Western blot analyse, viser vi at RY10-4 kan indusere cellesyklus arrest, intracellulære reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon og apoptose i HepG2 celler. I HepG2-celle xenograft tumormodell, RY10-4 signifikant hemmet veksten av tumorer og induserte apoptose i tumorceller, med lite bivirkninger. Videre RY10-4 førte til undertrykkelse av STAT3 aktivering, noe som kan være involvert i apoptose-induksjon. I tillegg RY10-4 hemmet proliferasjonen av Hep3B og Huh-7 humane leverkreft-celler i en konsentrasjonsavhengig måte. Til sammen våre resultater tyder på at RY10-4 har et stort potensial til å utvikle seg som kjemoterapeutiske agent for leverkreft
Citation. Zhang X, Wang Y, Han S, Xiang H, Peng Y, Wu Y, et al. (2016) RY10-4 Hemmer spredning av menneskelige Hepatocellulær Cancer HepG2 celler ved å fremkalle apoptose
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 11 (3): e0151679. doi: 10,1371 /journal.pone.0151679
Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, USA
mottatt: 20 oktober 2015; Godkjent: 02.03.2016; Publisert: 14 mars 2016
Copyright: © 2016 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 31270390, til YYW) og Foundation i Hubei-provinsen Natural Science (No. 2015CFC852, til XZ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ifølge den nyeste globale kreft statistikk, er leverkreft den tredje høyeste årsaken til kreft-dødsfall på verdensbasis [1]. Som en av de store kreft behandlingsmetoder, er kjemoterapi effektivitet i å forlenge og forbedre livskvaliteten til pasientene [2]. Forskning av små molekylære forbindelser med anti-tumor aktivitet har store fordeler for å utvikle nye kjemoterapi agenter. Noen små molekylforbindelser, såsom piperlongumine [3] og obtusaquinone [4], målretting og selektivt drepe kreftceller, kan være lovende kreft terapeutiske midler.
å utnytte naturlige produkter som bly forbindelse er en nyttig og praktisk fremgangsmåte narkotika utvikling. Basert på strukturen av et naturlig produkt protoapigenone ble RY10-4 utformet og syntetisert ved hjelp av Yuan
et al
. i vårt laboratorium, og det viste potent antitumoraktiviteter mot flere humane cancer-cellelinjer [5]. Dens kjemiske struktur var nær protoapigenone, mens dens antitumoraktivitet ble forbedret og bivirkninger er redusert. Mekanismene som medierer den anti-tumor aktivitet av RY10-4 inkludert induksjon av autophagy eller apoptose i humane bryst eller lungekreft cellelinjer, henholdsvis [6,7]. I en tidligere screeningundersøkelse, RY10-4 viste bemerkelsesverdig anti-proliferative effekter på HepG2 menneskelige hepatocellulær kreft celler
in vitro
, og hemmet veksten av mus lever H22 svulst
in vivo product: [5] . Det er imidlertid mer forskning er nødvendig for å fullt ut forstå de anti-tumor effekter av RY10-4 i leverkreft og dens potensielle virkningsmekanisme. Her viser vi at RY10-4induces apoptose i HepG2 lever kreftceller både
in vitro Hotell og
in vivo
, og dermed har mulighet til å undertrykke leversvulster.
Materialer og metoder
Regents og antistoffer
RY10-4 ( 95%) ble fremstilt tidligere i vårt laboratorium som beskrevet av Yuan et al. [5]. Sulforhodamine B (SRB) ble kjøpt fra J K Scientific (Beijing, Kina). Dimetylsulfoksid (DMSO) og N-acetylcystein (NAC) ble kjøpt fra Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Hoechst 33342, propidiumjodid (PI), reaktive oksygenarter analysesett (DCFH-DA), lyse RIPA-buffer, BCA proteinanalysesett, og BeyoECL pluss kjemiluminescens kit ble oppnådd fra Beyotime Inc. (Shanghai, Kina). Annexin V-FITC /PI apoptose detection kits ble kjøpt fra keygen Biotech (Nanjing, Kina). Spesifikke antistoffer mot Bcl-2, Bax, p53, cyklin E, CDK2, spaltes caspase3, actin, STAT3, p-STAT3, P21, GAPDH og tilsvarende sekundære antistoffer ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).
Cell linje og cellekultur
Menneskelig leverkreft HepG2, Hep3B og Huh-7 cellelinjer ble kjøpt fra Kina Senter for Type Culture Collection, CCTCC). Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Hyclone) supplementert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS, Hyclone) og antibiotika-oppløsning (100 ug /ml streptomycin og 100 IE /ml penicillin), i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C.
SRB-analysen
celle~~POS=TRUNC ble målt ved SRB-analyse som beskrevet tidligere [6]. I korte trekk, ble HepG2 celler sådd ut i 96-brønners kulturplater (5000 celler per brønn), og ble behandlet med en serie av konsentrasjoner av RY10-4. Etter behandling ble cellene fiksert med 10% trikloreddiksyre i 1 time ved 4 ° C, og vasket med 1% eddiksyre. De fikserte celler ble farget med 0,4% SRB i 15 minutter, vasket fire ganger og fikk tørke ved romtemperatur. Den bundet fargestoff ble solubilisert med Tris-base-løsning, og absorbansen ved 540 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (BioTek Instruments, Inc., USA). For å undersøke hvilken rolle ROS i RY10-4-indusert celledød, ble HepG2-celler forbehandlet med ROS-passiveringsmidlet NAC (5 mM) i 2 timer fulgt av behandling med RY10-4 og cellelevedyktigheten ble målt.
klonogene analysen
HepG2 cellene i eksponentiell vekstfase ble sådd i 6-brønners plater (1000 celler per brønn), og lov til å følge. Etter behandling med serielle konsentrasjoner av RY10-4 i 24 timer, cellene ble dyrket i friskt medium uten medikamenter inntil synlige kolonier dannet. Celle kolonier ble deretter fiksert med 4% paraformaldehyde og farget med 0,5% krystallfiolett farging løsning.
Cell syklus analyse
For cellesyklus analyse fase distribusjon av DNA ble bestemt ved hjelp av PI farging. Etter behandling med 0, 0,9, 1,8, og 2.7μM av RY10-4 i 24 timer, HepG2-celler ble høstet og fiksert med 70% etanol over natten ved -20 ° C. Deretter ble cellene vasket og farget med PI fargeløsning (50 ug /ml PI og 10 ug /ml RNase) i 30 min i mørket. Cellesyklusfordelingen ble analysert ved hjelp av strømningscytometri ved hjelp av Cell-Quest-programvare (Becton Dickinson, USA).
Måling av intracellulær ROS produksjon
DCFH-DA ble anvendt som en fluorescerende probe for å måle intracellulær ROS produksjon ved strømningscytometri. Kort sagt ble HepG2 celler sådd ut i 6-brønns plater. Etter adhesjon, ble cellene behandlet med varierende konsentrasjoner av RY10-4. Deretter ble mediet fjernet og cellene ble inkubert med 10 pM DCFH-DA i 20 minutter i mørket. De fargede celler ble samlet opp og analysert ved flowcytometri (Becton Dickinson, USA). I noen forsøk ble cellene forbehandlet med ROS-passiveringsmidlet NAC.
Apoptose deteksjon
HepG2-celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner av RY10-4 og analysert for apoptose ved anvendelse av enten Hoechst 33342 flekker eller Annexin V-FITC /PI. I korte trekk, etter behandling, ble cellene farget med Hoechst 33342 i 10 minutter ved romtemperatur, deretter vasket og observert under et fluorescerende invertert mikroskop (Nikon Eclipse, Japan). Alternativt kan cellene ble samlet opp og farget med Annexin V-FITC /PI apoptose deteksjon kit ifølge produsentens protokoll; de apoptotiske celler ble påvist ved strømning cytomety (Becton Dickinson, USA).
Western blot-assay
Protein ble bestemt ved Western blot. Kort sagt ble de totale proteinene ekstrahert med RIPA-lyseringsbuffer inneholdende 1% phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) og 1% cocktail. Proteinene ble separert ved SDS-PAGE og overført på en PVDF-membran (Bio-Rad). Membranen ble blokkert med 5% fettfri melk i 1 time ved romtemperatur og inkubert med et spesifikt primært antistoff over natten ved 4 ° C. Membranen ble deretter vasket og inkubert med en tilsvarende sekundært antistoff i 2 timer ved romtemperatur. Den spesifikke protein-antistoff-komplekset ble visualisert ved ECL pluss chemiluminescence kit.
Nude mus xenograft modell
Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Etisk komité Huazhong University of Science and Technology, Kina . Alle forsøksdyr mottatt omsorg i samsvar med de retningslinjer som er foreslått av Institutional Animal Care og bruk komité, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Fire til fem uker gamle BALB /c hårløse mus (nr 4304701485) ble kjøpt fra Hunan SJA Forsøksdyr Co Ltd (Hunan, Kina). Musene ble holdt under patogenfrie forhold med fri tilgang til gnager chow og vann ved 20-22 ° C med 12-timers lys-mørke syklus, og akklimatisert for en uke før forsøket. Deretter HepG2-celler (2 x 10
6) ble injisert subkutant i hver mus. Da volumene av etablerte tumorer nådde 100-200 mm
3, ble musene tilfeldig delt inn i følgende grupper: saltvannskontroll, lavdose RY10-4 (5 mg /kg) behandlet gruppe, og høydose RY10-4 (50 mg /kg) som ble behandlet gruppe. Kroppsvekt og tumorvolum av dyrene ble målt en gang i uken. Musene ble observert daglig for sårdannelse, abdominal hevelse, avmagring og /eller andre tegn på stress. Når en mus presentert ovenfor symptom (er), og det ble antatt at musen ikke ville overleve, det var avlivet, og dødstidspunktet ble notert. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av formelen: V =
ab
2/2 (
en
,
b
er svulst lengde og bredde, henholdsvis). Den relative tumorvolum (RTV) = V
t /V
0, hvor V
0 er tumorvolumet målt ved tidspunktet for den første medikamentadministrasjon og V
t representerer hver tumor måling etter behandlingen. Ved den eksperimentelle endepunktet ble alle musene avlivet ved cervikal dislokasjon under eterbedøvelse.
Histopatologi og immunhistokjemi analyse
En del av tumorvevet prøve ble fiksert med 4% paraformaldehyd og innstøpt i parafin. Vevssnitt (4 mm) ble fremstilt og farget med hematoxylin /eosin (H hemming av cellevekst-forholdet ble bestemt ved SRB-analysen, og IC
50 verdien var 1,88 pM. (B) HepG2-celler ble sådd i en meget lav tetthet, og behandlet med RY10-4 i 24 timer. Da celler ble dyrket i friskt medium uten medikamenter for å danne kolonier. Kolonien dannelse ratio (% av kontroll) ble beregnet.
RY10-4 indusert cellesyklus arrest i HepG2 celler
cellesyklus distribusjon av HepG2 celler etter RY10-4 behandling var vurdert ved analyse av DNA-innhold ved bruk av PI farging. Som vist i figur 2A og 2B, RY10-4 ved konsentrasjoner på 0,9, 1,8 og 2,7 uM induserte en signifikant økning i prosentandelen av celler i S-fasen. Også 2,7 mikrometer RY10-4 induserte en bemerkelsesverdig økning i G2 /M fase (
P
= 0,0127). Western blot analyse viste at ekspresjon av cellesyklusrelaterte proteiner cyclin E og CDK2 i HepG2-celler ble redusert med RY10-4 behandling (figur 2C).
(A) Celler ble behandlet med 0, 0.9, 1.8 og 2.7μM RY10-4 i 24 timer, og DNA-innhold ble analysert ved hjelp av propidiumjodidfarging og flowcytometri. (B) Cell cycle fordelinger, presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (C) Etter behandling med RY10-4, ekspresjon av cellesyklusrelaterte proteiner cyclin E og CDK2 ble analysert ved hjelp av Western blot.
RY10-4 indusert intracellulær ROS-produksjon i HepG2 celler
Den intracellulære ROS produksjonen ble oppdaget ved hjelp av oksidasjons sensitive fluorescerende probe DCFH-DA. Som vist i figur 3A, etter behandling med indikerte konsentrasjoner av RY10-4, den intracellulære ROS-produksjon ble dramatisk økt i HepG2-celler. En konsentrasjons-avhengig måte ble observert, og forbehandling med NAC (5 mM) i 2 timer nesten fullstendig reversert RY10-4-indusert ROS produksjon i HepG2-celler (figur 3B). Gående, pre-behandling med NAC også hindret cellelevedyktigheten reduseres indusert av RY10-4 (figur 3C).
(A) HepG2-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av RY10-4, og den intracellulære ROS produksjon var detektert som beskrevet i Metoder. (B) De intracellulære ROS-nivåer (% av kontroll), presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (C) HepG2-celler ble behandlet med RY10-4 i fravær eller nærvær av NAC forbehandling; cellen levedyktighet ble bestemt av SRB analysen.
RY10-4 indusert apoptose i HepG2 celler
fluorescens farging av atomkjerner og Annexin V-FITC /PI farging ble utført for å oppdage apoptose i HepG2 celler. Figur 4A viste at etter behandling med indikerte konsentrasjoner av RY10-4, kondenserte kjerner og apoptotiske legemer ble observert i HepG2 celler ved farging med Hoechst 33342. Annexin V-FITC /PI farging viste også at RY10-4 induserte apoptose i en konsentrasjonsavhengig måte (figur 4B). Sammenligning med kontrollgruppen, ble andelen av apoptotiske celler signifikant økt i RY10-4-behandlede grupper (figur 4C). I tillegg, apoptose-relaterte proteiner p53, Bcl-2, Bax, og spaltet caspase-3 ble analysert ved hjelp av Western blot. Som vist på figur 4D, ekspresjon av anti-apoptotiske protein Bcl-2 ble redusert etter behandling med RY10-4, mens ekspresjon av p53, Bax og spaltet caspase-3 økte på en konsentrasjonsavhengig måte. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at RY10-4 kan indusere apoptose i HepG2 celler.
(A) Cellene ble behandlet med angitte konsentrasjoner av RY10-4 i 24 timer, og kjernene ble farget av Hoechst 33342. piler indikerer kondenserte og fragmenterte kjerner. (B) Strømningscytometri-analyse for å påvise apoptose i HepG2 celler ved hjelp av Annexin V /PI farging. Representative flowcytometri-profiler er vist. (C) Den prosentandel av apoptotiske celler, presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (D) Uttrykk for apoptose relaterte proteiner ble analysert ved Western blot i HepG2 celler ubehandlede eller behandlet med RY10-4.
Anti-tumor aktivitet av RY10-4 i HepG2 celle xenograft modell
anti-tumoreffekten til RY10-4
in vivo
ble evaluert ved anvendelse av en naken mus xenograft modell. Alle mus overlevde gjennom hele forsøket periode, og de ble avlivet under eteranestesi ved den eksperimentelle endepunkt. Som vist i figur 5A, behandling med RY10-4 resulterte i bemerkelsesverdig vekstinhibering av HepG2-celle-xenograft tumorer sammenlignet med saltvannsbehandlede kontrollgruppe. Ved slutten av eksperimentet, tumorvolumet var 1326 ± 407 mm
3, 530 ± 201 mm
3 og 411 ± 108 mm
3 i kontrollgruppen, lavdose RY10-4 behandlingsgruppe og høydose RY10-4 behandlingsgruppen, henholdsvis. Den gjennomsnittlige tumorvolumet i kontrollgruppen nådde nesten syv ganger av det opprinnelige volum, mens tumorene i behandlingsgruppene ble øket bare omtrent to ganger, sammenlignet med den opprinnelige volum (figur 5B). Vi har også analysert uttrykk for apoptose relaterte proteiner BCL-2 og Bax i tumor vevsprøver fra hver gruppe av immunhistokjemi og Western blot. Som vist i figur 5C og 5D, sammenlignet med kontrollgruppen, ekspresjon av anti-apoptotiske protein Bcl-2 redusert, mens den pro-apoptotiske protein Bax øket både ved lave og høye doser av RY10-4. Den HE farging viste også store deler av tumor celledød i behandlingsgruppene (figur 5E). Disse resultatene antydet at RY10-4 kan indusere levertumor apoptose
in vivo
. Den kroppsvekt i hver gruppe ikke endres vesentlig gjennom hele forsøket (Fig 5F), og RY10-4 behandling ikke påvirke blod biokjemiske indekser av tumorbærende nakne mus (S1 Table), noe som tyder på at RY10-4 har trolig liten side effekter
in vivo
.
(A) Representative xenografttumorer hentet fra kontroll mus og mus behandlet med RY10-4. (B) Den relative tumorvolum (RTV) ble beregnet i henhold til formelen i Methods. (C og D) Ekspresjon av Bcl-2 og Bax i tumorvev ble analysert ved hjelp av immunofluorescens-farging og Western blot. (E) HE-farging ble utført for patologisk undersøkelse av tumorvev i forskjellige grupper. (F) De gjennomsnittlige kroppsvekt av mus i hver gruppe ble evaluert.
De molekylære mekanismene for apoptoseinduksjon av RY10-4 i HepG2 celler
Siden STAT3 regulerer uttrykket av ulike tumorvekst knyttet onkogene gener og spiller en nøkkelrolle i celleproliferasjon [9], undersøkte vi om RY10-4 kan regulere konstituerende STAT3 aktivering i HepG2 celler. Som vist i figur 6A, RY10-4 hemmet konstitutive fosforylering av STAT3 (tyrosin 705) i HepG2-celler. RY10-4 oppregulert ekspresjon av p21, som kan være involvert RY10-4-indusert cellesyklus-stans. I tillegg har IL-6 (10 ng /ml) revers RY10-4-indusert STAT3 inaktivering, etterfulgt av økning av Cyclin E ekspresjon i RY10-4-behandlede HepG2-celler (figur 6B). Videre forbehandling med NAC hemmet STAT3 oppheving og p53 økningen som forårsakes av RY10-4 i HepG2-celler (figur 6C).
(A) HepG2-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av RY10-4, og uttrykket p-STAT3 og p21 ble analysert ved hjelp av Western blot. (B) HepG2-celler ble behandlet med RY10-4 med eller uten IL-6 stimulering; ekspresjon av p-STAT3 og cyclin E ble analysert ved hjelp av Western blot. (C) HepG2-celler ble behandlet med RY10-4 i fravær eller nærvær av NAC forbehandling. Uttrykket av p-STAT3 og p53 ble analysert ved Western blot.
De anti-proliferative effekter av RY10-4 på andre leverkreft cellelinjer
For å observere anti-proliferative effekter av RY10-4 mot andre menneskelige leverkreft cellelinjer, velger vi Hep3B og Huh-7 leverkreft cellelinjer. Som vist i figur 7A, RY10-4 hemmet proliferasjonen av Hep3B og Huh-7 celler på en konsentrasjonsavhengig måte, og Hep3B cellene var mer følsom. Neste, vi har oppdaget uttrykk for apoptose relaterte proteiner i RY10-4-behandlede Hep3B celler. Som vist i figur 7B, etter behandling med RY10-4, ekspresjon av p53 og Bax økt, mens ekspresjon av Bcl-2 redusert.
(A) Hep3B eller Huh-7-celler ble behandlet med konsentrasjoner serie av RY10-4, ble og hemming av cellevekst-forholdet bestemt ved SRB-analysen. (B) Hep3B celler ble behandlet med RY10-4, og uttrykk for apoptose relaterte proteiner p53, ble Bcl-2 og Bax analysert ved Western blot.
Diskusjoner
naturlig produkt protoapigenone og flere av dets derivater har vist potent anti-tumor effekt mot visse av humane kreftcellelinjer [10,11]. Protoapigenone kan anses som et nyttig blyforbindelse for å oppdage nye kjemoterapeutika. I vårt laboratorium, ble RY10-4 designet og syntetisert som en protoapigenone analog, som et forsøk på å utvikle en ny antitumorforbindelse. Ifølge noen tidligere undersøkelser og rapporter [12,13], RY10-4 hadde potente anti-tumor aktivitet mot humane brystkreftceller. I en annen rapport, kan RY10-4 indusere autophagic celledød i MCF-7 celler mens protoapigenone kunne ikke [6]. I tillegg Xue
et al
. rapporterte at RY10-4 induserer apoptose og hemmer invasjon i humane lungecancer A549-celler ved å hemme STAT3 signale [7]. Disse studiene viser at RY10-4 har et stort potensial som en roman anti-svulst agent.
I denne studien har vi evaluert anti-tumor aktivitet av RY10-4 i leverkreft. Resultatene viste at RY10-4 effektivt inhiberte proliferasjon av HepG2 leverkreftceller
in vitro
med IC
50 verdi på 1,88 uM. Videre ble klonogene analyse utføres for å bestemme de langsiktige effektene av RY10-4 på HepG2 celler. Den klonogene assay korrelerer godt med analysen av tumorgenisitet
in vivo
, og det har vist seg prediktiv verdi i kjemosensitivitet test av antitumormidler [14]. Våre resultater indikerte en konsentrasjonsavhengig inhibering i clonogenicity i RY10-4-behandlede HepG2-celler (figur 1B), hvilket antyder at RY10-4 har en kureringspotensiale mot hepatocellulær cancer.
Induksjon av cellesyklus og apoptose er kjernen virkningsmekanismer i en rekke anti-tumormidler. Det har blitt rapportert at protoapigenone og dets analoger, så vel som RY10-4 kan forårsake cellesyklus og apoptose i noen humane kreftcellelinjer [13,15-17]. Her, analyserte vi cellesyklusfordeling og apoptose av HepG2-celler etter behandling med RY10-4. Vi fant at RY10-4 kan indusere cellesyklusarrest i S- og G2 /M-fase, som kan tilskrives den nedregulering av cellesyklusrelaterte proteiner cyclin E og CDK2 (figur 2). I tillegg, Hoechst 33342 farging og Annexin V-FITC /PI farging viste at RY10-4 også induserte konsentrasjonsavhengig apoptose i HepG2-celler (Fig 3). P53 er en av de viktigste tumor-suppressorer og rettet mot p53 familie proteiner kan vise seg å være terapeutisk nyttige [18,19]. P53 kan stimuleres ved hypoksi, kreftfremkallende, oksidativt stress og andre stressfaktorer som induserer cellesyklus arrest eller apoptose
via
flere veier [20]. BCL-2 familie proteiner, inkludert pro- og anti-apoptotiske regulatorer, spiller også en viktig rolle i apoptose induksjon og celleoverlevelse [21,22]. I tillegg caspase familie proteiner som caspase-3 er eksekutorer av apoptose og aktivering av kaspaser vil initiere apoptose [23]. Etter behandling med RY10-4, ekspresjon av p53, Bax og spaltet caspase-3 økte, mens ekspresjonen av Bcl-2 ble redusert i HepG2-celler (figur 3D). Disse resultater indikerer at induksjon av apoptose kan være den underliggende mekanisme av anti-tumoraktivitet for RY10-4 mot humane hepatocellulære kreft HepG2 celler.
Overbevisende indikasjoner tyder på at ROS er implisert i en rekke cellulære programmer og spiller en nøkkelrolle i humane fysiologiske og patologiske prosesser [24]. Kreftceller vanligvis viser høyere basale nivåer av ROS, har en annen redox status sammenligne med normale celler, og høye ROS-nivåer kan ofte skade cellene [25,26]. Derfor induserende ROS produksjon i kreftceller kan ha en positiv terapeutisk effekt. Forbindelser som piperlongumine, obtusaquinone og psoralidin induserer ROS produksjon og dermed hemme spredning av humane kreftceller [3,4,27]. I denne studien demonstrerte vi at RY10-4 indusert intracellulær ROS produksjon, noe som kan bli reversert ved forbehandling med NAC i HepG2-celler. Også RY10-4-indusert celledød ble delvis hindret av forbehandling NAC (figur 4). Disse resultatene antyder at ROS-produksjon kan spille en viktig rolle i RY10-4-indusert HepG2 celledød. Forholdet mellom RY10-4-indusert apoptose og ROS produksjon vil bli ytterligere undersøkt i en oppfølgingsstudie. Tallrike bevisene indikerer at STAT3 spiller en sentral rolle i utvikling og progresjon av mange menneskelige svulster, og undertrykkelse av STAT3 aktivering fører til veksthemming og apoptose i tumorcellelinjer samt mus xenograft modeller [9,28]. I vår studie fant vi at RY10-4 trykt STAT3 aktivering i HepG2 celler, og effekten var avhengig av ROS generasjon (figur 6). Til sammen kan ROS avhengig inaktivering av STAT3 være den molekylære mekanismen for RY10-4 for sin anti-levertumor aktivitet.
Generelt bare kliniske studier kan til slutt avgjøre om en ny agent er effektivt for kreftbehandling i pasienter. Men det er mange etiske, medisinske og økonomiske begrensninger og begrensninger for kliniske studier, derav en praktisk eksperimentelt system er av stor betydning for kreft narkotika screening [29]. Den nakne mus xenograft modell blir normalt brukt for å evaluere den biologiske aktivitet av anticancermidler
in vivo product: [30,31]. Humane kreftceller kan vokse som xenotransplantater i en immunsvikt mus. Til en viss grad, er denne modellen var å forutsi klinisk respons på medikamentell behandling. Her har vi etablert HepG2 celle xenograft modell for å evaluere antitumor aktivitet RY10-4. Vi fant ut at RY10-4 indusert apoptose på svulsten og betydelig hemmet veksten
in vivo plakater (figur 5). I tillegg RY10-4 har sannsynligvis bare mindre bivirkninger
in vivo
, som det ikke påvirker dyrets kroppsvekt og blod biokjemiske indekser.
I konklusjonen, dette papiret viser at RY10-4 kan bemerkelsesverdig hemme proliferasjonen av humane leverkreft HepG2 celler både
in vitro Hotell og
in vivo
. Induksjon av apoptose kan være den underliggende mekanisme for sin anti-tumor-aktivitet. RY10-4 trykt levertumorvekst
in vivo
uten betydelig hematologisk toksisitet, levertoksisitet eller nefrotoksisitet. I tillegg RY10-4 hemmet proliferasjonen av Hep3B og Huh-7 humane leverkreft-celler i en konsentrasjonsavhengig måte. Disse resultatene tyder på at RY10-4 har et stort potensial som en roman kjemoterapeutisk middel for leverkreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Fullstendig blodprosent og biokjemiske profil for den hårløse mus etter behandling med RY10-4 for 4 uker (gjennomsnitt ± SD, n = 8)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0151679.s001 plakater (docx)
