Abstract
Mange differentially denaturert gener har blitt identifisert i prostatakreft (PCA), først og fremst ved hjelp av kandidat gen-baserte analyser. Nylig har flere globale DNA metylering profiler rapportert i PCA har imidlertid hver av disse svakheter når det gjelder evne til å observere globale DNA metylering endringer ved PCA. Vi hypotese at det fortsatt uidentifiserte avvikende DNA-metylering i PCa, som kan bli identifisert ved å bruke høyere oppløsning analysemetoder. Vi brukte den nyutviklede Illumina HumanMethylation450 BeadChip ved PCA (
n
= 19) og tilstøtende normalt vev (
n
= 4) og kombinert disse med genuttrykk data for å identifisere nye DNA metylering som kan har funksjonelle konsekvenser ved PCA utvikling og progresjon. Vi har også bekreftet våre metylering resulterer i en uavhengig datasett. To avvikende DNA-metylering gener ble validert blant ytterligere 56 PCA prøver og 55 tilstøtende normalt vev. En total 28,735 CpG sider viste signifikante forskjeller i DNA-metylering (FDR justert
P
0,05), som er definert som et middel metylering forskjell på minst 20% mellom PCa og normale prøver. Videre er en total av 122 gener hadde mer enn ett differensielt metylert CpG område i sin promoter region og en genekspresjon mønster som var invers til retningen av forandring i DNA-metylering (for eksempel redusert ekspresjon med økt metylering, og vice-versa). Avvikende DNA metylering av to gener,
AOX1 Hotell og
SPON2, etter ble bekreftet via bisulfate sekvensering, med de fleste av de respektive CpG nettsider som viser signifikante forskjeller mellom tumorprøver og normalt vev.
AOX1
promoter-regionen viste hypermethylation i 92,6% av 54 testede PCA prøver i motsetning til bare tre av 53 testet normalt vev. Denne studien brukte en ny BeadChip kombinert med genuttrykk data ved PCA for å identifisere nye differensielt denaturert CpG steder innen gener. De nylig identifiserte differentially metylert gener kan brukes som biomarkører for PCa diagnose
Citation. Kim JW, Kim S-T, Turner AR, Young T, Smith S, Liu W, et al. (2012) Identifisering av New Forskjellig denaturert Gener som har potensial funksjonelle konsekvenser i prostatakreft. PLoS ONE 7 (10): e48455. doi: 10,1371 /journal.pone.0048455
Redaktør: Ludmila Prokunina-Olsson, National Cancer Institute, National Institutes of Health, USA
mottatt: 17 juli 2012; Godkjent: 26 september 2012; Publisert: 31 oktober 2012
Copyright: © 2012 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health gir CA106523, CA95052, og CA105055 (til JX); CA135008 (til WL og WBI); CA133066 (til WL og JWK) og det amerikanske forsvarsdepartementet tilskuddet PC051264 (til JX). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
DNA metylering er en kovalent addisjon av en metylgruppe i 5-posisjon karbon av en cytosin-base og denne epigenetisk endringen er nesten utelukkende funnet i cytosin guanin dinukleotider (CpG) i differensierte humane celler [1]. CpG nettsider finnes hovedsakelig i repeterende sekvenser eller CpG øyer (CGI), som er CpG-rike regioner som kan finnes i hele det menneskelige genom. I normalt humant hjernevev, var mindre enn 3% av CGIer lokalisert i promotorområdene funnet å være metylert, i motsetning til 34% av CGI lokalisert i intragenic regioner ble metylert [2]. Imidlertid er CGI metylering i promotorområdene godt dokumentert i mange studier på grunn av tilknytning til genet stanse [3] – [5]
Aberrant DNA metylering mellom kreftprøver og normalt vev har blitt mye observert i ulike kreftformer inkludert. PCa [6] – [9]. Mer enn 67 differensielt denaturert gener ble identifisert i PCa, først og fremst på grunnlag av genspesifikke analysemetoder [10]. Den siste utviklingen i state-of-the-art teknikker som microarray teknologi og neste generasjons sekvensering har innledet en ny epigenomic æra i DNA-metylering studier [11] – [14]. Flere studier har rapportert avvikende mønstre av genom-wide DNA metylering i PCA vevsprøver, Agilent CpG island mikromatriser, Illumina HumanMethylation27 (HM27) BeadChips eller neste generasjons sekvenseringsmetoder [15] – [20]. Fire aviser har rapportert DNA metylering profiler med HM27 BeadChip [17] – [20]. Kobayashi et al. rapporterte mer enn 8000 differensielt metylerte CpG sider (DMC) i PCA-prøvene sammenlignet med tilstøtende normale vev ved hjelp av et forholdsvis stort antall prøver [18]. Mahapatra et al. identifisert og bekreftet mange abnorme metylerte gener som kan brukes som diagnostiske eller prognostiske biomarkører [20]. Dette HM27 BeadChip metoden gir DNA metylering data på enkelt-nukleotid oppløsning på mer enn 27.000 CpG nettsteder. Men dekker denne HM27 plattformen bare 0,1% av alle CpG områder i det menneskelige genom og alle test CpG områder ligger i promotorområdene.
MethylPlex-neste-generasjons sekvensering (M-NGS) kombinerer enzymatisk berikelse av metylert CpG øyer med en neste-generasjons sekvensering teknikk [16]. Denne metoden ble brukt av Kim et al. å identifisere 2,481 kreftspesifikke forskjellig hypermethylated regioner i promotorområdene ved å sammenligne PCA prøver, tilstøtende normalt vev, og sykdomsfrie prostata vev. Imidlertid, ved bruk av denne metoden, Kim et al. rapporterte ikke noen resultater på hypomethylated regioner ved PCA. Videre, størrelsen av differensielt hypermethylated regionene beskrevet av Kim et al. var forholdsvis store (3000 basepar). Ved hjelp av denne fremgangsmåten, kan det vanskelig å identifisere kjerne metylert regioner som er kritiske for regulering av genekspresjon; derfor en ytterligere bestemmelse er nødvendig for nøyaktig vurdering av DNA-metylering ved enkelte steder CpG [21]. Til tross for svakhetene til hver teknikk, har disse genom-wide DNA metylering studier gitt bevis for at det finnes en rekke uidentifiserte ulikt denaturert CpG områder (eller områder, avhengig av analyseteknikker), og disse uidentifisert DMC kan ha viktig verdi som ny narkotika mål og diagnostiske eller prognostiske biomarkører.
Illumina HumanMethylation450 (HM450) er en nyutviklet BeadChip plattformen, som kan teste mer enn 480.000 individuelle CpG områder i det menneskelige genom [22], [23]. Denne dekningen tilsvarer rundt 1,7% av alle CpG områder i det menneskelige genom, og representerer en stor økning fra forgjengeren HM27 BeadChip (0,1% av alle CpG nettsteder). Den høye korrelasjonen mellom HM450 data og hel-genom bisulfite sekvense data indikerer at denne nye BeadChip kan gi pålitelige DNA metylering data for epigenomic profilering studier [23].
Vi gjennomførte en pilotstudie ved hjelp av denne nye HM450 BeadChip å evaluere PCA prøver og tilstøtende normalt vev. Et sett av gener som er deregulert av avvikende DNA metylering ved PCA ble identifisert og deretter kombinert med uavhengige genuttrykk data. Vi så fokusert på to avvikende DNA metylering gener (
AOX1 Hotell og
SPON2
), med bekreftelse analyser ved hjelp av ekstra PCA og tilstøtende normale prostata vev.
Materialer og metoder
forsøkspersonene
Alle vev eksemplarer i denne studien ble innhentet fra prostatakreftpasienter som gjennomgår radikal prostatektomi for behandling av klinisk lokalisert sykdom ved Karolinska Institutet, Sverige (
n
= 23) og Johns Hopkins Hospital (JHH;
n
= 111). Alle prostata prøver som brukes til denne studien ble samlet etter egnede mennesker godkjenninger ble innhentet og skriftlig dokumentasjon av informert samtykke ble gitt. Alle studieprotokoller ble godkjent av Karolinska Institutet eller Johns Hopkins Hospital eller Wake Forest University School of Medicine Institutional Review Board. Subject prøver ble valgt på grunnlag av evnen til å oppnå genomisk DNA i tilstrekkelig mengde og renhet (mer enn 70% kreftceller for kreft prøver, ingen påviselige kreftceller til normale prøver) ved macrodissection av tilpassede tilstøtende ikke-ondartet (heretter kalt normal ) og kreft som inneholder deler av prostatavevet som bestemmes av histologisk evaluering av hematoxylin og eosin farget frosne deler av radikal prostatektomi prøver. Genomisk DNA ble isolert fra trimmet frosne vev som beskrevet tidligere [24].
DNA Metylering analysen
Genome-wide DNA metylering profilering ble utført ved hjelp av HM450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA) . Genomisk DNA ble modifisert ved hjelp av EZ-DNA metylering kit (Zymo Research, Orange, CA) etter anbefalinger fra Illumina. Den Illumina infinium Analysen ble også gjennomført i henhold til produsentens protokoll.
DNA-prøver ble endret i forberedelse for sekvensering som beskrevet tidligere [25]. Bisulfite sekvense primere ble designet av metyl Primer Express programvare (Applied Biosystems, Foster City, California) for å forsterke bisulfit modifiserte DNA (tabell S1). Hot Start-polymerase kjedereaksjon (PCR) (Qiagen, Valencia, CA) ble utført ved anvendelse av følgende sykkel program: 95 ° C i 15 minutter; 94 ° C i 30 sekunder, 56 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder i 50 sykluser; og en avsluttende trinn ved 72 ° C i 10 minutter. Amplifiserte PCR-produktene ble subklonet ved bruk av TOPO TA-kloningssettet (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter transformasjon av
Escherichia coli
, vi tilfeldig valgt omtrent 10 til 20 individuelle
E. coli
kolonier for hver prøve vurderes. Plasmid DNA ble direkte forsterket (Templiphi forsterkning kit, GE Healthcare, Piscataway, NJ) og deretter sekvensert ved hjelp BigDye Terminator v1.1 Cycle Sekvense Kits (Applied Biosystems) med M13 forover primer
Hver bisulfite sekvense primer sett. ble evaluert ved bruk av rekonstituert kontroll DNA-sett som var blandinger i varierende mengder (0, 20, 50, 80 og 100% metylering) av to kontroll DNA;
M.SssI
-behandlet DNA som metylert DNA (Millipore, Billerica, MA) og hele genomet forsterket DNA som unmethylated DNA [26], [27].
bisulfitt sekvensdata ble sammenlignet med UCSC genom referansesekvens for å vurdere metylering status for hver CpG området ved hjelp BIQ Analyzer programvare [28]. Kloner med et minimum av 95% bisulfitt konverteringsfrekvensen ble inkludert i de påfølgende analyser. Hver CpG nettstedet i vår sekvense data ble nummerert fra 5 «til 3» retning. CpG områder 2 og 34 i
AOX1
promoter-regionen ble ekskludert fra videre analyse på grunn av en hyppig mangler enkelt nukleotid i lang tymin homopolymere strekker seg rundt hver av disse CpG nettstedene.
Publisert Metylering og Expression data
Raw DNA metylering data ved PCA hjelp HM27 ble lastet ned fra Gene Expression Omnibus, en offentlig dataregister [18]. Disse metylering data ble samlet inn ved hjelp av 86 tilstøtende normale prostata vev og 92 primær PCA prøver. Genuttrykk data ved PCA som ble basert på Affymetrix Exon 1,0 ST Array ble lastet ned fra data portal nettsted (https://cbio.mskcc.org/cancergenomics/prostate/data/) [29]. Disse uttrykk data ble samlet inn ved hjelp av 29 tilstøtende normalt vev, 131 primær PCA prøver og 19 metastatiske PCA prøver. Normalisert log
2 forvandlet gen-nivå (hele avskrift signal intensitet) data ble brukt for statistisk analyse.
Statistical Analysis
Raw HM450 data ble oppnådd ved hjelp GenomeStudio programvare (Illumina) etter skanning de BeadChips. Fargebalanse justering, enkel skalering normalisering, og uten tilsyn hierarkisk clustering analyse ble utført ved hjelp av Bioconductor
lumi
pakke [30]. Den β (metylering) verdi ble beregnet på grunnlag av det foreslåtte ligningen ved Du et al. [31]. Den β verdi er en kontinuerlig variabel mellom 0 og 1, med p-verdier som nærmer seg til en (eller 0) indikerer fullstendig metylering (eller ingen metylering, henholdsvis) i hvert CpG område. CpG nettsteder som hadde deteksjon
P
verdier større enn 0,05, ble ekskludert.
Foreningen mellom hver fenotype eller clinicopathological parameter og DNA metylering ved hvert CpG stedet ble testet separat innenfor HM450 data. Disse statistiske tester ble utført med en generalisert lineær modell ved hjelp av PROC GENMOD i SAS programvare (SAS Institute Inc, Cary, NC) [32]. Beta-fordeling av p-verdier ble regnskapsført med en binomisk logit link og en skala variabel beregnet med Pearson rester. Vi er fast bestemt om hvert enkelt CpG stedet var statistisk signifikant basert på den falske funnraten (FDR) for å korrigere eventuelle falske positiver fra flere tester (a = 0,05). Vi har også deretter beregnes en midlere metylering (β verdi) av et CpG område i hver gruppe og valgt CpG områder som hadde større eller lik 0,2 bety metylering forskjellen mellom to sammenligningsgruppene [27], [33]. Derfor ble en forskjellig metylert CpG (DMC) er definert som en CpG område som hadde en FDR justert
P
verdi 0,05 fra en generalisert lineær modell test og en gjennomsnittlig metylering forskjell mellom to sammenligningsgruppene større eller lik 0.2 (figur 1). De HM27 data ble også behandlet med samme prosedyre.
Vi brukte Fishers eksakte test for å teste sammenhengen mellom DMC og genomiske steder over hele genomet. Den statistiske testen for genekspresjon ble utført med Wilcoxon Rank Sum test i SAS programvare. Vi er fast bestemt om hvert enkelt gen var statistisk signifikant basert på FDR justert
P
verdi (α = 0,05).
Resultater
Identifikasjon av ulikt denaturert CpG nettsteder ved PCA
Vi har utført genome-wide DNA metylering profilering hjelp av Illumina HM450 BeadChip. Vi vurderte fire paret tumorprøver og tilstøtende normalt vev, pluss ytterligere 15 uparede tumorprøver som opprinnelig ble samlet inn fra svenske fag (Tabell S2A). Etter normalisering, alle 23 vevsprøver viste svært like signal intensitet distribusjoner, mens unsupervised hierarkisk clustering på hele DNA metylering datasettet viste de to viktigste klyngene ble hver består av en fenotype; svulst eller normal (figur S1). Dette klart skille mellom PCa og normale prøver indikerte et annet DNA metylering mønster mellom to fenotyper.
For å identifisere avvikende DMC i prostatakreft, vi utført statistisk analyse og snevret ned utvalget av CpG nettsteder basert på DNA metylering forskjeller ( Figur 1). Totalt 28,735 CpG nettsider viste statistisk signifikans med FDR justert
P
0,05 og minst 0,2 bety metylering forskjellen mellom PCa og normale prøver (Tabell S3). Disse 28,735 DMC inkludert 20,187 hypermethylated CpG sider (hyper-DMC) og 8548 hypomethylated CpG sider (hypo-DMC) i tumorer sammenliknet med normalt vev. Interessant, ble 69,5% av hyper-DMC (14,038 CpG nettsteder) ligger i CGI, CGI bredden eller CGI-hyller, men bare 37,0% av hypo-DMC ble funnet i disse regionene (Fisher eksakt tosidige
p
10
-44; Tabell 1A). Videre fordeling av identifiserte hyper- og hypo-DMC i tumorer var statistisk forskjellig mellom genet regionens kategorier fra produsenten (Fisher eksakt tosidige
p
= 2,0 × 10
-44; Tabell 1B ) [23]. Hyper-DMC ble oftere identifisert i proksimale promoter regioner (inkludert transkripsjon start stedet [TSS] 1500, TSS200, 5’untranslated region [UTR] and1st exon) enn hypo-DMC, men hypo-DMC ble oftere funnet i ikke-promoter regioner (inkludert genet kropp og 3’UTR).
Det er totalt 19,570 DMC som ligger i fremkallende regioner, tilsvarte 7,031 unike gener. Totalt 32 av de 67 gener som tidligere rapportert ved PCA å ha arrangøren hypermethylation ble identifisert i vår liste (tabell S4) [10]. Dette tallet er større enn antall felles genene fra M-NGS-metoden (20 vanlige gener), som er noe overraskende fordi M-NGS gir bedre praktisk dekning av genomisk CpG (29,6%) områder sammenliknet med den HM450 BeadChip (1,7%) [ ,,,0],16].
Vi sammenlignet våre resultater med publiserte datasett. Blant 28,735 DMC, totalt 1,175 CpG nettsteder var til stede i HM27 BeadChips som ble brukt i en tidligere PCa studie [18]. Statistisk analyse indikerte at 1157 (98,5%) av 1175 CpG områder viste signifikant forskjellig DNA-metylering mellom tumor og normale prøver (FDR justert
P
0,05), og alle disse områdene 1,157 CpG viste samme retning av metylering endring i de to datasettene (928 hyper-DMC og 229 hypo-DMC, Tabell S3).
DMC foreninger med deregulert Gene Expression ved PCA
For å finne avvikende DNA metylering som kan forårsake genuttrykk endring i PCA analyserte vi genuttrykk data mellom vår liste over DMC gener. For å øke sannsynligheten for å identifisere sanne positive, vi bare testet gener som møtte tre kriterier. Først, ble mer enn en DMC identifisert i proksimale promotorområdene (TSS1500, TSS200, 5’UTR og første ekson) av et gen; andre, minst tre fjerdedeler av disse flere DMC-er i et gen promoter region hadde den samme retning av metylering endringer (hyper eller hypometylering i PCA); tredje, i det minste en DMC i et gen promoter region hadde minst 0,4 bety metylering forskjell mellom kreft og normale fenotyper. Basert på disse kriteriene, ble totalt 276 gener valgt fra 9,643 DMC som lå i proksimale genet promoter regioner og tilgjengelige 269 matchede genekspresjonsdata ble testet [29]. Totalt 122 gener viste signifikante forskjeller i genuttrykk mellom tumor og normale prøver (FDR justert
P
0,05 og invers korrelasjon mellom DNA metylering og uttrykk endring, Tabell 2 og Tabell S5). Dette settet inkluderte syv kjente metylering gener i PCA for eksempel
GSTP1, CAV1, og R R
. Totalt 65 av 122 gener er bekreftet å ha differensial metylering i HM27 data [18]. Disse 65 bekreftet gener i HM27 data viste samme retning metylering endringer med våre HM450 data. Videre 55 ut av 122 gener har blitt identifisert som cDMRs i neste generasjons sekvense metylering data (M-NGS) [16].
Bekreftelse av AOX1 arrangøren Hypermethylation i Andre PCA Prøver
Blant sett av 122 abnorme metylerte gener,
AOX1
, som koder aldehydoksidase en og er lokalisert på kromosom 2q33.1, var den mest signifikant nedregulert genet i PCA prøver, basert på HM450 data . Endringene i DNA metylering og genuttrykk av
AOX1
mellom PCA og normalt vev var svært lik
GSTP1 plakater (tabell 2). I alt 13 av 19 testet CpG områder i
AOX1
genet ble identifisert som hyper-DMC (spekter av FDR justert
P
: 7,4 × 10
-8~0.01 og spekter av middel metylering forskjell: 0.20~0.52) og 11 av disse 13 DMC ble plassert i proksimale promoter regioner (Tabell 2 og Figur S2A)
To CpG steder i
AOX1
promoter-regionen. det ble også bekreftet som hyper-DMC i den uavhengige HM27 datasettet (Tabell S3 og figur S2A) [18]. Mahapatra et al. også identifisert dette genet som en differensiert metylert gen ved hjelp av samme HM27 plattform [20]. Kim et al. identifisert et forskjellig metylert region i
AOX1
som overlapper med våre 13 hyper-DMC nettsteder som bruker M-NGS metoden i PCA prøver [16]. Kim et al. også utført bisulfite sekvensering av
AOX1
promoter i to prostata cellelinjer, der de bekreftet bevis på differensial metylering i
AOX1
. Men metylering status i PCA vevsprøver med enkelt-nukleotid oppløsning ikke er gjennomført ennå.
Derfor brukte vi bisulfite sekvensering for å bekrefte våre funn i
AOX1
gen blant flere PCa og normal prostata vevsprøver (Tabell S2B). Vi forsterket
AOX1
promoter-regionen, som inkluderte fem hyper-DMC og overlappet med en CpG island, deretter sekvensert etter bakteriell transformasjon (figur S2A). Data fra en rekke kontroll DNA viste pålitelige resultater fra denne bisulfite sekvense primer sett (figur S2B). Blant totalt 107 vevsprøver fra JHH inkludert 54 PCA prøver og 53 normalt vev (51 matchet par), vi observerte
AOX1
genet arrangøren å være tungt hypermethylated i PCA prøvene sammenlignet med normalt vev i det hele tatt av 34 testede CpG sider (gjennomsnittlig metylering i alle 34 CpG sider: PCa
vs
normal = 0,73
vs
0.07, Figur 2A og Tabell S6..); disse forskjellene var statistisk signifikante (FDR justert
P
8,8 × 10
-11). Vi plottet gjennomsnittet metylering av alle 34 CpG områder i hver tumorprøve og de matchet normale prøver (
n
= 51, figur S2C). Dette plottet indikerte nesten alle tumorprøver hadde større enn den midlere metylering verdi på 0,3 i
AOX1 promotoren
, mens paret tilstøtende normalt vev hadde forholdsvis lavere metylering (mindre enn bety metylering verdi 0,3). Etter å ha vurdert disse dataene vi vilkårlig satt en cut-off nivå på 0,3 for å tildele
AOX1
promoter metylering å skille tumor fra normalt vev (figur 2B). Sensitiviteten av DNA-metylering i
AOX1
promoter for påvisning av PCa ble 92,6% (50 av 54 testet PCA prøver) og 94,3% av positiv prediksjon verdi. Vi var ikke i stand til å beregne spesifisitet i denne replikering befolkningen, fordi de prøver inkludert tilstøtende normalt vev av PCA pasienter. Imidlertid 50 ut av 53 (94,3%) av disse normale prøver viste negative resultater av
AOX1 promotoren
metylering.
A. Gjennomsnittlig metylering av 34 testede CpG steder i hver fenotype. Feilfelt angir 95% konfidensintervall for hver CpG nettstedet. B. Fordeling av
AOX1
promoter metylering i hver fenotype. Hver sirkel eller firkant representerer den gjennomsnittlige metylering av 34 testet CpG områder i hvert testet vevsprøve.
Bekreftelse av SPON2 arrangøren Hypomety-lering i Andre PCA Prøver
SPON2
, som koder for spondin 2 og er lokalisert på kromosom 4p16.3, var den nest mest oppregulert genet blant settet av 122 vesentlig deregulerte gener i PCa, basert på HM450 data. Totalt fem CpG steder i
SPON2
promoter ble identifisert som hypo-DMC (spekter av FDR justert
P
: 2,1 × 10
-14~8.0 × 10
-8 og utvalg av middel metylering forskjell: -0.20~-0,50) og disse fem DMC ble også plassert i LOC100130872 promoter-regionen (tabell 2)
Vi har også bekreftet metylering av
SPON2
promoter region, som omfatter fem hypo-DMC, og ligger i et CpG øy bredden, ved hjelp av den samme bisulfitt sekvenseringsfremgangsmåten beskrevet ovenfor (figur S3A). Data fra en rekke kontroll DNA viste pålitelige resultater fra denne bisulfite sekvense primer sett (figur S3b). Totalt 109 JHH vevsprøver inkludert 54 PCA prøver og 55 normalt vev (54 matchede par) ble testet for
SPON2
promoter metylering. Resultatet av bisulfite sekvensering viste hypometylering av
SPON2
genet promoter i PCA prøvene sammenlignet med normalt vev, og disse forskjellene var statistisk signifikant i 25 av 27 testet CpG sider (gjennomsnittlig metylering forskjellen mellom PCA prøver og normalt vev : -0,1 ~ -0,27, Figur 3 og Tabell S7). Men metylering verdier i dette settet med 25 CpG nettsider viste mer variasjon enn det vi observerte for
AOX1
promoter (Figur 2A). Totalt 55 normale vev viste gjennomsnitts DNA metylering mellom 0,46 og 0,81 i de 25 CpG områder, men PCA prøver (
n
= 54) viste gjennomsnittlig DNA metylering mellom 0,30 og 0,63. DNA metylering av
SPON2
arrangøren viste ingen sammenheng med clinicopathological parametere som alder på tidspunktet for kirurgi, Gleason score, og TNM stadium i PCA prøver og normalt vev (data ikke vist).
hver sirkel eller firkant representerer den gjennomsnittlige metylering av 27 testede CpG steder i hver fenotype. Feilfelt angir 95% konfidensintervall for hvert CpG nettstedet.
DMC Associated med Clinicopathological Properties
For å identifisere CpG nettsteder knyttet clinicopathological egenskaper, sammenlignet vi metylering data fra PCA prøver med Gleason score eller status for biokjemisk tilbakefall (BCR). Først ble PCA prøver dividert med Gleason score (lavere Gleason 6 og 3 + 4 vs. høyere Gleason 4 + 3, 9, 10). Totalt 245 CpG områder ble identifisert som Gleason poengsum assosiert DMC (FDR justert
P
0,05), men bare 40 CpG områder viste større enn 0,2 bety metylering forskjellen mellom høyere og lavere Gleason PCa (tabell S8) . Genuttrykk data av 22 gener som hadde Gleason poengsum assosiert DMC i fremkallende regioner ble testet for tilknytning til Gleason score i PCA prøver. Blant disse 22 testede genene, bare
PPARGC1A
viste signifikante forskjeller i genuttrykk mellom svulster med lavere Gleason versus høyere Gleason PCa (FDR justert
P
= 0,022). Videre metylering av
PPARGC1A plakater (cg12691631) ble omvendt korrelert med genuttrykk (figur S4)
Sammenligninger mellom BCR (biokjemisk tilbakefall,. Defineres som påvisning av total PSA større enn 0,2 ng /ml etter operasjonen) og ikke-BCR grupper identifisert bare to CpG nettsider som DMC (cg11385353 i
AGXT Hotell og cg14218447 i en intergeniske region) ved hjelp av FDR justert
P
0,05 og større enn 0,2 middel metylering forskjellen mellom to grupper. Disse to CpG nettsider viste signifikant forskjell etter justering for behandling informasjon. Men genuttrykk av
AGXT
viste ingen forskjell mellom BCR og ikke-BCR primær PCa (data ikke vist).
Diskusjoner
Vi testet DNA metylering i mer enn 480 000 CpG nettsteder som bruker HumanMethylation450 Beadchip i PCA prøver og normalt vev. Vi lykkes med å identifisere 28,735 ulikt denaturert CpG nettsider ved PCA. Mange av de identifiserte DMC var uavhengige reproduksjoner av tidligere funn av differensial DNA metylering ved PCA [16], [18]. I den første, 98,5% (1157 av 1175) av felles CpG områder som var til stede i vår DMC listen og den HM27 BeadChip viste signifikant metylering forskjeller i den foregående datasettet [18]. I den andre, totalt 1014 av 2481 (40,9%) kreftspesifikke metylerte regioner som ble identifisert ved bruk av M-NGS-metoden i PCa, overlappet med våre DMC [16]. Når du vurderer de store forskjellene i den praktiske CpG dekning av disse to metodene (M-NGS
vs
. HM450:29.6%
vs
. 1,7%), kan det samstemmighet på 40,9% være ansett som svært høy.
fordelingen av DMC i HM450 viste et lignende mønster i fordelingen av DMC i en tykktarmskreft cellelinje [22]. Sandoval et al. fant at de fleste hypermethylated CpG steder ble plassert i CGI, CGI shore, og CGI hylle regioner, mens mer enn halvparten av hypermethylated CpG områder ble identifisert i proksimale promoter regioner. Våre data var i samsvar med den observasjonen viser at 69,5% av hyper-DMC ble plassert i CGI, CGI shore, og CGI hylle regioner, mens 52,4% av hyper-DMC ble identifisert i proksimale promoter regioner.
har lagt merke til at totalt 6907 CpG nettsider analysert ved HM450 BeadChip skje for å bli plassert innenfor enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) loci. Totalt 336 CpG Plasser blant 28,735 DMC som vi identifiserte var også plassert i SNP loci som angitt i tabell S3. Derfor spesiell oppmerksomhet er nødvendig for å tolke eventuelle observerte assosiasjoner med disse 336 DMC.
Vi valgte å begrense vår analyse til den proksimale promoter regionen fordi denne regionen er godt preget for sine effekter av DNA metylering på genet demping. Denne tilnærmingen også tillatt oss å vurdere assosiasjoner med genuttrykk endringer basert på en uavhengig PCa datasett, basert på antagelsen om at invers korrelasjon mellom arrangøren metylering og genuttrykk kan plausibly indikere et funksjonelt resultat av ulikt denaturert gener identifisert ved PCA. Denne tilnærmingen identifisert totalt 122 gener inkludert syv kjente DNA-metylering gener ved PCA. Som positiv bekreftelse på vår tilnærming,
GSTP1
, som er den mest grundig studert hypermethylated genet ved PCA ble funnet å være hypermethylated i denne analysen (tabell 2). En total 7 av 15 CpG områder i HM450 BeadChip ble identifisert som hyper-DMC (spekter av middel metylering forskjell: 0,27 ~ 0,48) i
GSTP1
gen (tabell S3). Messenger RNA av
GSTP1
genet har tidligere vist seg å være betydelig nedregulert i grunnskolen PCA og metastatiske svulster viser videre nedregulering [29].
aldehydoksidase 1 (
AOX1
) genet er involvert i ulike metabolske veier, herunder legemiddelmetabolisme og generering av reaktive oksygenforbindelser [34] – [36]. Redusert AOX1 protein-ekspresjon i kronisk pankreatitt og et fravær av AOX1 protein-ekspresjon i bukspyttkjertelkreft er blitt rapportert [34]. I tillegg vil redusert AOX1 protein uttrykk ble påvist i leverkreft, og dette deregulering av AOX1 uttrykk var assosiert med tumor stadium og metastatisk status [37]. Avvikende DNA hypermethylation av
AOX1
promoter-regionen ble nylig rapportert i tykktarmskreft og PCa [16], [18], [20], [38], [39]. Innenfor rammen av disse tidligere publiserte data, våre data støtter videre en rolle for avvikende DNA metylering i
AOX1
formidler av PCA svulster, samtidig gir den mest omfattende dekningen av DMC i dette genet oppdatert.
de observerte forskjellene i DNA metylering i
AOX1
promoter mellom PCA prøver og normalt vev var bemerkelsesverdig. Denne promoter regionen viste en veldig konsekvent metylering mønster i 34 CpG områder som spenner over 400 basepar i hver fenotype. Dette genomisk plasseringen er mottagelig for evaluering via andre analyser, for eksempel pyrosekvensering eller metylering spesifikk PCR
De fleste PCA svulster (92,6%, sensitivitet). Det ble observert å ha positiv DNA metylering, med en gjennomsnitts metylering kutt -off på 0,3 og 94,3% av normalt vev som viser negativ DNA metylering med samme cut-off. Denne følsomheten
AOX1
metylering var lik andre kjente denaturert gener inkludert
GSTP1 Hotell og
R R
som ble testet ved hjelp av pyrosekvensering metoder [40]. Denne høye følsomheten
AOX1
promoter metylering og store forskjeller i DNA metylering mellom PCA prøver og normalt vev foreslå potensielle nytten av dette genet som en biomarkør for PCa diagnose.
