Abstract
Bakgrunn
Vi har tidligere beskrevet en RAF onkogen drevet transgen musemodell for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Her undersøker vi om startfasen og vekst krever stamcelleselvfornyelse faktor Bmi1.
hovedfunnene
For å vurdere Bmi1 funksjon i NSCLC to grunnlegge linjer som varierer i hyppighet og ventetid på tumordannelse ble sammenlignet. Ablasjon av Bmi1 ekspresjon i begge linjer hadde en dramatisk redusert tumorvekst. Som linjen med kortere ventetid matchet levetiden Bmi1 knock out mus, ble disse musene valgt for videre studier. Fraværet av Bmi1 ikke redusere antall startfasen i disse mus som bare størrelsen og ikke antallet tumorer redusert. Reduksjon i tumorvekst skyldes en økning i celle-død og reduksjon i cellesyklusprogresjon som korresponderte med opp-regulering av p16
INK4a og p19
ARF.
Betydningen
dataene identifiserer Bmi1 som en viktig faktor for ekspansjon, men ikke initiering av RAF drevet NSCLC
Citation. Becker M, Korn C, Sienerth AR, Voswinckel R, Luetkenhaus K, Ceteci F et al. (2009) Polycomb Gruppe Protein Bmi1 er nødvendig for vekst av RAF Driven ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 4 (1): E4230. doi: 10,1371 /journal.pone.0004230
Redaktør: Mauricio Rojas, Emory University, USA
mottatt: 05.08.2008; Godkjent: 05.12.2008; Publisert: 19 januar 2009
Copyright: © 2009 Becker et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. MB og CK ble støttet av SFB TR 17 av de DFG, ARS og KL ble støttet av DFG collegeutdannelse 1141 Wuerzburg-Nice. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i den vestlige verden. Basert på histologi to forskjellige typer av lungekreft, ikke-liten celle lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekreft (SCLC) definert. Totalt 50% av alle adenokarsinomer, den mest utbredte formen for NSCLC, havnen mutasjoner i bestanddeler av mitogen signalkaskade dvs. EGFR, K-Ras og B-RAF [1]. Mutasjoner av RAF-C er også funnet i NSCLC, men ved en lavere frekvens.
Flere systemer som modell lungekreft hos mus har blitt rapportert. Strategiene for å etablere disse modellene har i utgangspunktet fulgte to forskjellige baner. 1) Induksjon av onkogen ekspresjon og sletting av tumorsuppressorgener via adenovirus dirigert ekspresjon av Cre-rekombinase [2] – [5]. Denne tilnærmingen ligner forekomst av somatiske mutasjoner i voksen vev. 2) Constitutive onkogen-ekspresjon i målceller ved bruk av celletypespesifikke promotorer [6], [7]. De sistnevnte modellene kan være mer hensiktsmessig for gestationally ervervede mutasjoner. Mens viralt induserte modellene viser en noe udefinert målcelle-spektrum transgene tilnærmingen har potensial til å målrette alle transformasjons sensitive celler som viser ekspresjon av en bestemt celletype spesifikk promoter.
tidligere beskrevet generering av transgene linjer uttrykker et oncogent aktivert versjon av C-raf-kinase (C-RAF BXB) under kontroll av den humane alveolar type to (AT2) på cellespesifikk overflateaktivt protein C (SP-C) promotoren [7]. To grunnlegger linjer, videre referert til som BXB11 og BXB23, viser lunge målrettet adenom utvikling med høy penetrans, høy forekomst og kort ventetid. Svulster er fenotypisk ganske stabilt som ingen atom atypia eller metastase ble sett på en C57Bl /6 bakgrunn. En cuboidal celletype hovedsakelig danner adenomer. Ingen bronkial epitelial hyperplasi kontinuerlig med cuboidal tumorer som beskrevet for oncogene K-Ras modeller [4] er blitt observert. Den BXB23 legger linjen har blitt brukt mye i genetiske studier for å analysere tumorprogresjon påvirkende faktorer [7] – [12]. Selv om transgene ekspresjon i hovedmålene alle AT2-celler bare et delsett av dem svart på ekspresjon av c-RAF BXB med dannelsen av tumorer [7]. En forklaring på dette funnet er at en lunge stamfar rommet reagerer mitogen kaskade signalering med ekspansjon. Alternativt kan stenge av transgene uttrykk i de fleste AT2 celler kan forekomme. Vi foretrekker den første mulighet, og anta at dette progenitor kammeret er Bmi1 positiv og avhenger av mitogen kaskade system for selvfornyelse, da behandling med en MEK-inhibitor ført til preferensiell reduksjon i andelen Bmi1 positive tumorceller, og en dramatisk reduksjon i tumormasse [ ,,,0],12]. I samsvar med disse funn celler av den primitive endoderm som vil gi opphav til lunge stamceller viser avhengigheten av mitogene signalisering for selvfornyelse i stedet for differensiering [13]. Det har tidligere blitt vist at polycomb gruppen protein Bmi1 er en avgjørende faktor for selvfornyelse hos voksne stamceller /tumor stamceller gjennom hemming av INK4a /ARF locus koding p16
Ink4a /p19
ARF ([ ,,,0],14], anmeldt i [15]). Bmi1 har også nylig blitt identifisert som en prognostisk markør for NSCLC [16], [17] og representerer en gruppe av forhold som har blitt identifisert som en død-fra-kreft signatur i humane ondartede sykdommer [18].
i denne studien setter vi ut for å evaluere Bmi1 funksjon i RAF indusert adenom formasjon. På grunn av den begrensede levetiden Bmi1 genet ablated mus [19] vi tok fordel av høyere forekomst og kortere ventetid på BXB11 grunnleggeren linje for å undersøke Bmi1 avhengighet av adenom vekst i avansert sykdom.
Bmi1 ablasjon via krysset Bmi1 – /- bakgrunn til BXB23 og BXB11 legger linjen avslørte at Bmi1 ikke er nødvendig for startfasen, men for utvidelse av initierte celler
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
.
Alle dyrestudier ble godkjent av den bayerske statsmyndighetene for dyreforsøk.
Dyr
BXB23 og BXB11 mus ble rutinemessig avlet i C57Bl /6 bakgrunn. For generasjon Bmi1 – /- BXB23 og Bmi1 – /- BXB11 mus SP-C C-RAF BXB mus ble krysset med Bmi1 +/- mus som hadde blitt formert på en FVB /N bakgrunn. De resulterende Bmi1 heterozygot sammensatte mus ble backcrossed med FVB /N /Bmi1 +/- mus til å generere Bmi1 – /-. SP-C C-RAF BXB sammensatte mus
Reagenser og antistoffer
Antistoffer brukes for immunhistokjemi /immunfluorescens: Pro SP-C kanin polyklonale antistoff (Chemicon internasjonal), CC10 geitepolyklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology), pan-Cytokeratin kanin polyklonale antistoff (DAKO), Ki-67 monoklonalt antistoff (Novocastra), C-RAF mus monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology), Bmi1 mus monoklonalt antistoff (Upstate), p19
ARF kanin polyklonalt antistoff (Abcam), c-MYC kanin polyklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology), p16
INK4a kanin polyklonalt antistoff ( Santa Cruz Biotechnology), kanin monoklonalt fosfor-P44 /p42 MAPK Thr 202 /Tyr204 (fosfo-ERK) antistoff (Cell Signaling).
mikros~~POS=TRUNC
Fluorescensmikroskopi ble utført ved hjelp av en Openlab programvare ( Impro, Coventry, UK) kontrollert DMIRBE mikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland) med en 40 × Leica oljeneddyppingsobjektivet. Alle bildene ble tatt og lagret som Openlab LIF-filer. Bilder ble deretter behandlet ved hjelp av power point og Adobe Illustrator-programvare.
Histopatologi og Immunohistochemistry /immunfluorescens farging
Dyrene ble avlivet og lungene ble løst under 25 cm vanntrykk med 4% PBS bufret formalin. Histologi ble gjort på formalinfikserte, parafininnstøpte lunge prøven. 6 mikrometer-cut seksjoner ble deparaffinized, rehydrert i graderte alkoholer og haematoxylin-eosin (H E) farget. For kvantifisering av tumortilfeller antall svulster i minst fem forskjellige områder (310390 mikrometer
2) per H E eller C-RAF farget lunge seksjoner ble regnet. Minst fire mus ble analysert for hver genotype. Tumor volum ble beregnet enten fra H E beiset eller anti-C-RAF farget svulster fra hele lunge seksjoner forutsatt en sfærisk svulst. Diametrene av tumorene ble målt ved hjelp av et Leica mikroskop. For kvantifisering av tumorvolum på minst fire dyr per genotype og alder ble undersøkt: 321 svulster fra BXB11, 266 svulster fra Bmi1 – /- BXB11, 92 svulster fra BXB23 og 54 svulster fra Bmi1 – /- BXB23 dyr i en alder av to uker ble analysert. 133 svulster fra Bmi1 – /- BXB11, 121 svulster fra BXB23 og 4 svulster fra Bmi1 – /- BXB23 dyr i en alder av tre måneder ble analysert. For kvantifisering av proliferasjon Ki67 /pro SP-C-positive celler i lunge seksjoner fra mus av den angitte genotype og alder ble analysert. En total på minst 1200 pro SP-C-positive celler ble tellet fra fem tilfeldig valgte tumorer og analysert for Ki67-co-farging. For TUNEL flekker Dead End Fluorometrisk TUNEL-System (Promega) ble brukt. Totalt 20 tilfeldig utvalgte svulster fra fire mus (Bmi1 – /- BXB11) og 25 tilfeldig utvalgte svulster fra fem mus (BXB11) ble analysert. 325 (+/- 100) DAPI-positive celler pr tumor ble analysert for TUNEL positivitet. For kvantifisering av celler med fosfo-ERK nukleær farging et minimum av 14 svulster fra to mus av den angitte genotype og alder ble analysert. Semi automatisert morfologisk analyse av lunge seksjoner fra WT og Bmi1 – /- Dyrene ble utført som beskrevet i [20]. For kvantifisering av pro SP-C /CC10 doble positive celler fem tilfeldig utvalgte svulster per lungeseksjonen fra totalt 5 dyr i alderen 2 uker til 3 måneder ble analysert. Innstillinger for bildeopptak ble valgt som tillot påvisning av doble positive celler ved bronchio-alveolar-kanalkryss (BADJs)
immunfluorescens stainings ble utført i henhold til følgende grunnleggende protokollen. Parafin innebygde delene ble deparaffinized og rehydrert . For mikrobølgeovn antigen gjenfinning seksjoner ble inkubert i 10 mM citratbuffer for 6-23 min. Lysbilder ble blokkert i passende buffer som inneholder enten 4% geit eller esel serum, eller 1% BSA (eksklusivt for Bmi1 farging). Inkubering med primære antistoffer ble utført over natten ved 4 ° C etterfulgt av påfølgende trinn som følger: For pro SP-C /Ki67-co-flekker snittene ble inkubert med esel anti-mus biotinylert antistoff (1:200) og esel antikanin-antistoff Cy5 (1:200) i 90 minutter ved romtemperatur (RT) Snittene ble deretter inkubert med streptavidin konjugert Alexa 555 (1:200). For Bmi1 fargings snittene ble inkubert med biotinylert geit-antimus-antistoff i blokkeringsbuffer i 90 min ved RT. Etter tre vaskinger med PBS ble seksjonene inkubert med ABC-reagens (Vectastain Elite ABX Kit, Vector Labs) i 30 minutter ved RT. Deretter seksjoner ble inkubert med Cy5-merket anti HRP (horseraddish peroksidase) antistoff (1:100) i blokkeringsbuffer. For p19
ARF fargings snittene ble inkubert med biotinylert esel antikanin-antistoff (1:200) 90 min ved RT. Etter tre vaskinger med PBS-snittene ble inkubert med streptavidin konjugert Alexa 555 (1:200) i PBS, 0,2% Triton X-100, 90 min ved RT. For pro SP-C /CC10 co-flekker seksjoner ble inkubert med esel anti-geit Alexa 555 (1:200) og esel anti kanin Cy5 (1:200) antistoffer i blokkeringsbuffer i 90 min. Alle stainings ble endelig kontra med DAPI før montering.
For immunhistokjemiske stainings seksjoner ble deparaffinized og vannes ut. For antigen innhentings snittene ble inkubert i 10 mM citrat-buffer ved 90 ° C i 10-20 min. Endogen peroksidaseaktivitet ble stoppet med metanol eller PBS inneholdende 3% H
2o
2. For c-MYC-farging ble snittene blokkert 60 minutter med PBS som inneholdt 0,2% triton X-100 og 4% geiteserum. Etter primære antistoff inkubasjon over natten ved 4 ° C snittene ble inkubert med geit antikanin biotinylert sekundært antistoff i en fortynning 1:200 i 60 minutter ved RT. ABC reagens ble brukt (Vectastain Elite ABX Kit, Vector Labs) og utviklet i diaminobenzidine (DAB). Seksjonene ble deretter kontra med hematoksylin og montert etter dehydrering. Fosfo P44 /p42 MAPK-farging ble i det vesentlige utført som beskrevet for c-MYC med følgende endringer: TBS, 1% Tween 20 (TBST) ble anvendt for vaskinger. Seksjonene ble blokkert med TBST inneholdende 0,2% Triton X-100 og 5% geiteserum. Sekundære antistoff inkubasjon ble utført ved anvendelse av biotinylert geite-anti-kanin-antistoff i blokkeringsbuffer i 60 min. Pan-cytokeratin stainings ble utført som beskrevet tidligere [8].
Western blot analyse av hele lungen ekstrakter
For tilberedning av ekstrakter nylagde lungene ble overført til et rør som inneholder 500 mL iskald RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% deoksykolat (DOC), 1% Nonidet P40 med protease inhibitor cocktail). Lungene ble homogenisert i 5 minutter ved bruk av en homogenisator ultraturax i kalde omgivelser. Rørene inneholdende lungehomogenat ble sentrifugert i en avkjølt sentrifuge ved 18 000 g i 30 min. Etter sentrifugering supernatantene ble overført til et nytt rør og aliquoter tatt for proteinbestemmelse. De gjenværende Ekstraktene ble blandet med 2 x Laemmli-lastebuffer oppvarmet til 95 ° C i 5 minutter og enten lagret ved -20 ° C eller løses ved hjelp av SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Etter en times blokkering periode i PBS (0,05% Tween, 5% pulverisert skummet melk) ble blottene inkubert over natt med primært antistoff, vasket tre ganger med PBS og deretter inkubert med et peroksidase koblet sekundært antistoff. Etter tre ganger vask i PBS blotter ble utviklet.
rtPCR
RNA ble fremstilt fra hele lungene av to uker gamle mus bruker peqGOLD Trifast RNA forberedelse kit (peqlab Biotechnologie GmbH) ifølge produsenten bruksanvisning. Prøvene ble utsatt for DNAse behandling før utarbeidelse av cDNA ved hjelp av tilfeldige heksamerprimere levert av First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas).
Real-time PCR ble utført overvåking SYBR grønn innlemmelse. Som en intern kontroll RNA-nivåer av den HPRT-genet ble overvåket. Real-time PCR-analyse ble utført i en Roto-Gene 2000 deteksjonssystem (Corbet Research). Primer sekvenser: HPRT: CACAGGACTAGAACACCT; GCTGGTGAAAAGGACCTCT; P19
ARF: GCGCTCTGGCTTTCGTGAAC; CGTGTCCAGGAAGCCTTCCC; p16
INK4a: CGTGAGGGCACTGCTGGAAG; ACCAGCGTGTCCAGGAAGCC; p15
INK4b: CCAGGAAGCCTTCCCGAGCT; GGGGGCAAGTGGAGACGGTG; Cbx7: CGGCCCATTGGTCAGGTCTG; GACCCTCGCCTTGTCATGGC.
Resultater
Utvikling av NSCLC i BXB23 og BXB11 mus
Lung adenom dannelse ble sammenlignet mellom BXB23 og BXB11 RAF transgen grunnleggeren linjer. Som bedømt fra H 0,05) er vist. C) Kaplan-Meier plott for overlevelsen av BXB11 og BXB23 mus. P-verdi ble beregnet ved hjelp av Logrank test.
Bmi1 fremmer tumorvekst, men ikke startfasen i både BXB11 og BXB23 mus
Basert på observasjonen om at Bmi1 er uttrykt i BXB11 indusert tumorer og den tidligere beskrevne rollen til Bmi1 i tumor stamceller selvfornyelse [14], [22], [23] bestemte vi oss for å ytterligere studere rollen til Bmi1 for utvikling av C-RAF Xb adenomer (figur 2A). Vi generert sammensatte mus som uttrykker SP-C C-RAF BXB transgenet på Bmi1 slå ut bakgrunnen. Som genomisk delesjon av Bmi1 hadde ingen effekt på lunge utvikling og struktur av voksen lunge (figur S2) eventuelle endringer i tumorvekst kan tilskrives Bmi1. Analysen av Bmi1 – /- SP-C C-RAF BXB mus er hemmet av den korte levetiden til disse mus som er forårsaket av delesjon av Bmi1 [24] og sjelden tillatte kontroll av tumorutvikling i mer enn tre måneder.
A) Parafin innebygd lunge seksjoner fra BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 lungene ble farget for Bmi1 (grønn) og DAPI (blå). Prikkede hvite linjer avgrense svulster. Scale bar = 30 mikrometer. B) H E farging av lunge seksjoner fra BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 mus i en alder av to uker og tre måneder viser redusert svulst Burdon i Bmi1 – /- BXB11 lungene. Scale bar = 200 mikrometer. C og D) Analyse av tumor forekomst og vekst i lungene av BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 mus. Data presentert som Box-and-Whiskers plott, for detaljer om datapresentasjon se figur legende i figur 1 (n≥4 dyr pr genotype og alder, for mer informasjon se eksperimentelle materialer). Legg merke til at tumortilfeller er økt med en faktor på to i forhold til figur 1A) på grunn av den FVB /N genetisk bakgrunn som innføres gjennom parring med den Bmi1 – /- mus. n.d. = Ikke bestemt fordi svulster ble sammenflytende. p-verdier ble beregnet ved hjelp av t-test bare p-verdier indikerer betydning vises.
Vi vil derfor først analysert effekten av Bmi1 ablasjon på lungestartfasen i BXB11 bakgrunn som levetiden disse musene matchet som Bmi1 knock out mus. I motsetning til BXB23, BXB11 lungene viste svært store deler av lungen okkupert av svulstvev ved tre måneders alder. Tumorvekst ble sterkt redusert i lungene av Bmi1 – /- BXB11 mus (figur 2B) på to måter, først var det en tilnærmet to gangers reduksjon av tumor tall mellom to uker og tre måneders alder (figur 2C) og andre volumet overlevende svulster redusert (figur 2D). Lignende data ble innhentet for Bmi1 – /- BXB23 sammensatte mus (Figur S3). Selv om redusert i størrelse svulstene i Bmi1 – /- BXB11 lungene viste funksjonene i SP-C C-RAFBXB indusert adenomer som bedømt ved analyse av cellemorfologi og farging med to tumormarkører (pan-cytokeratin og pro SP-C, figur S4) . Også nedstengning av transgene uttrykk som en konsekvens av Bmi1 ablasjon kan utelukkes som årsak til redusert tumorvekst siden Bmi1 – /- BXB11 svulster farget positivt med en C-RAF antistoff (figur S4). Konsekvent nivået av atom fosfo-ERK ble opprettholdt i BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 fra to uker til tre måneder viser at opphør av veksten er ikke forårsaket av en reduksjon i signaliserer gjennom mitogen kaskade (figur S5)
i sammendraget ablasjon av Bmi1 i BXB11 mus fører til sterkt redusert tumorvekst. Den opprinnelige antall tumorer i BXB11 versus Bmi1 – /- BXB11 imidlertid ikke viser en betydelig reduksjon i Bmi1 – /-. BXB11 lungene, noe som indikerer at spesifikasjonen av tumorceller initiering ikke er avhengig av Bmi1
Økt celledød og redusert fraksjon av celler i syklus i Bmi1 – /- BXB11 dyr
den sterkt redusert tumorvekst og tap av svulstene over tid i begge grunnlegger linjer med opphevet Bmi1 uttrykk er enten en konsekvens av en blokk i cellesyklusprogresjon eller økt celledød eller en kombinasjon av begge. Bmi1 har tidligere vært implisert i å fremme tumorcelleoverlevelse og cellesyklusutvikling i en vevskultur modellsystem [25], [26]. TUNEL-farging viste en signifikant økning i den apoptotiske cellen forholdet i adenomer av tre måneder gammel Bmi1 – /- BXB11 mus (figur 3A og 3C). Dette indikerer at apoptose er en sen hendelse i Bmi1 – /- BXB11 adenomer. Neste vi undersøkte vekst. Vi utførte Ki-67 /pro SP-C co-flekker på lungene fremstilt av to uker og tre måneder gammel Bmi1 – /- BXB11 og BXB11 dyr. Fraksjonen av celler i syklus er sterkt redusert ved Bmi1 ablasjon. Videre så tydelig fra BXB11 kontroll i en alder av tre måneder veksten av disse svulstene har også redusert noe som tyder på en begrenset replicative levetid for BXB11 transform AT2 celler eller andre nivåer av vekstkontroll (figur 3B og 3D).
A) TUNEL farging av parafin innebygd lunge seksjoner fra Bmi1 – /- BXB11 og BXB11 mus. DNase I ble behandlet lungeseksjoner ble anvendt som positiv kontroll. Seksjoner ble behandlet uten terminal deoksynukleotidyltransferase tjente som negativ kontroll. Prikkede hvite linjer avgrense svulster. Genotyper og aldre som angitt. Pilene viser apoptotiske (grønne) celler. Scale bar = 30 mikrometer. B) Ki67 (rød) /pro SP-C (grønn) co- immunfluorescens farging av lunge seksjoner fra BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 mus. Pilene viser sykling tumorceller. «*» Indikerer farging artefakt. Scale bar = 30 mikrometer. C) Kvantifisering av TUNEL-positive celler i lungesvulster på to uker og tre måneder gammel BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 mus (n = 4 dyr pr genotype), for mer informasjon se materialer og metoder. Data presentert som Box-and-Whiskers plott for detaljer om datapresentasjon se figur legenden Figur 1. D) Kvantifisering av Ki-67 /pro SP-C dobbel positive celler. Minst fem svulster fra fem forskjellige dyr ble analysert. p-verdier ble beregnet ved hjelp av t-test, er det bare p-verdier indikerer betydning vist.
I konklusjonen både svulst celle overlevelse og celleproliferasjon påvirkes i BXB11 mus med Bmi1 sletting og kan gjøre rede for den observerte reduserte tumorvekst.
Bmi1 avhengig uttrykk for p16
INK4a og p19
ARF
Bmi1 er innblandet i cdki regulering. Mest fremtredende p16
INK4a, p19
ARF har vist seg å være negativt regulert av Bmi1 [27]. Derfor endret p16
INK4a /p19
ARF uttrykk nivåer kunne gjøre rede for det reduserte antall overlevende og sykkel celler i Bmi1 – /- BXB11 svulster. Vi først analysert uttrykk for mRNA nivåer av p16
INK4a av semi-kvantitativ rtPCR i lungene av to uker gammel BXB11 og Bmi1 – /- BXB11 mus (Figur 4A). Expression nivåer av p16
INK4a ble markert økt i Bmi1 – /- BXB11 lungene. Western blot-analyse av hele lungen lysater bekreftet dette resultat på proteinnivå (figur S6a).
A-D) Semi-kvantitativ sanntid PCR-analyse av totalt RNA fra hele lungene til to uker gamle mus, som genotyper indikert. BXB11 nivåer ble satt til én. Dataene er representative for to uavhengige sett av analyse. Data viser standardavvik fra triplikate verdier. p-verdier ble beregnet ved anvendelse av Students t-test, er det bare p-verdier indikerer betydning vist. A) Kvantifisering av p16
INK4a uttrykk nivåer B) Kvantifisering av p19
ARF RNA uttrykk nivåer. C) Kvantifisering av p15
INK4b uttrykk nivåer. D) Kvantifisering av Cbx7 uttrykket nivåer.
Neste vi analyserte mRNA uttrykk nivåer av p19
ARF. Som i tilfellet av p16
INK4a, p19
ARF og p15
INK4b ekspresjonsnivåer ble oppregulert i lungene til Bmi1 – /- BXB11 sammenlignet med BXB11 (figur 4B og 4C). I motsetning til p16
INK4a som ikke ble endret mellom villtype og BXB11 mus, har vi funnet forhøyede nivåer av p19
ARF RNA-ekspresjonen også i BXB11 lunger (data ikke vist). En annen epigenetisk regulator av INK4a locus, Cbx7 ble ikke vesentlig endret i uttrykk på Bmi1 ablasjon i BXB11 mus (Figur 4D). Immunfluorescens farging av Bmi1 – /- BXB11 og BXB11 lungene viste at p19
ARF er uttrykt i lungesvulster av dyr av begge genotyper. Forskjeller i subnuclear fordelingen av p19
ARF er imidlertid tydelig når Bmi1 – /- BXB11 og BXB11 tumorer sammenlignes. Mens ablasjon av Bmi1 er forbundet med en multifokal atomfargemønster av p19
ARF i nesten alle tumorceller er det for det meste begrenset til et enkelt locus innenfor kjernene i tumorer i nærvær av Bmi1 (figur S7).
i konklusjonen finner vi redusert spredning i sent stadium p19
ARF positive BXB11 svulster som kan tolkes som en del av en senescence fenotype. En potensiell forklaring på dette mild effekt kan være c-MYC uttrykk som vi finner i BXB11 tumorceller (Figur S6b) og som nylig er beskrevet å hente en sensescence fenotype i B-RAF forvandlet melanomer [28]. I fravær av Bmi1 imidlertid ekspresjon av INK4a /Arf var mer uttalt selv om c-MYC-ekspresjon ble opprettholdt (fig S6B) til slutt fører til opphør av proliferasjon. Dermed under disse forholdene en c-MYC redning kan ikke lenger brukes.
Ingen bevis for bronchio-alveolar-stamceller (BASCs) i lungesvulster uavhengig av Bmi1
neste adressert bidrag basc celler til SP-C C-RAF BXB svulstdannelse. For dette formål utførte vi pro SP-C /CC10 dobbeltfarging og analysert BXB11 tumorer for tilstedeværelse av doble positive celler. For denne analysen bildeinnstillingene oppkjøpet ble valgt som tillot identifisering av BASCs på BADJs. Som vist i figur 5, kan ingen doble positive celler observeres i tumorer.
Parafin innleiret lunge seksjoner fra BXB11 mus ble farget for pro SP-C (rød) og for CC10 (grønn) for å detektere dobbelt positiv bronchio alveolære stamceller (BASCs). En representant BASC celle som er plassert på en bronchio alveolar kanal krysset (BADJ) er angitt med hvit pil. Scale bar = 30 mikrometer.
I sammendraget disse dataene indikerer at utvalget av Bmi1 uavhengig kreftceller som antagelig representerer kreft initiere celler ikke representerer BASCs.
Diskusjoner
i denne studien vi ansatt to transgene grunnlegger linjer med lunge målrettet uttrykk for C-RAF BXB for avhengighet av adenom initiering og vekst på stamcelleselvfornyelse faktor Bmi1. Vi viser at BXB11 har en fire ganger høyere insidens og kortere latens av adenomer som tillater undersøkelse av fremskreden sykdom i fravær av Bmi1. Uttømming av Bmi1 i både BXB23 og BXB11 bakgrunn førte til en markert reduksjon i tumorveksthastigheten og en økning i celle-død innenfor adenomer. I motsetning ingen signifikant reduksjon i tumor innledende hendelser kunne observeres i både grunnlegger linjer, argumenterer for Bmi1 å være en viktig faktor for svulstvekst heller da innvielse.
Basert på observasjon, som Bmi1 er uttrykt i C- RAF BXB initiert lungeadenomer og at Bmi1 er et mål på RAF signale [19] vi besluttet å undersøke adenom dannelse i fravær av Bmi1. Opphevelse av Bmi1 ekspresjon i BXB23 og BXB11 bakgrunn ikke ga en betydelig reduksjon i startfasen arrangementer som er definert av antall tumorer som ble dannet i de forskjellige genetiske kombinasjoner av to ukers alder. Analyse av lunge adenom celler i fravær eller nærvær av Bmi1 avslørte ikke forskjeller på den morfologiske og ved cellemarkør ekspresjonsnivå. Derfor fravær av Bmi1 ikke påvirker prosessen med startfasen. Disse resultatene er i overensstemmelse med en tidligere publisert rapport som viser Bmi1 uavhengig gliom initiering om enn i fravær av INK4a [29]. Fraværet av Bmi1 påvirket ikke identiteten av de resulterende tumorceller med hensyn til morfologi og ekspresjon av et begrenset sett av markører. Disse resultatene indikerer også at Bmi1 ikke er nødvendig for spesifisering av en tumorcelle initiere i lungene. Fosfor-ERK nivåer kan kompensere Bmi1 tap på kort sikt, men ikke lang sikt selvfornyelse divisjoner av initierte celler som vi observerte betydelig tumorvekst i Bmi1 – /- BXB11 viser høyere atom fosfor-ERK fulgt av opphør av celledeling på slutten tidspunkter ( tre måneders alder) når atom fosfor-ERK var fortsatt til stede. I løpet av våre studier vi også ikke observere forandringer i lunge morfologi i Bmi1 – /- mus indikerer at Bmi1 ikke er en avgjørende faktor for riktig lunge utvikling. Vi fant en sterk oppregulering av p19
ARF, p16
INK4a og p15
INK4b i hele lungen RNA preparater av Bmi1 – /- dyr sammenlignet med villtype kullsøsken. Ekspresjon av p19
ARF kan ikke utelukkende tilskrives lunge infiltrerende celler i det hematopoetiske system, siden vi ser tydelig p19
ARF ekspresjon i AT2-celler og celler som kler bronkiene i Bmi1 – /- dyr (data ikke vist ). Selvfølgelig, uttrykk for cdkis ikke svekke normal lungecellefunksjon. Dette funnet er interessant om off target virkninger i mulige fremtidige terapeutiske strategier rettet mot Bmi1 i lungekreft
Cdkis kodet på INK4a locus er innblandet i hemming av cellesyklusprogresjon og kontroll av celleoverlevelse [30] -. [ ,,,0],32]. I tråd med dette ser vi redusert tumorcellesyklusprogresjon i Bmi1 – /- BXB11 tumorer og en økning i celler som gjennomgår apoptose dog med en viss forsinkelse. Disse funnene er i tråd med tidligere resultater publisert av Liu og kolleger [25] viser
in vitro
en spesifikk effekt av Bmi1 på tumorcelleoverlevelse.
I overensstemmelse med tidligere rapporter som viser P19
ARF opp-regulering i respons til onkogene signaler hyperproliferative [33] – [35], ekspresjon av p19
ARF er ikke begrenset til den Bmi1 – /- bakgrunn, men kan også observeres i mindre grad i BXB11 adenomer. Vi merket oss at p19
ARF lokalisert til kun én til to distinkte atom foci innenfor BXB11 adenomer.
