Abstract
Den molekylære anstand HSP90 avhengig proteom- representerer et komplekst protein nettverk av kritisk biologisk og medisinsk relevans. Kjent for å assosiere med proteiner med et bredt utvalg av funksjoner betegnes kunder, opprettholder HSP90 viktige essensielle og onkogene signalveier. Følgelig er HSP90-inhibitorer blir testet som anti-kreft medikamenter. Ved hjelp av en integrert systematisk tilnærming for å analysere virkningene av HSP90 hemming i T-celler, kvantifisert vi differensial endringer i HSP90 avhengige proteom-, HSP90 interactome, og et utvalg av transkriptom. Kinetiske oppførsel i HSP90-avhengige proteom- ble vurdert ved anvendelse av en ny puls-chase strategi (Fierro-Monti et al., Tilhørende artikkel), detektering av effekter på både proteinstabilitet og syntese. Globale og spesifikke dynamiske virkninger, inkludert proteostatic svar, er på grunn av direkte hemming av HSP90 samt indirekte effekter. Som et resultat ble en reduksjon påvist i de fleste proteiner som har endret sine nivåer, inkludert kjente HSP90 klienter. Mest sannsynlig, konsekvenser av rollen HSP90 i genuttrykk fastsatt en global reduksjon i netto
de novo
proteinsyntesen. Denne nedgangen ut til å være større i omfang enn en samtidig observert global økning i proteindempe. Flere nye antatte HSP90 klienter ble validert, og interessant, protein familier med kritiske funksjoner, spesielt HSP90 familie og kofaktorer selv samt protein kinaser, vises økt kraftig forfall priser på grunn av HSP90 inhibitor behandling. Bemerkelsesverdig, en oppsving i overlevelse trasé, med molekylære anstand og flere teinene, og reduserte nivåer av enkelte kreftdempere, har implikasjoner for anti-kreftterapi med HSP90 hemmere. Mangfoldet av globale effekter kan representere et paradigme mekanismer som opererer for å skjerme celler fra proteotoxic stress, ved å fremme pro-overlevelse og anti-proliferative funksjoner. Dataene er tilgjengelige via ProteomeXchange med identifikator PXD000537
Citation. Fierro-Monti jeg, Echeverria P, Racle J, Hernandez C, Picard D, Quadroni M (2013) Dynamiske virkninger av Hemming av Molecular anstand HSP90 på T-Cell Proteome ha implikasjoner for Anti-Cancer Therapy. PLoS ONE 8 (11): e80425. doi: 10,1371 /journal.pone.0080425
Redaktør: Lennart Martens, UGent /VIB, Belgia
mottatt: 30 april 2013; Godkjent: 02.10.2013; Publisert: 27.11.2013
Copyright: © 2013 Fierro-Monti et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd nummer 31003A_127256 fra den sveitsiske National Science Foundation (www.snf.ch) samt intern finansiering fra University of Lausanne. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Molecular anstand er sentrale i mobilnettet proteostasis. De er nært involvert i viktige biologiske prosesser som oversettelse, folding, kompleks sammenstilling og demontering, translokasjon over membraner og proteinnedbrytning [1], [2]. Den funksjonelle betydningen av molekylære anstand og deres implikasjoner i sykdomstilstander har identifisert dem som sentrale narkotika mål i kreft [3], [4]. I eukaryoter, den varmesjokkprotein 90 (HSP90) spiller en særegen rolle blant anstand ved å lette brettingen av transkripsjonsfaktorer som regulerer aktivering av kinaser [5], [6] og steroidhormonreseptorer [7], assistere i dannelsen av protein komplekser [8], [9], og spiller en rolle i protein omsetning og smugling. For å oppnå alle disse funksjonene, HSP90 forbinder med co-anstand, HSP90 underlag, og deres samspill partnere [2], [6], [10]. HSP90 klienter er definert som proteiner som er avhengige av HSP90. Netto Forekomsten av mange, men ikke alle HSP90 kunder, redusere ved HSP90 hemming, mest sannsynlig på grunn av proteasomal degradering. Kunder med et bredt utvalg av funksjoner krever HSP90 å skaffe riktig konformasjon, for aktivisering, og /eller for stabilitet. Overekspresjon av HSP90 som et aktivert multi-anstand komplekset er hyppig i ondartede celler [11], [12], og mange HSP90 kunder ta del i signalveier med onkogene relevans [13], [14]. Hemming av HSP90 kan blokkere viktige veier for kreft, som er grunnen til HSP90 har vakt stor interesse som et mål for anti-kreft narkotika utvikling [12], [14], [15]. HSP90 hemmere, som geldanamycin (GA) er konkurrerende hemmere av ATP-bindende. Disse hemmer anstand funksjon, og som en konsekvens kan de utøve anti-tumor-aktivitet ved å redusere nivåene av onkogene klienter [12] – [14]. For tiden er det ca 20 hemmere i kliniske studier [13], [15].
Tidligere forsøk har vært rettet mot å identifisere og kvantifisere den delen av proteomet som er avhengig av HSP90, oftest ved hjelp av standard SILAC (stabile isotoper Merking av aminosyrer i cellekultur, stSILAC) -baserte kvantitative proteomikk [11], [16] – [19]. Resultatene fra disse og tidligere studier med ulike proteomikk tilnærminger har forbedret vår forståelse av rollen til HSP90 i kreft, samt et mål av lovende kreftmedisiner [20]. Protein profilering ble anvendt sammen med proteomikk screening for å identifisere deler av inhibitoren bundne HSP90-komplekser [11]. Kvantitative og kinase-målrettet chemo-proteomikk analyser [17], [19] av HSP90-avhengige proteom- uthevet HSP90 klienter, som er direkte berørt av sin hemming, og proteiner som er indirekte påvirket. HSP90 inhibering ble funnet å påvirke spesielt proteome dekkende overflod (stSILAC) av proteiner som deltar i proteinfolding maskineri, den DNA-skade respons, så vel som protein-fosforylering og signalering av kinaser [18], [19]. For å utvide vår kunnskap om HSP90-avhengige proteom- og effekten av GA-mediert HSP90 hemming i T-celler, søkte vi en ny integrert systematisk tilnærming. Først analyserte vi den dynamiske (over tid) endringer i stSILAC hopetall i løpet av kort (opptil 6 t) og langsiktig (opp til 20t) GA-behandling, oppdager endringer i protein grupper med forskjellige atferd. Siden HSP90 hemming antas å påvirke store deler av proteomet (1-10%) gjennom endringer i både forfall og syntese, søkte vi en ny puls-chase SILAC (pcSILAC) strategi som ga innsikt i hvordan endringer i protein overflod genereres ( Fierro-Monti et al., tilhørende artikkel). Differensierte og dynamiske endringer i
de novo
syntese og nedbrytning ble identifisert på proteiner i form av forfall hastighetskonstanter [k
d] og priser for syntese [V
s]. Vi har oppdaget at en større global reduksjon i proteinsyntesen enn proteinstabilitet, mens mange viktige proteinfamilier redusert deres halveringstider på grunn av HSP90-inhibering. Modellering av vår kvantitative datasett på en HSP90 interaksjon database [21] bidro til å skille og vurdere mer spesifikke dynamiske endringer validerer potensielt nye HSP90 kunder innenfor HSP90 interactome. Som protein overflod kan bli påvirket av endringer på nivået av transkripsjon, ble mRNA nivåer derfor bestemt for et utvalg av proteiner med økt eller redusert netto stSILAC Forekomsten ved GA-behandling. Helt, vår analyse av HSP90 hemming tillatt en integrert vurdering av dynamikken i T-celle HSP90 avhengige proteom-, noe som gir ytterligere innsikt på virkningsmekanismen til en hemmer av HSP90.
eksperimentelle prosedyrer
Celler
Jurkat T-lymfocytter klone J77.20 var en slags gave av Dr. Oreste Acuto, University of Oxford, og har tidligere blitt beskrevet [22], [23]. Celler ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium (Cell Culture Technologies, Gravesano, Sveits) med 10% (v /v) dialysert føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen), ved utføring av stSILAC eller pcSILAC eksperimenter.
stSILAC eksperimenter
isotop-merkede aminosyrer (
13C
6-L-lysin,
13C
6
15N
4-L- arginin, Cambridge Isotope Laboratories (CIL), Andover, MA) ble inkludert i «heavy-stSILAC medium «100 mg /l, mens prolin ble tilført med 180 mg /l (en 9-gangers overskudd i forhold til dens standard konsentrasjon i RPMI medium) på alle stSILAC og pcSILAC media. Tung eller lett-stSILAC merking (samme som tung-stSILAC medium, men inneholdende standard lysin og arginin) ble oppnådd ved å dyrke cellene i 2 uker for å tillate minst 5 celledelinger. Før start av forsøkene, ble testene gjennomført for å verifisere at tunge merking var 98%, og for å Arg Pro omdannelse var lavere enn 5%. Tunge-stSILAC merkede celler ble behandlet med 1 pM Geldanamycin (GA) (Cell Signal, Danvers, MA) i dimetylsulfoksyd (DMSO) for 6 eller 20 timer, og lys-stSILAC-merkede celler ble behandlet med samme volum av DMSO og anvendt som en kontroll. Tre uavhengige biologiske replikater av behandlede (tung-merket) eller ubehandlet (lys, kontroll) celler ble gjennomført parallelt. Én av de tre gjentak ble invertert ved hjelp av lys-etikett for den behandlede, og tung-etikett for de ubehandlede cellene.
Cellene ble lysert i 4% natriumdodecylsulfat (SDS), 100 mM Tris /HCl pH 7,5, 100 mM ditiotreitol (DTT), etterfulgt av oppvarming ved 95 ° C. Etter sentrifugering og protein konsentrasjonsmålinger, ble ekvimolare utdrag fra lys /tung eller tunge /mellom merket celler kombinert, alkylerte med iodoacetamide og fordøyd som beskrevet [24]. De oppnådde peptidblandinger (200 ug totalt materiale) ble avsaltet på SepPak C18 patron (Waters Corp., Milford, MA), tørket, oppløst i 4M urea med 0,1% amfolytter pH 3-10 (GE Healthcare) og fraksjonert ved off-gel fokusering som beskrevet [25]. De 24 fraksjoner ble avsaltet på en microC18 96-brønns plate (Waters Corp., Milford, MA), tørket og resuspendert i 0,1% maursyre, 3% (v /v) acetonitril for LC-MS-analyse. Prøvene ble analysert på en hybrid lineær felle LTQ-Orbitrap Velos massespektrometer (Thermo Fisher, Bremen, Tyskland) tilkobles via en nanospray kilde til en Dionex RSLC 3000 nanoHPLC system (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Peptider ble separert på en revers-fase Acclaim Pepmap nanocolumn (75 um ID x 15 cm, 2,0 um, 100 um, Dionex) med en gradient 5-85% acetonitril i 0,1% maursyre (total tid: 120 min). Full MS undersøkelsen skanninger ble utført på 60’000 oppløsning. I dataavhengig oppkjøp kontrollert av Xcalibur 2.0.7 programvare (Thermo Fisher), ble de tyve mest intense formere ladede forløperionene oppdaget i full MS undersøkelsen scan valgt for Kollisjon-Induced Dissosiasjon (CID) fragmentering i LTQ lineære fellen med en isolasjon vindu på 3,0 m /z og deretter dynamisk ekskludert fra videre valg i løpet av 120s. De massespektrometri proteomikk data har blitt avsatt til ProteomeXchange Consortium (https://proteomecentral.proteomexchange.org) via PRIDE partner depotet [26] med datasettet identifikator PXD000537
MS dataanalyse. Identifisering og kvantifisering
MS-data ble analysert og kvantifisert ved hjelp MaxQuant versjon 1.0.13.13 [27], kombinert med Mascot (Matrix Science, London, UK) versjon 2.3. Peaklists ble generert med MaxQuant med standard parametere. Database søk ble utført på IPI Menneskelig v3.68 database, filtrert for å beholde bare oppføringene kartlegging en UniProtKB /Swiss-Prot identifikator (34743 oppføringer faktisk søkte) for å maksimere sekvens og annotering kvalitet i videre analyse trinn. Cleavage spesifisitet var trypsin (spalting etter K, R, ingen spalting ved KP, RP) med to savnet konfliktlinjer. Massetoleranser var av 7 ppm for forløperen og 0,5 Da for CID tandem massespektra. Den iodoacetamide derivat av cystein ble oppgitt som en fast modifikasjon, og oksidasjon av metionin og protein N-terminal acetylering ble angitt som variable modifikasjoner. Protein identifikasjoner ble filtrert ved 1% falsk funnrate (FDR) etablert av MaxQuant mot en omvendt rekkefølge database. Minst ett unikt peptid var nødvendig for å diskriminere sekvenser som delte peptider. Sett av proteinsekvenser som ikke kunne bli diskriminert basert på identifiserte peptider ble oppført sammen som protein grupper og er fullt rapportert i tabellene. Detaljer om peak kvantifisering og protein ratio beregning av MaxQuant er beskrevet andre steder [27]. Alle proteiner med kvantifiserte verdier (minimum bevis count = 1) ble holdt tilbake i begynnelsen, men ble filtrert i etterfølgende trinn (se nedenfor)
StSILAC dataanalyse:. Kvalitet filtrering av datasettet
Alle filtrerings trinn ble utført med skreddersydde Perl-skript (Perl v5.10.1, skript tilgjengelig som tilleggsdata). Protein gruppe tabeller fra MaxQuant ble videre behandlet for å fjerne forurensninger kommentert i databasen og kamper for å reversere sekvenser. En ytterligere 63 proteiner fra en intern laboratorie liste av 65 miljøforurensninger ble også fjernet. Videre, forhold ble fjernet da beregnet på grunnlag av enkle bevis, så vel som, for hvert tidspunkt, proteiner hvis de ble identifisert bare i en replikere. Avvikende protein grupper, definert som proteiner med en ratio avviker med mer enn en faktor 1,41 mellom to vilkårreplika når som helst punkt, ble fjernet (28 proteiner). Avvikende definisjon ble gjort ved å plotte dataene og velge punkter med programvaren Perseus. Dette resulterte i «Kvalitets filtrert SILAC datasett» inneholder 4050 proteiner (Tabell S2), hvert oppdaget og kvantifisert i ikke mindre enn to paralleller, i det minste på ett tidspunkt.
T-test og clustering
Fra og med «Kvalitet-filtrert SILAC datasett», ble bare protein grupper kvantifisert i alle tre gjentak (3333 proteiner) (Tabell S3) holdt. For hvert tidspunkt, kan du logge
2 av kvantifiserte forhold ble utsatt for en to-tailed Welch t-test for en prøve (null-hypotesen H
0: μ = 0) etterfulgt av korreksjon for multippel testing (Benjamini-Hochberg ). Alle proteiner med på p 0,05 (etter korreksjon) ble betraktet som signifikant. Protein grupper vesentlige i det minste på ett tidspunkt ble underkastet Model Correlation klynger til å detektere mønstre av oppførsel som en funksjon av tid. T-tester og clustering ble utført med R programvareversjon 2.12.1 (2010-12-16). Etter tilsetning av en (0,0) referanse tidspunkt, ble data monteres ved å beregne Pearson korrelasjonskoeffisient til ad hoc-definerte modeller vurderer i en forenklet kvalitativ form (0 = ingen endring, 1 = log
2 (H /L) 0, -1 = log
2 (H /L) 0) alle mulige endringer i løpet av to tidspunkter. Å diskriminere endres som en funksjon av tiden fire mer oppførsel ble vurdert når et protein som hadde to verdier med samme fortegn. Dette resulterte i følgende 13 mønstre: [0,2,1] [0,1,2] [0,1,1] [0,1,0] [0,1, -1] [0,0,1 ] [0,0, -1] [0, -1,1] [0, -1,0] [0, -1, -1] [0, -1, -2] [0, -2, – 1] [0,0,0]. Protein grupper med t-test p 0,05 på alle tidspunkter ble tildelt klynge 13. Proteiner kun påvist ett tidspunkt ble tildelt klynge 14.
Merknader analyse: fjerning av undergrupper og oppdatering av protein merknad
for å forenkle etter MaxQuant sammenligninger av datasett, ble undergruppe proteiner (identifisert med en undergruppe av peptider) fjernet fra protein grupper. For å sikre at Uniprot, GO, KEGG og PFAM merknader var helt up-to-date, et Perl-skript automatisert REST (Representational State Transfer) ber til Uniprot (https://www.uniprot.org/uniprot/) og EBI nettsteder (https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/GAnnotation) og Simple Object Access Protocol (SOAP) ber til KEGG (Kyoto Encyclopedia of gener og genomer) nettside (https://soap.genome.jp/KEGG.wsdl), samt re-innførsel av disse data i resultattabellen på grunnlag av de forenklede protein grupper. Tildelingen av hver merknad sikt til hver identifikator i et protein gruppe ble kartlagt, og er rapportert i tabell S4. Gene ontologi (GO) sikt berikelse analyse ble utført med den elektroniske verktøyet Gorilla (https://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il/) [28], ved hjelp av protein gener i hver klynge som spørring, for å være sammenlignet mot hele settet av identifiserte proteiner
Nettverksbasert basert~~POS=HEADCOMP data organisasjon og oppdagelse
Integrering av eksperimentelle data i protein-protein interaksjon (PPI) nettverk for å bygge utforsk kart ved hjelp Cytoscape (http.: //www.cytoscape.org) har tidligere blitt beskrevet [29], [30]. Vi antok at statistisk signifikans er mindre viktig i en nettverksanalyse, som privilegier sammenhenger og mønstre, og dermed har vi brukt en mindre strengt filtrert datasett som input. Ved hjelp av menneske-sentrert PPI database [21], var det mulig å trekke ut et nettverk med 1263 proteinene som passerte t-test (p 0,05) før multippel testing korreksjon i det minste ved ett av de to tidspunkter (6 H eller 20 h). En «node» i dette nettverk tilsvarer et protein og forbindelsen mellom dem er kalt «kant», og det refererer til PPI mellom disse to noder. De normaliserte H /L forholdstall for stSILAC 6h og 20H datasett ble deretter lastet inn på dette nettverket. Noder ble farget med en rød-til-blå gradient (varmekartet termo) i henhold til deres log
2 forholdstall /fold-endre verdier, slik at rødt og blått representerer berikelse og utarming, henholdsvis. Informasjon for de ulike medlemmene av nettverket ble også lastet fra ulike databaser (Uniprot, Gene ontologi, OMIM) for å ha det tilgjengelig i grafen som metadata. Basert på nettverksorganisasjonen, stSILAC dataintegrasjon og informasjon om protein funksjon, den Cytoscape plugin Mcode [31] tillot påvisning av høyt sammenhengende grupper av noder (subgraphs) som kan anses som protein komplekser og funksjonelle moduler for ulike prosesser av interesse. Når en funksjonell modul av interesse (med lignende funksjoner og lignende oppførsel i stSILAC data) ble påvist, var dette sub-nettverk ytterligere utforsket å finne andre tilkoblede moduler (tilstede i hovednettet) som er involvert i relaterte biologiske prosesser i helse eller sykdom. Dette arbeidet ble deretter supplert med litteratur gruvedrift for å forbedre vår forståelse av den biologiske relevansen av disse er koblet modulene.
Justering av datasett
Protein grupper i analysert datasett fra pcSILAC og stSILAC samsvarte med IPI identifikatorer . Først når alle IPI identifikatorer i et protein gruppe var identiske i to datasett, ble proteingrupper og kvantitative verdier matchet og innrettet i et felles bord.
Antistoffer
polyklonale anti-OGT antiserum ble en gave fra Winship Herr, CIG, University of Lausanne. Polyklonale anti-BRAT1, anti-ITK, anti-eIF2α og anti-fosfor-eIF2α sera ble hentet fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA).
Immunpresipitasjon
Celler ble lysert i 15 min på is i lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM KCl, 0,2 mM MgCl
2, 1 mM ditiotreitol, 2% Triton X-100). Ekstraktene ble ultralydbehandlet og fjernet ved sentrifugering ved 12’000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C. 1 mg av proteiner av supernatanten (i 1 ml) ble inkubert med hvert antistoff over natten ved 4 ° C. Etter vasking av immunpresipitater med Tris-bufret saltvann, ble proteinene eluert i SDS-PAGE-prøvebuffer uten DTT ved koking. 50 mM DTT ble tilsatt til supernatanten og proteiner separert ved SDS-PAGE og bearbeidet for immunblotting. For re-sondering de blotter med et annet antistoff, ble de frastjålet i 2 timer ved 65 ° C med Tris-bufret saltvann som inneholder 0,2% Tween-20.
Cell syklus analyse
Cells ( 2 x 10
6) ble fiksert med 2% paraformaldehyd i 10 minutter ved RT, og ble gjort permeabelt ved behandling med fosfat-bufret saltvann (PBS) inneholdende 0,5% saponin (Sigma), 2% FCS og 2 mM EDTA, i 5 min ved RT. De ble deretter inkubert med Hoechst 33342 (20 ug /ml; Invitrogen) i 5 min ved RT. Data ble ervervet på en LSR II (Becton Dickinson) og ble analysert med FlowJo programvare (TreeStar)
RNA. NanoString NCounter kvantitativ analyse
Fra hver biologisk replikere (3 for stSILAC og 2 for pcSILAC) og tidspunkt, to uavhengige celleprøver ble tatt og behandlet hver for seg. RNA ble renset fra celleekstrakter med Mini spin kolonner (RNeasyPlus Mini Kit fra Qiagen, Hilden, Tyskland). 200 ng av total RNA ble hybridisert med multiplekserte Nanostring prober og prøver ble behandlet i henhold til publisert fremgangsmåte [32]. Strekkoder ble talt for 1150 synsfelt per prøve. Bakgrunn korreksjon ble utført ved å subtrahere gjennomsnittet pluss to standardavvik av de negative kontroller for hver prøve. Verdier 1 ble festet til 1. Positive kontroller ble brukt som kvalitetsvurdering. Dette ble gjort ved å sjekke at forholdet mellom høyeste og laveste positive kontroller gjennomsnittet blant prøvene var under 3. Deretter teller målgener var normalisert med det geometriske gjennomsnittet av de 12 referanse gener (gen liste) er valgt som den mest stabile hjelp den geNorm algoritmen [33]. Fold-endringer ble beregnet som prosenter av det geometriske gjennomsnittet av tellingene i forsøksbetingelser (GA) over at av kontroll tilstand (DMSO) og ble uttrykt som log
2 verdier.
Resultater
Eksperimentelt system
Jurkat T-lymfocytt-cellelinje er tidligere blitt benyttet som en modell for å definere mekanismer for mottagelighet for kreft til medikamenter [34], og til å analysere virkningen av HSP90-inhibitorer på individuelle proteiner eller cellefunksjoner [35] – [39]. HSP90 familiemedlemmer i eukaryote celler er representert ved cytosolic Hsp90β (konstituerende, kodet av HSP90AB1) og Hsp90α (induserbar, kodet av HSP90AA1), endoplasmatisk retikulum (ER) Grp94 (endoplasmin) og mitokondrie isoform Trap1. Behandling av celler med GA har vist seg å hemme Hsp90β, Hsp90α, og Grp94, mens Trap1 er muligens mindre eller ikke påvirket av GA i intakte celler [40].
Først, utførte vi en standard SILAC (stSILAC) global analyse av virkningene av HSP90-inhibering i løpet av behandlingen, uttrykt som endringer i relative Forekomsten i GA-behandlede versus kontroll DMSO-celler. Vi brukte en sub-dødelige medikamentkonsentrasjonen [1 mikrometer] i medium (under estimert intracellulær proteinkonsentrasjonen av HSP90). Konsentrasjonen av GA, ble funnet å redusere celletall ved t = 20 timer etter behandling. Dette skjedde mest sannsynlig ved å indusere en cellesyklus-stans, som ble detektert ved en strømnings-cytometri analyse som en berikelse av celler blokkeres enten i G1 eller G2 /M fase (Fig. S1A-B), og ble ledsaget av en reduksjon av cellene i S-fasen. Vi vurderte induksjon av apoptose ved immunblotting, å detektere spaltning av caspase substratet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP1), men ikke observert sterk induksjon av apoptose under de analysebetingelser (fig. S1C). Dynamikken til virkningene av HSP90-inhibitor på protein Forekomsten ble overvåket ved å ta prøver porsjoner av celler og ekstrahering av proteiner ved tidspunktene t = 6 timer og t = 20 h ettertilsetning av medikamentet. Prøvene ble også samlet inn ved t = 5t og t = 19 h for total mRNA rensing for å bestemme transkripsjonsnivåer (figur 1A). Data fra stSILAC ble integrert med protein-protein interaksjoner å bygge et nettverk og med syntese og dempe fra pcSILAC og mRNA-data for en multi-parameter analyse av systemet (figur 1B).
A) Merking og prøve forberedelse ordningen. Geldanamycin eller DMSO ble tilsatt ved t = 0. Totalt proteinekstrakter ble samlet ved t = 6t og 20h, mens total mRNA ble tatt ved t = 5t og t = 19 h. B) Dataanalyse og tolkning kombinert data på protein overflod endringer (stSILAC) med protein-protein interaksjoner (PPI) analysert som et nettverk, syntese og forfall verdier for proteiner i de to forholdene og transkripsjonsnivåer. Anriking av Gene Ontologi merknader termer ble brukt til å trekke ut funksjonell informasjon om protein kategorier med vanlige atferd.
Globale funksjoner av stSILAC datasett
Analyse av MS data med MaxQuant med standard parametere identifiserte 5707 protein grupper (tabell S1) før filtrering. Sett av identifiserte proteiner var svært lik blant gjentak, med 73% av de totale protein grupper identifisert i alle tre gjentak på hvert tidspunkt. Den Pearsons korrelasjonen av behandlet /kontroll forhold mellom replikater på 20 timer, var større enn 0,85 (Fig. S2A-B), noe som indikerer god reproduserbarhet. Forskjeller mellom GA-behandlede og kontrollcellene økes med tiden, som vist ved utvidelse av fordelingen av forholdene når man går fra 6 timer til 20 timer (fig. 2A). Korrelasjonen mellom median-forhold på 6 timer og 20 timer var bare partiell (r = 0,59, fig. S2C), noe som tyder på at selv om i de fleste tilfeller proteinnivåer endres i samme retning, mer komplekse mønstre av endringer i tid kunne observeres.
A) Histograms av normalisert behandlet /kontrollforhold for stSILAC 6t (gul), og 20t (grønn) datasett (4050 proteiner). B) Tolv mulige endringsmønstre på GA behandling ble definert (små tomter) som modeller for korrelasjon clustering. Ytterligere klynger (ikke vist) inkludert proteiner uten noen vesentlige endringer (cluster 13) og proteiner med data bare på ett tidspunkt (klynge 14). Antallet gener (koder proteiner) identifisert i hver klynge er angitt i boksen.
Analyse og gruppering av stSILAC data
For analyse av hele proteomet data, stSILAC datasett ble filtrert for å beholde bare proteiner detektert i alle tre replikater (tabell S3) og deretter utsatt for en t-test for å identifisere proteiner som varierte betydelig mellom kontroll og inhibitor-behandlede prøver. 565 proteiner (17%) bestått t-test (p 0,05 med Benjamini-Hochberg korreksjon) i det minste på en av de to tidspunkter, og således viste statistisk signifikante endringer ved GA behandling. Dette datasettet ble montert til
ad hoc
definerte mønstre som resulterer i 12 klynger, som hver representerer kvalitativt forskjellige mønstre av svingninger i hopetall, eller atferd på 6 og 20 h (Fig. 2B) (Fig. S3, Tabell S3). Proteiner ikke signifikant påvirket av GA ble utelatt fra klyngeanalyse. Fordelen med denne metode sammenlignet med uten tilsyn clustering metoder er at en felles oppførsel av proteiner i hver gruppe kan lett utledes. Interessant, de fire største klyngene (klynger 2, 6, 7 og 11) inneholdt hver mer enn 80 proteiner og sammen utgjør de for 94,3% av alle gruppert proteiner. Disse 4 klynger tilsvarte henholdsvis til proteiner øker eller avtar kontinuerlig fra 6 til 20 h (henholdsvis klynger 2 [0: 1: 2] og 11 [0: -1: -2]), eller til proteiner betydelig varierende bare ved 20h (klynge 6 [0: 0: 1] og 7 [0: 0: -1]) (fig. 2B). Alle andre klynger inneholdt mindre mengder proteiner, med maksimum 10 for klyngen 5.
Effekter av HSP90 hemming basert på GO vilkår beriket i klynger og på flere eksperimenter
For å finne ut om funksjonelt eller strukturelt beslektede proteiner ble varierende på samme måte ved medikamentell behandling, utførte vi en merknad berikelse analyse på hver av de 12 klynger (tabell S4, et utvalg av klynger og noen av deres tilknyttede GO vilkår er vist i tabell 1). Globalt mild (maks. 4-dobling til maks. 5 ganger reduksjon) ble påvist effekter på proteiner og proteinkomplekser som er involvert i en rekke prosesser og signalveier.
Klynger med økende nivåer på HSP90 hemming
i tidlige stadier av HSP90 hemming av GA (cluster 2), identifiserte vi en oppsving av proteiner som er involvert i respons til folding stress i cytosol, men også på akuttmottaket, i samsvar med tidligere resultater i myelom celler behandlet med HSP90-inhibitorer [41], [42]. Mange proteiner lokalisert i vesikkel Kamrene ble også øket. De samme eller beslektede GO vilkårene ble også beriket i senere økende proteiner i klynge 6, sammen med cytoskeletal komponenter, membranbundne små GTPases (Rab proteiner), Golgi proteiner og proteasome. Alt i alt, en opp-regulering av bretteapparatet i cytosol og ER, sammen med en generell stress-og pro-overlevelse reaksjon oppstår fra settet med økt proteiner. Tatt i betraktning de observerte ER stress respons, evaluerte vi fosforyleringen av α subenhet av eukaryote initiering faktor to (eIF2α), enten ved proteinkinaser som lokaliserer til cytoplasma (PKR), eller ved ER membranen (PERK), som det har blitt etablert som en stressrespons mekanisme for å inhibere proteinsyntese [43]. Vi har bekreftet en mild økning av fosforylering av eIF2α kort tid etter GA-behandling (Fig. S4), i samsvar med tidligere studier utført i HeLa-celler [44].
Klynger med avtagende nivåer på HSP90 hemming
Vi har observert en kraftig nedgang (inntil 6 timer) i ATP-bindende proteiner og protein kinaser (cluster 11). Blant disse proteinkinaser, la vi merke til en kontinuerlig og progressiv reduksjon av medlemmer av T-celle-reseptor signalveien. Vi har observert en betydelig antall proteiner knyttet til kinetochore og kondenserte kromosom funksjoner. De fleste av disse proteinene ble nukleære porer proteiner involvert i nucleo-cytoplasmisk transport. Seneffekter (cluster 7) reflekteres anriking av flere GO vilkår knyttet til ribosom biogenesis (rRNA behandling, nukleolære proteiner). Noen faktorer avgjørende for DNA replikasjon (forlengelse trinn) var også redusert på slutten ganger. Ribosom biogenese, en av de dyreste cellulære prosesser når det gjelder energi, er kjent for å være korrelert til cellesyklusprogresjon gjennom MDM2-p53 veien [45]. Overall, en nedregulering av proteinsyntesen maskiner sammen med endringer knyttet til cellesyklus arrest synes å dukke opp fra settet med mink proteiner.
Nettverk analyse
Medikamentell behandling førte til et redusert overflod av både kjent og mange potensielt nye HSP90 kunder. Vi tenkte at uttømming kan ikke tas av seg selv som betyr at et protein er en HSP90 klient, og vi utforsket andre strategier for å dissekere hendelsene. Vi formet således at kvantifisert stSILAC datasettene på den tidligere konstruerte HSP90 protein-protein interaksjon (PPI) nettverk Hsp90Int [21]. Flere svært sammenhengende subgraphs og funksjonelle moduler ble hentet fra Hsp90Int databasen til å vise dynamiske endringer basert på stSILAC datasett.
Komponenter av HSP90 molekylære anstand maskin
De molekylære anstand HSP70 og Hsp40 ble oppdaget
