Abstract
Kreftceller har et høyt jernbehov og mange eksperimentelle studier, samt klinisk studier har vist at jernbindende er potensielle anti-kreft agenter. Liganden, 2-benzoylpyridine 4-etyl-3-thiosemicarbazone (Bp4eT), demonstrerer både potente anti-neoplastiske og anti-retrovirale egenskaper. I denne studien ble Bp4eT og dens nylig identifisert amidrazone og semikarbazon metabolitter undersøkt og sammenlignet med hensyn til deres anti-proliferativ aktivitet mot kreftceller (HL-60 human promyelocytisk leukemi, MCF-7 human bryst adenokarsinom, HCT116 human colon carcinoma og A549 humane lunge adenokarsinom), ikke-kreftceller (H9c2 neonatal rotte-avledet cardiomyoblasts og 3T3 mus embryo fibroblaster) og deres samspill med intracellulære jern bassenger. Bp4eT ble vist å være en svært potent og selektiv anti-neoplastisk middel som induserer S-fasen cellesyklus-stans, mitokondrie depolarisering og apoptose i MCF-7-celler. Både semikarbazon og amidrazone metabolitter viste minst en 300-gangers reduksjon i cytotoksisk aktivitet enn Bp4eT mot både kreft og normale cellelinjer. Metabolittene også mistet evnen til å:
(1)
fremme redoks sykling av jern;
(2)
binde og mobilisere jern fra labile intracellulære bassenger; og
(3)
forhindre
59Fe opptak fra
59Fe-merket transferrin av MCF-7 celler. Følgelig må denne studien viser at den meget aktive ligand, Bp4eT, metaboliseres til ikke-toksiske og farmakologisk inaktive analoger, som mest sannsynlig bidrar til den gunstige farmakologiske profil. Disse funnene er viktig for den videre utviklingen av dette stoffet kandidat og bidra til forståelse av struktur-aktivitetsforhold av disse midlene
Citation. Potůčková E, Roh J, Macháček M, Sahni S, Stariat J, Sestak V, et al. (2015)
In Vitro
Karakterisering av de farmakologiske egenskapene til Anti-Cancer chelator, Bp4eT, og fase I metabolitter. PLoS ONE 10 (10): e0139929. doi: 10,1371 /journal.pone.0139929
Redaktør: Ashley I. Bush, University of Melbourne, AUSTRALIA
mottatt: 1 juni 2015; Godkjent: 19 september 2015; Publisert: 13 oktober 2015
Copyright: © 2015 Potůčková et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Denne studien ble støttet av den tsjekkiske Science Foundation (tilskudd 13-15008S; www.gacr.cz).. D.R.R. takket National Health and Medical Research Council of Australia for en Senior Principal Stipendiat og prosjekttilskudd. DSK satt en NHMRC RD Wright Training Fellowship og prosjektstøtte (www.nhmrc.gov.au)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Jern er en viktig kofaktor for aktiviteten til mange enzymer som er avgjørende for cellulær proliferasjon, inkludert ribonukleotid-reduktase, som katalyserer det hastighetsbegrensende trinn i DNA-syntese [1]. Som kreftceller er generelt mer metabolsk aktive enn deres normale motstykker, de krever større mengder jern [2]. Derfor, målretting jern i kreftceller ved bruk av spesifikke chelatorer er en lovende strategi for utvikling av nye anti-kreftmidler [3]. Den thiosemicarbazone klasse av jernbindende har vist høy anti-neoplastisk effektivitet i både
in vitro Hotell og
in vivo
studier og noen agenter er også i fase I og II kliniske studier [4,5, 6,7].
ligand, 2-benzoylpyridine 4-etyl-3-thiosemicarbazone (Bp4eT, figur 1), ble først syntetisert og karakterisert ved West
et al
. [8]. Det ble senere vist å være en jern-chelator som besatt en lav positiv Fe
3 + /2 + redokspotensial [9], noe som resulterte i dannelsen av toksiske reaktive oksygenarter (ROS), både i oppløsning [9] og i kreftceller [10]. Faktisk, Bp4eT viste høy anti-proliferativ aktivitet mot humane SK-N-MC neuroepithelioma celler med lav toksisitet for normale humane MRC-5 fibroblaster [10]. I tillegg til sin anti-kreft-aktivitet, Bp4eT viste sterk inhibering av HIV-1 transkripsjon med effekt sammenlignbar med den for en klinisk brukte anti-retrovirale middel, roscovitin, og oppviste lav cytotoksisitet i humane T-celle-lymfoblast-liknende cellelinje, CCRF- . CEM [11]
Bp4eT, 2-benzoylpyridine 4-etyl-3-thiosemicarbazone; Bp4eA;
N
3
etyl-
N
en Anmeldelser – [fenyl (pyridin-2-yl) metylen] formamidrazone; Bp4eS, 2-benzoylpyridine 4-ethylsemicarbazone.
Når det gjelder farmakokinetikk ble Bp4eT vist for enkelt å gjennomsyre sammenflytende monolag av Caco-2 celler, med permeabilitet egenskaper som ligner på vanlige oralt administrerte legemidler, noe som indikerer biotilgjengelighet gjennom denne terapeutiske rute [12,13]. Merlot
et al
. viste at det cellulære opptak av
14C-Bp4eT i SK-N-MC-celler neuroepithelioma ble formidlet ved passiv diffusjon og at Fe-Bp4eT komplekset ble sekvestrert i cellene i større grad enn den frie Bp4eT ligand [14,15 ]. Videre studier viste at
14C-merket Bp4eT ble utskilt raskt fra mus
via
urinen og utskilt saktere
via
avføringen, med de viktigste stedene i
14C Bp4eT deponering blir organene i forbindelse med utskillelsen
e
.
g
., galleblære, tynntarm og tykktarm [15].
metabolisme og farmakokinetikk av Bp4eT var videre undersøkt i rotter ved hjelp av en følsom LC-MS-metoden [16,17,18]. Først ble det vist at Bp4eT eksistert som en blanding av to omdannes gjensidig
E Hotell og
Z
isomerer i både vandige media og plasma, mens
Z
formen var dominerende i solid state [16,17,18]. For det andre, Bp4eT ble vist å gjennomgå metabolisme
via
oksidasjon av sin tiokarbonyl delen både
in vitro Hotell og
in vivo
, noe som resulterer i generasjonen av semikarbazonet analog (2- benzoylpyridine 4-ethylsemicarbazone, Bp4eS, fig 1) og amidrazone derivatet (
N
3
-ethyl-
N
1
-[phenyl(pyridin-2-yl)methylene]formamidrazone; Bp4eA, figur 1) [17]. Den amidrazone metabolitten ble ytterligere hydroksylerte
in vivo
, men den spesifikke lokalisering av hydroksylgruppen på fenylringen ikke kunne identifiseres [17].
Bp4eS metabolitten ble detektert som to
E
/
Z
isomerer som var, i motsetning til moderforbindelsen, ikke-innbyrdes omdannbare [18]. Farmakokinetiske undersøkelser avdekket at etter intravenøs administrering av Bp4eT, eksponering av rotter til metabolitten, Bp4eS, var bare mindre i forhold til Bp4eT [18]. Tvert imot, den metabolske omdanning av administrert Bp4eT til Bp4eA metabolitten viste seg å være en viktig biotransformasjon, som eksponeringen var 20% av den for moderforbindelsen [18].
Undersøkelse av de biologiske egenskapene til stoffet metabolitter er et viktig skritt i farmasøytisk utvikling, som metabolittene kan bidra vesentlig til de farmakologiske egenskapene til modersubstansen [19,20] og kan også være av interesse for videre medisiner. Derfor, for å bedre karakter Bp4eT som en lovende medikament kandidat, vi vurderte
in vitro
cytotoksiske aktiviteter Bp4eT seg selv og sine to store metabolitter, Bp4eA og Bp4eS, på fire menneskelige kreftcellelinjer og to ikke-kreft celle linjer. Som jern chelation er en viktig funksjon i virkningsmekanismen til Bp4eT, undersøkte vi muligheten for Bp4eT og dets metabolitter til:
(i)
binde jern fra labile jern basseng (LIP) av kreftceller;
(ii)
å mobilisere mobil
59Fe; og
(iii)
hindre cellulært opptak av
59Fe fra
59Fe
2-transferrin. Evnen hos jernkomplekser av Bp4eT og dets metabolitter for å fremme ROS-dannelse ble også undersøkt ved hjelp av askorbat oksydasjon analysen. Videre er cellesyklusprogresjon og modusen for celledød etter deres eksponering for Bp4eT og dets metabolitter ble også bestemt.
Materialer og metoder
Chemicals
Bp4eT ble syntetisert i henhold til Kalinowski
et al
. [9] og dets metabolitter ble syntetisert som beskrevet av Stariat
et al
. [17,18]. Komponentene for forskjellige buffere og andre kjemikalier (
e
.
g
., Ulike jernsalter) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) eller Penta (Praha, Tsjekkia Republic) og var av høyeste farmasøytiske eller analytisk kvalitet tilgjengelig
Cell kultur
den menneskelige MCF-7 bryst adenokarsinom cellelinje ble kjøpt fra det europeiske Innsamling av cellekulturer (ECACC;. Salisbury, UK). Humane HL-60 promyelocytisk leukemiceller, humane HCT116 kolorektale carcinom-celler, humane A549 lunge adenokarsinomceller, ble det H9c2-cellelinjen, avledet fra embryonisk rotte hjertevev, og 3T3 museembryo fibroblaster erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). MCF-7, HCT116, A549, 3T3 og H9c2 celletyper ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Lonza, Basel, Sveits). I tilfelle av MCF-7-celler, ble brukt DMEM uten fenolrødt. DMEM supplert med 10% (v /v) varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS; Lonza), 1% penicillin /streptomycin løsning (Lonza) og 10 mM HEPES-buffer (pH 7,0-7,6; Sigma-Aldrich). HL-60-cellelinjen ble opprettholdt i RPMI-medium (Sigma-Aldrich) supplert med 10% varme-inaktivert FBS, og 1% penicillin /streptomycin-løsning. Alle cellelinjer ble dyrket i 75 cm
2 vevskulturflasker (TPP, Trasadingen, Sveits) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Sub-konfluente heftende celler, eller suspensjon av HL-60 celler, var sub-dyrket hver 3-4 dager.
Cytotoksisitetsdata studier
For cytotoksisitetstester eksperimenter, kreft celler ble sådd i en tetthet 5000 (MCF-7), 10000 (HL-60) eller 2000 celler /brønn (HCT116 og A549) i 96-brønners plater (TPP) i 24 h /37 ° C før tilsetningen av undersøkte midler. De ikke-kreft-celler, 3T3 og H9c2-celler, ble dyrket i 24 h /37 ° C i 96-brønners plater i en tetthet på 10.000 celler /brønn, ble mediet deretter endret til serum-og pyruvat-fri DMEM (Sigma- Aldrich) og inkubert med cellene i ytterligere 24 timer /37 ° C. De cytotoksiske virkninger av Bp4eT og dens metabolitter ble undersøkt ved forskjellige konsentrasjoner etter 72 h /37 ° C inkubasjon. For å lette oppløsningen av de lipofile ligander, 0,1% dimetylsulfoksyd (v /v) (DMSO, Sigma-Aldrich) var til stede i dyrkningsmediet til alle grupper. Ved denne konsentrasjonen, DMSO hadde ingen effekt på cellulær proliferasjon eller levedyktighet.
Levedyktigheten til cellene ble bestemt ved bruk av et MTT-assay (Sigma-Aldrich) i henhold til tidligere etablerte metoder [21,22]. Den optiske tetthet av oppløselig MTT ble målt ved λ = 570 nm, å subtrahere λ = 690 nm bakgrunn ved anvendelse av en Tecan Infinite 200M plateleser (Tecan Group, Männedorf, Sveits). Levedyktigheten eller proliferasjon av forsøksgruppene ble uttrykt som en prosent av de ubehandlede kontroller (100%).
Calcein-AM assay for vurdering av frekvensen av cellemembrangjennomtrengning, og adgang til den labile jern bassenget
Disse eksperimentene ble utført i henhold til Glickstein
et al
. [23] med små modifikasjoner. MCF-7-celler ble sådd ut i 96-brønners plater (10,000 celler /brønn) og tillates å følge i 24 timer /37 ° C. Celler ble lastet med jern ved bruk av mobil jern donor, jern-III-ammoniumcitrat (530 ug /ml) [24], 24 timer før eksperimentet, og deretter vasket. For å forhindre eventuelle forstyrrelser, spesielt med hensyn til ulike sporstoffer, ble mediet erstattet med ADS buffer (utarbeidet etter Millipore vann supplert med 116 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1 mM CaCl
2, 1,2 mM MgSO
4 , 1,13 mM NaH
2PO
4, 5 mM D-glukose og 20 mM HEPES, pH 7,4). Cellene ble så ladet med 2 uM av cellen gjennomtrengelige calcein grønn acetoksymetylester (kalsein-AM; Molecular Probes, Oregon, USA) for 30 min /37 ° C og vasket. Cellular esteraser spalte acetoksymetyl-grupper for å danne cellemembran-ugjennomtrengelig forbindelse, Calcein grønn [23]. Fluorescensen av calcein grønn bråkjøles ved binding jern [23]. Det intracellulære fluorescens (λ
ex = 488 nm; λ
em = 530 nm) av calcein grønn ble deretter fulgt som en funksjon av tid (10 min etter tilsetningen av 10 uM Bp4eT eller dets metabolitter) ved 37 ° C med Tecan Infinite 200M plateleser. Jernet chelation effekten av metabolitter i celler ble uttrykt som en prosentandel av effekten av den overordnede chelator, Bp4eT (100%).
Utarbeidelse av
59Fe
2-transferrin
Menneskelig transferrin (Sigma) ble merket med
56Fe eller
59Fe (PerkinElmer, Massachusetts, USA) for å produsere
56Fe
2-transferrin eller
59Fe
2-transferrin (
59Fe
2-Tf), henholdsvis, med en endelig spesifikk aktivitet på 500 pCi /pmol Fe, som tidligere beskrevet [24,25]. Ubundet
59Fe ble fjernet ved grundig vakuum dialyse mot et stort overskudd av 0,15 M NaCl bufret til pH 7,4 med 1,4% NaHCO
3 ved hjelp av standardmetoder [24,25].
Effekten av Bp4eT og dets metabolitter på å mobilisere mobil
59Fe.
for å undersøke muligheten for studert forbindelser for å mobilisere mobil
59Fe fra MCF-7 celler, jern efflux eksperimenter ble utført ved hjelp av etablerte teknikker [21,22] . I korte trekk, etter pre-merking sammenflytende MCF-7 celler på 6-brønners plater med 0,75 pM
59Fe
2-Tf i 3 timer /37 ° C ble cellene vasket fire ganger med iskald PBS og så deretter inkubert med 25 pM av Bp4eT eller dets metabolitter i 3 h /37 ° C. Den overliggende medium inneholdende utgitt
59Fe ble deretter dekantert fra cellene. Radioaktivitet ble målt både i celler og supernatant ved anvendelse av en γ-scintillasjonsteller (Wallac Wizard 3, Turku, Finland).
Effekten av den undersøkte midler for å forebygge celle
59Fe opptak fra
59Fe
2-transferrin.
evnen som chelatorer for å forhindre cellulær
59Fe opptak fra
59Fe
2-transferrin ble undersøkt ved bruk av standard teknikker [26,27]. I korte trekk, ble sammenflytende MCF-7-celler i 6-brønns plater inkuberes med 0,75 uM
59Fe
2-Tf i 3 timer /37 ° C, i nærvær av Bp4eT eller dens metabolitter (25 uM). Cellene ble deretter vasket fire ganger med iskald PBS og nivået av internalisert
59Fe ble bestemt ved inkubering av cellemonolaget i 30 minutter /4 ° C med den generelle protease, pronase (1 mg /ml, Sigma-Aldrich ). Cellene ble deretter fjernet fra monolaget med en plast spatel på is og sentrifugert i 1 min /12,000 x
g
/4 ° C. Supernatanten representerer membranbundet, Pronase følsomme
59Fe som ble utgitt av protease, mens Pronase-insensitive brøkdel representerer internalisert
59Fe [21,26,27]. Mengden av internalisert
59Fe ble uttrykt som en prosentandel av
59Fe internalisert av kontroll (ubehandlet) celler.
Askorbat oksidasjon analysen
askorbat oksidasjon analysen ble brukt til å vurdere redoks-aktivitet av jernkompleksene av chelatorer ved anvendelse av en etablert protokoll [26,28]. I korte trekk, ble 100 mM askorbinsyre fremstilt umiddelbart før eksperimentet og inkubert enten alene eller i nærvær av 10 uM FeCl ^
3 i et 50 gangers molart overskudd (500 uM) av citrat og chelatorer. Kelatorer ble analysert ved jernbindende ekvivalenter (IBE) på 0,1 (overskudd av jern), 1 (fullt koordinerte jern-chelaterende komplekser) og 3 (overskudd av fri chelator). Nedgangen i absorbans ved λ = 265 nm ble målt etter en 10 og 40 min inkubasjon ved romtemperatur ved hjelp av Tecan Infinite 200M plateleser. Nedgangen av absorbans mellom de to tidspunktene ble beregnet og uttrykt som en prosentandel av kontroll uten chelator.
Cell syklus analyse
For å undersøke effekten av agentene på cellesyklus, MCF -7-celler ble sådd ut i 60 mm petriskåler ved en tetthet på 240 000 celler /skål og inkubert med Bp4eT eller dets metabolitter i 72 timer /37 ° C. Cellene ble deretter høstet, fiksert med etanol og farget med propidiumjodid (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) for 30 min /37 ° C, som tidligere beskrevet [29]. Celler ble analysert ved hjelp Accuri C6 strømningscytometer (Becton Dickinson and Company, San Jose, CA USA). Propidiumjodid- var spent på λ
ex = 488 nm og fluorescens analysert ved λ
em = 585 nm (FL-2) med en total på 10.000 hendelser innsamlet per analyse.
fluorescens mikroskopi vurderinger
Markører som brukes til å vurdere autofagi /apoptose /nekrose i MCF-7-celler og endringer av lysosomale og mitokondriell morfologi ble observert ved bruk av et Eclipse Ti invertert epifluorescens mikroskop (Nikon, Tokyo, Japan), som var utstyrt med en avkjølt digitalt kameraet ZYLA 5.5 sCMOS (Andor Technology, Belfast, UK), og NIS-Elements C 4.1 programvare (Laboratory Imaging, Praha, Tsjekkia). MCF-7-celler ble sådd ut i 6-brønns plater med dekkglass i bunnen ved en tetthet på 150.000 celler /brønn og inkubert som beskrevet ovenfor, i nærvær eller fravær av 10 eller 100 nM Bp4eT.
vurdere mekanismen av cellulær død etter inkubasjon med Bp4eT, trippel farging med monodansyl cadaverine (MDC, 50 M, λ
ex = 390 nm; λ
em = 455 nm; Sigma-Aldrich), annexin V-FITC ( 5 mL /ml, λ
ex = 495 nm; λ
em = 519 nm; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), og propidiumjodid (5 mikrogram /ml, λ
ex = 560 nm; λ
em = 630 nm) ble anvendt. MDC er en markør for autophagosomes og lysosomer og resultater i blå fluorescens [30,31]. Som en positiv kontroll for autophagy, ble MCF-7 celler inkubert med 1 nM rapamycin (Sigma-Aldrich) i 30 min /37 ° C, som er en etablert induserer autophagy [30]. Annexin V har høy affinitet for fosfatidylserin, som blir translokert til overflaten av både i tidlig og sene stadier av apoptotiske celler [32,33]. Dermed annexin V-FITC fungerte som en markør for apoptose når de apoptotiske celler hadde grønne fluorescerende cytoplasma membraner. Propidiumjodid er en nekrotisk markør eller en markør for sent stadium apoptose, da den ikke trenge inn i celler med intakt cytoplasmiske membraner [34]. Cellene ble inkubert med disse probene for 10 min /37 ° C, vasket med frisk dyrkingsmedium og bilder tatt med mikroskop skissert ovenfor.
For å bestemme effekten av Bp4eT på mitokondriell morfologi, ble cellene inkubert med MitoTracker
® Grønn FM (0,25 mikrometer; λ
ex = 490 nm; λ
em = 516 nm; molekylære prober) for 10 min /37 ° C. Cellene ble deretter vasket med friskt medium, og de bilder som er tatt ved hjelp av mikroskopet som er beskrevet ovenfor.
Western blot-analyse
Etablerte fremgangsmåtene ble anvendt for fremstilling av cellelysater og utføre immunoblotanalyse [35]. Primære antistoffer som brukes er: kanin LC3 (Cat #: MBPM036; 1:. 2000) fra Abacus (Brisbane, Australia) og muse β-aktin fra Sigma-Aldrich (Cat #:: A1978, en 10.000.). Følgende sekundære antistoffer ble benyttet: pepperrot (HRP) konjugert anti-kanin (Cat #:. A6154, 1: 1,0000) og anti-mus (. Cat #: A4416, 1: 10.000) antistoffer fra Sigma-Aldrich . For å sikre lik belastning av proteiner, ble membraner undersøkt for β-aktin.
caspase aktivitet vurderinger
For å vurdere effekten av forbindelsene på caspase aktivitet, MCF-7 celler ble inkubert med 100 nM Bp4eT eller dens metabolitter for 3, 24 eller 72 h /37 ° C i 96-brønners plater som beskrevet ovenfor. Cellene ble deretter lysert ved tilsetning av 100 ul kald lyseringsbuffer (100 mM HEPES, 10 mM CHAPS, 10 mM D-L-ditiotreitol, pH 7,4) til 100 ul medium i hver brønn. Lysater ble umiddelbart frosset ved -80 ° C. Tinte lysater ble brukt for å vurdere caspase aktivitet ved hjelp lysende kits for caspases 3/7, 8 og 9 (Promega, Madison, WI, USA). Luminescensen ble målt ved bruk av Tecan Infinite 200M plateleser. Kaspase-aktivitet i forsøksgrupper ble korrigert i henhold til den cellulære levedyktigheten til hver gruppe og uttrykt som en prosent av aktiviteten av den ubehandlede kontroll (100%).
Data-analyse og statistikk
SigmaStat for Windows 3.5 (Systat Software, San Jose, CA, USA) statistisk programvare pakken ble benyttet for å analysere resultatene. Dataene er uttrykt som gjennomsnittet ± SD av et gitt antall forsøk. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av en enveis ANOVA med Bonferroni
post-hoc
test eller Student
t
-test. Resultatene ble ansett for å være statistisk signifikant når
p
0,05. IC
50 verdier ble beregnet ved hjelp CalcuSyn 2.0-programvaren (Biosoft, Cambridge, UK). Cellesyklus analyse ble evaluert ved hjelp av multicycle AV programvare (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, USA).
Diskusjon
Resultater og Bp4eT metaboliseres til forbindelser med minst 300 ganger reduksjon i cytotoksisitet mot både kreft og ikke-kreftceller
Den cytotoksiske aktivitet av Bp4eT ble sammenlignet med Bp4eA (brukt som en blanding av
E
og
Z
isomerer) og Bp4eS (i to isomere former:
E-
Bp4eS og
Z-
Bp4eS).
E Hotell og
Z
isomerer av Bp4eS ble undersøkt hver for seg, som de var begge oppdaget
in vivo
i tidligere studier [18], og dermed er biologisk betydning. Men disse to isomerer er ikke omdannes gjensidig og er separate forbindelser som kan isoleres og analyseres [18]. I kontrast, Bp4eA interconverts lett mellom
E Hotell og
Z
isomere tilstander [18], og på grunn av denne iboende fysisk eiendom, kun blandingen av disse isomerer kan vurderes. I disse studiene, ble effekten av midlene på kreftceller studert ved bruk av human HL-60 promyelocytisk leukemi, human MCF-7 bryst adenokarsinom, human HCT116 kolorektal karsinom og humane A549 lunge adenokarsinom-cellelinjer, så vel som to ikke-kreft celle- typer, nemlig rotte H9c2 cardiomyoblasts og mus 3T3 fibroblaster.
Etter en 72 timers inkubasjon, modersubstansen, Bp4eT, viste svært potente cytotoksiske effekter mot HL-60, MCF-7 og HCT116 cellene, der IC
50-verdier varierte fra 3 til 15 nM (tabell 1 og figur 2A). Den anti-kreft-aktivitet av Bp4eT mot disse cellelinjene var markant større enn den til de andre klinisk brukte chelatorer, deferoksamin eller deferasiroks, som har IC
50 verdier i uM område mot kreftceller [9,36,37,38] . IC
50 Verdien av Bp4eT mot A549 celler var moderat (IC
50 = 0,593 ± 0,148 mm) og var sammenlignbare med de cytotoksiske effektene av Bp4eT mot H9c2 cardiomyoblasts (IC
50 = 0,524 ± 0,157 mikrometer; tabell 1). IC
50 Verdien av Bp4eT mot 3T3 fibroblast celler (IC
50 = 1,309 ± 0,337 mikrometer, Tabell 1) var to ganger større enn det som er observert med H9c2 celler. Faktisk, 3T3 fibroblaster var de mest motstandsdyktige av alle celletypene i hver agent undersøkt. Videre cytotoksisitet av Bp4eT mot 3T3 fibroblast celler var lik den som ble observert tidligere mot menneskelige MRC-5 fibroblast celler, med IC
50 verdier som varierer fra 0,7 til . 6 mikrometer [9,10,39]
for bestemmelse av anti-proliferativ aktivitet, kreft cellelinjer (
i
.
e
., HL-60, MCF-7, HCT116 og A549) og ikke -cancer cellelinjer (
i
.
e
., H9c2 og 3T3) ble inkubert med agenter i 72 timer /37 ° C og spredning deretter vurdert ved anvendelse av MTT-analysen. Resultatene er gjennomsnitt ± SD (
n
≥ 4 forsøk).
Den terapeutiske indeksen ble beregnet ved å dividere IC
50 i normale celler ved IC
50 erholdt i neoplastiske celler, og denne indeksen fungerte som et mål på selektiviteten av middel mot kreftceller (tabell 2). Viktigere, de terapeutiske indekser av Bp4eT mot HL-60, MCF-7 og HCT116 kreftceller var høy (34,9 til 436,3, tabell 2), noe som indikerer selektivitet Bp4eT mot disse krefttypene. Dette er i samsvar med tidligere studier som viser at potent og selektiv anti-neoplastisk aktivitet Bp4eT [9,40]. Som beskrevet ovenfor, er selektiviteten av Bp4eT mot A549-celler var lav, noe som resulterer i terapeutiske indekser fra 0,9 til 2,2 (tabell 2).
Bp4eT metabolitter viste en markert reduksjon i cytotoksisitet mot både kreft og ikke- -cancerous cellelinjer (tabell 1 og figur 2) og deres IC
50 verdier var 300 ganger høyere i forhold til den overordnede agent. Den amidrazone, Bp4eA, som ble identifisert som den viktigste metabolitt av Bp4eT [18], var generelt mer cytotoksisk mot kreftceller (med unntak av HCT116-celler) enn den semikarbazon metabolitten, Bp4eS. IC
50 verdier av Bp4eA mot kreftceller varierte fra 52 til 207 um (tabell 1). I tillegg cytotoksisiteten til Bp4eA mot ikke-kreftceller var lavere i forhold til de kreftceller som ble undersøkt, med IC
50 verdier på 416,1 ± 122,1 uM og 1027,4 ± 203,9 uM for H9c2 og 3T3-celler, respektivt. Dette ble også gjenspeiles i de terapeutiske indekser av Bp4eA, som varierte 2,0 til 19,7 (tabell 2). Viktigere, giftige konsentrasjoner av Bp4eA mot normale celler ble ikke nådd i plasma under vår forrige farmakokinetisk studie, hvor den høyeste konsentrasjonen av Bp4eA nådd var 1 mikrometer etter 300 minutter etter
i
.
v
. administrasjon av Bp4eT [18]. Dette tyder klart på at Bp4eA nivåer i plasma var på ikke-giftige konsentrasjoner.
Både ikke-omdannes gjensidig
E Hotell og
Z
isomerer av Bp4eS metabolitten ble tidligere identifisert på lave konsentrasjoner ( 0,02 mm) i plasma [18]. Våre resultater viser at Bp4eS generelt hatt dårligere anti-proliferativ aktivitet enn Bp4eA (tabell 1 og figur 2), med IC
50-verdier varierer mellom 46 til 536 mikrometer i kreftceller og 343 mikrometer og 1 mm i ikke-kreft H9c2 og 3T3-celler, respektivt. Overraskende viste hver cellelinje forskjellig sensitivitet til
E Hotell og
Z
isomerer av Bp4eS. Selv om HL-60 og H9c2 celler var signifikant (
p
0,001) mer følsom for
Z
isomer, HCT116 og A549 celler var signifikant (
p
0.01) mer følsom for
E
isomeren av Bp4eS (tabell 1). I kontrast, MCF-7 celler var tilnærmet like følsomme for både
E Hotell og
Z
isomerer av Bp4eS (tabell 1). I forhold til Bp4eT, de terapeutiske indekser av
E Hotell og
Z
isomerer av Bp4eS var generelt lav, spesielt mot H9c2 celler og varierte fra 0,6 til 21,6 (tabell 2). Som
E Hotell og
Z
isomerer av Bp4eS ble bare påvist ved svært lave konsentrasjoner i plasma [18], og siden deres cytotoksiske effekter oppstår kun ved høye konsentrasjoner, kan det bli foreslått at Bp4eS ville vise lav anti-proliferativ aktivitet mot kreftceller og giftighet for normale celler
in vivo
.
evnen Bp4eT metabolitter å chelatere jern fra labile jern basseng, mobilisere mobil
59Fe og forhindre mobilnettet
59Fe opptak fra
59Fe
2-transferrin er ubetydelig i forhold til Bp4eT
evnen Bp4eT og dets metabolitter til kelatere jern fra LIP i MCF-7 celler ble undersøkt i denne undersøkelse ved hjelp av kalsein-AM-analyse, som jern-chelaterende og uttømming antas å spille en rolle i anti-kreft-aktivitet av de thiosemicarbazones [3,9]. Stamforbindelsen, Bp4eT (10 uM), viste en tidsavhengig økning i fluorescens, på grunn av evnen til Bp4eT til å chelatere jern fra kalsein-AM i MCF-7-celler (figur 3A). I motsetning til dette, tilsetningen av de Bp4eT metabolittene hadde nesten ingen virkning på kalsein-AM fluorescens (figur 3A). Når uttrykt som en prosentandel av Bp4eT fluorescens ved
t
= 600 s, metabolitten, Bp4eA, viste bare 5,9% av chelatering effekt av Bp4eT, mens begge isomerer av Bp4eS viste ≤1.0% av fluorescensen av Bp4eT (fig 3B).
effekten av Bp4eT eller dens metabolitter for å chelatere jern fra leppen av MCF-7-celler ble målt ved hjelp av kalsein-AM-analyse. (A) Fluorescens av fri calcein etter tilsetning av 10 uM Bp4eT eller dens metabolitter for 10 min /37 ° C. (B) intensitet av fluorescens av fri calcein i nærvær av metabolitter på
t
= 600 s ble uttrykt som en prosentandel av fluorescensen av fri calcein i nærvær av Bp4eT. Resultatene av (A) og (B) er gjennomsnitt ± SD (
n
= 6 eksperimenter). Statistisk signifikans (ANOVA): ***
p
0.001 sammenlignet med Bp4eT. (C) effluks av
59Fe mediert av kontrollmedium eller et medium inneholdende midler (25 uM) etter en 3 timer /37 ° C inkubering av MCF-7-celler med prelabeled
59Fe-transferrin. (D) Opptak av
59Fe fra
59Fe
2-transferrin av MCF-7-celler i nærvær av kontrollmedium eller et medium inneholdende midler (25 uM) ble bestemt etter 3 timer /37 ° C inkubasjon. Resultatene av (C) og (D) er gjennomsnitt ± SD (
n
≥ tre forsøk). Statistisk signifikans (ANOVA): ***
p
0,001 sammenlignet med kontroll (ubehandlet) gruppe. (E) Den askorbat oksydasjon analyse ble anvendt for å undersøke dannelsen av redox-aktive komplekser. Bp4eT og dets metabolitter ble analysert ved jernbinding ekvivalenter (IBE) på 0,1 (overskudd av jern til chelator); 1 (helt komplett koordinering shell); og 3 (overkant av chelator å stryke). De chelatorer DFO og EDTA, ble anvendt som anti-oksyderende eller pro-oksidative kontroller, respektivt. Data er uttrykt som en prosent av kontrollgruppen uten chelator på samme IBE (100%). Resultatene av (E) er gjennomsnitt ± SD (
n
≥ 3) eksperimenter. Statistisk signifikans (ANOVA): ***
p
0,001 sammenlignet med kontrollgruppen (jern med askorbat) i det samme IBE. (F) MCF-7-celler ble inkubert i 72 h /37 ° C med 100 nM av Bp4eT eller dets metabolitter, Bp4eA og Bp4eS. Cellesyklusanalyse ble behandlet ved strømningscytometri ved bruk av propidiumjodid. Fase kvantifisering ble evaluert ved hjelp av multicycle AV Software. Resultatene av (F) er gjennomsnitt ± SD (
n
≥ 3 forsøk). Statistisk signifikans (ANOVA): *
p
0,05, **
p
0.01, ***
p
0.001 sammenlignet med kontrollgruppen.
Videre Bp4eT demonstrert høy
59Fe mobilisering effekt og var i stand til å formidle utgivelsen av 46,4% av total cellular
59Fe (Fig 3C). Ingen av Bp4eT metabolitter resulterte i en betydelig frigjøring av celle
59Fe og var sammenlignbare med den ubehandlede kontroll (3,5% av total
59Fe, fig 3C).
Evnen Bp4eT og dets metabolitter for å hindre at det cellulære opptak av
59Fe fra
59Fe
2-transferrin etter 3 timer /37 ° C inkubering ble også undersøkt i MCF-7-celler. Viktigere, den overordnede chelator, Bp4eT, vist høy
59Fe chelatering effekt og inhiberte internalisert
59Fe opptaket til 11,5% av kontroll (figur 3D). Som observert i
59Fe utstrømming analysen, både Bp4eA og Bp4eS viste dårlig
59Fe chelation effekt og deres evne til å hemme
59Fe opptaket ble sammenlignes med ubehandlet kontroll (Fig 3D).
*
p
