Abstract
Bakgrunn
heparansulfat proteoglykaner (HSPGs) er kontrollelementene i wnt signalering, som binder til ekstracellulært wnt ligander og regulere deres evne til å interagere med signaloverførings reseptorer på celleoverflaten. SULF-1 og SULF-2 er romanen ekstracellulære sulfatases som virker på intern glukosamin-6-sulfat (6S) modifikasjoner innen HSPGs og dermed modulerer HSPG interaksjoner med ulike signalmolekyler, inkludert Wnt ligander. Emerging bevis indikerer viktigheten av reaktivert Wnt signal i en rekke kreftformer, inkludert bukspyttkjertelen adenokarsinom.
Prinsipp Funn
Begge SULF proteiner ble oppregulert i menneskelige bukspyttkjertelen adenokarsinom svulster og ble grovt uttrykt i menneskelig bukspyttkjertelen adenocarcinoma cellelinjer. Uttrykk for menneske ekstracellulære sulfatases SULF-1 og SULF-2 forbedret Wnt signal i et rekonstituert system. Tre av fire i bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer testet utstilt autokrint Wnt signal, ved at ekstracellulære Wnt ligander ble pålagt å iverksette nedstrøms Wnt signalering. Eksponering av disse bukspyttkjertelen adenokarsinomceller til en katalytisk inaktiv form av SULF-2 eller siRNA-mediert stanse av endogen SULF-2 inhiberte både Wnt signalering og cellevekst. SULF-2 stanse i to av disse linjene resulterte i betydelig redusert tumordannelse hos immunsupprimerte mus.
Konklusjon /Betydning
Vi har identifisert Sulfs som forsterkere av autokrint Wnt signal i kreft i bukspyttkjertelen celler og har demonstrert deres bidrag til vekst og tumorgenisiteten av disse cellene. Siden Sulfs er ekstracellulære enzymer, ville de være attraktive mål for terapi av kreft i bukspyttkjertelen. Våre resultater i strid med den rådende oppfatning i litteraturen at Sulfs er negative regulatorer av tumorigenesis
Citation. Nawroth R, van Zante A, Cervantes S, McManus M, Hebrok M, Rosen SD (2007) ekstracellulær Sulfatases, Elementer av Wnt signalveien, Positively Regulere Vekst og tumorgenisiteten av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 2 (4): e392. doi: 10,1371 /journal.pone.0000392
Academic Redaktør: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, Inc., USA
mottatt: 18 mars 2007; Akseptert: 28. mars, 2007; Publisert: 25 april 2007
Copyright: © 2007 Nawroth et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen ble støttet av en Susan Komen Breast Cancer Foundation Grant PDF0402844 (RN og SDR), den tyske Research Foundation Grant NA439 /1-1 (RN), Ministerio de Educación, Cultura y Deporte av den spanske regjeringen (SC) og National Institute of Health Grants GM57411 (SDR), CA122025 (SDR), HL075602 (SDR) og CA112537 (MH). Utarbeidelsen av lentiviruses ble subsidiert av Sandler Lentivirus Kjerne Facility ved UCSF. Sponsorene hadde ingen rolle i utformingen og gjennomføringen av studien, i innsamling, analyse og tolkning av data, og i forberedelse, vurdering, eller godkjenning av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
bukspyttkjertelen adenokarsinom er den vanligste formen for kreft i bukspyttkjertelen, og en av de mest dødelige kreftformer med en fem års overlevelse på 3% og en median overlevelse på mindre enn 6 måneder [1]. Det har vært de siste interesse i rollen som embryonale signalveier i kreft. Betydelige bevis har vist at disse reaksjonsveier forblir funksjonell i et begrenset antall celler i den voksne, og at dysregulering av disse baner bidrar til dannelsen og utholdenhet av tumorer [2], [3]. I denne forbindelse, reaktivering av Notch, har Hedgehog og Wnt trasé tilt fersk interesse i kreft i mage-tarmkanalen, inkludert bukspyttkjertelen adenokarsinom [2], [4], [5].
Den feilregulering av Wnt signal i bukspyttkjertelen adenokarsinom er i fokus i denne studien. Wnts utgjør en stor familie av utskilte proteiner som regulerer cellevekst, apoptose, differensiering og motilitet under embryonal utvikling [3]. I korte trekk, blir aktivering av den kanoniske Wnt veien initiert ved binding av ligander til wnt signaltransduksjon reseptorer på celleoverflaten, noe som fører til opphopning av ikke-fosforylert β-catenin i cytoplasma. Etter sin translokasjon til kjernen, danner β-catenin et kompleks med medlemmer av TCF /LEF familie av transkripsjonsfaktorer, og aktiverer målgener [3].
Wnt signal ble først involvert i kreft gjennom analyse av melkekjertler tumorigenesis indusert av musebrysttumorvirus (MMTV) [6]. En stor andel av de tumorene var på grunn av aktivering av Wnt1 uttrykk gjennom innsetting av MMTV provirus inn i
wnt1
genet. Tumorigenesis er tenkt å være basert på en autokrint Wnt forvandlende sti der Wnt ligand uttrykk av mammary epitelceller gir en vekst stimulans til de samme cellene. Nylig autokrin Wnt signal ble demonstrert i brystkreft, eggstokk-kreft og myelom-cellelinjer, [7], [8]. Denne mekanisme, der ekstracellulære wnt ligander tilveiebringe en viktig stimulus for celleproliferasjon, er forskjellig fra det som vanligvis finnes i human tykktarmskreft og flere andre former for kreft, hvori konstitutiv aktivering av Wnt signalering er et resultat av mutasjoner i nedstrøms cytoplasmatiske elementer slike som
APC, CTNN1 plakater (koding β-catenin) eller
AXIN2 product: [3].
Disse karakteristiske mutasjoner i nedstrøms Wnt signalmolekyler er svært sjeldne i bukspyttkjertelen adenokarsinom [9 ]. Likevel, avvikende aktivering av Wnt signal er et vesentlig trekk ved menneskelig bukspyttkjertelen adenokarsinom, som avslørt av den kjernefysiske lokalisering av β-catenin i en betydelig andel (30-65%) av svulster [9], [10]. I samsvar med den histokjemisk bevis har biokjemiske analyser etablert en markert økning i total β-catenin og dens økte nukleære lokaliserings i to tredjedeler av pankreas adenokarsinomer [9]. Videre, i mekanistiske undersøkelser med pankreas adenokarsinom-cellelinjer, inhibering av Wnt signalering resulterte i redusert celleproliferasjon og overlevelse in vitro [11].
Et område av aktuell interesse er de ekstracellulære regulatoriske elementer i Wnt signalveien. Blant disse er utskilt Wnt antagonister som frizzled relaterte proteiner (sFRP), Wnt hemmende faktor (WIF) og Dickkopf familie (DKK) [12]. Nedregulering av noen av disse antagonister initierer Wnt aktivering og bidrar til flere former for kreft [12]. En klasse av ekstracellulære proteiner som positivt regulerer Wnt aktivitet er heparansulfat proteoglykaner (HSPGs). Glypicans, for eksempel, er nødvendig for Wnt signalisering i løpet av utvikling i Drosophila og virveldyr [13]. HSPGs er også nødvendig i eksempler på Wnt avhengig tumordannelse [14], [15]. De mange funksjoner av HSPGs i vekst og differensiering av celler [16] blir mediert gjennom deres evne til å binde til et mangfoldig repertoar av vekstfaktorer og morphogens. Binding avhenger av sulfate mønster av glukosamin (N, 3-O, og 6-O-stillingene) og uronsyre (2-O-stilling) innenfor de vedlagte heparansulfat kjeder. [16]. 6-O-sulfatering (6S) av glukosamin er av særlig betydning i bindingen av mange viktige ligander til HPSGs, inkludert Wnts [17] – [19]. En nylig satte pris mekanisme for å regulere signalering av disse ligandene er ved post-syntetiske «redigering» av 6S mønster av HSPGs gjennom virkningen av en klasse av ekstracellulære sulfatases kjent som Sulfs [20].
QSulf-1 , den første medlem av familien SULF som skal beskrives, ble påvist i en analyse av muskelutvikling i vaktel embryo [20]. Dette ble etterfulgt av en beskrivelse av dens orthologues i rotte [21], mus og human [22] og oppdagelsen av den nært beslektede homologe, SULF-2 [22]. De Sulfs er nøytrale pH-optimum endosulfatases som fjerner 6-O-sulfat fra interne glukosaminrester i høyt sulfaterte subdomener av heparin /HSPGs [18], [19], [22], [23]. De innledende studier av QSulf-en viste en positiv rolle i regulering av Wnt signal under muskel spesifikasjon i vaktel embryoet [20]. Denne aktiviteten er avhengig av evnen til QSulf-en for å redusere interaksjonen mellom wnt ligander med HSPGs. Forfatterne foreslo en to statlig modell der HS kjeder danner en høy affinitet HS-Wnt komplekset, som sequesters Wnt fra samspill med sine signaltransduksjon reseptorer. Affinitet Wnt for HS svekkes når QSulf-en endrer 6S mønster av HS kjedene, slik at oppstart av Wnt signal [19].
SULF avhengig promotering av Wnt signal har også blitt observert i andre utviklings hendelser [24]. In vitro tyder på at de Sulfs kan fremme andre signalveier inkludert angiogenese og BMP signal [23], [25]. Viktigere,
sulf
null mus viser redusert kroppsmasse [26], [27]. Dette fenotype er i samsvar med positive regulatoriske roller for de Sulfs under normal utvikling.
Oppdagelsen av at kanoniske Wnt signal er aktivert i bukspyttkjertelen adenokarsinom (se ovenfor) har fokusert vår oppmerksomhet på mulige involvering av Sulfs i denne kreft . I denne studien demonstrerer vi oppregulering av både SULF proteiner i bukspyttkjertelen adenokarsinom svulster. Ved hjelp av menneskelige bukspyttkjertelen adenokarsinom kreft cellelinjer, etablerer vi en rolle for SULF-2 for å fremme autokrint Wnt signal, in vitro cellevekst og tumorigenicity. Denne positive bidraget fra en SULF til Wnt-avhengige tumorvekst er i slående kontrast til flere rapporter der håndheves uttrykk for Sulfs fiendskap andre signalveier (f.eks FGF-2, og HGF) i tumorceller og undertrykker cellevekst [28] – [34].
Resultater
SULF-1 og SULF-2 er oppregulert i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen
Bryting av offentlige DNA microarray datasett og en kvantitativ PCR studie fastslå at
SULF1
transkripsjoner er oppregulert i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen (tabell 1). Sistnevnte undersøkelse fant at den gjennomsnittlige grad av
SULF1
mRNA var 22,5 ganger større i kreftvevet (n = 31) enn i normal pankreas (n = 19) [31].
In situ
hybridisering lokalisert uttrykk for
SULF1
å rørformede strukturer, sannsynligvis representerer invasivt karsinom.
For å finne ut om SULF proteinene ble uttrykt av bukspyttkjertelen adenokarsinom i kirurgiske prøver , farget vi seksjoner fra syv arkiv tilfeller med SULF-1 og SULF-2-antistoffer og et IgG-kontroll (figur 1 A og B). Godartede interlobular kanaler på de samme vevsdelene som invasivt karsinom fungert som en intern kontroll. I 7/7 tilfeller, ondartede epitelceller generelt viste moderat til sterk farging for SULF-1 (figur 1B). For SULF-2, 4/7 tilfeller viste sterk farging av disse cellene, 2/7 tilfeller hadde moderat farging og ett tilfelle var negativ. De fleste godartede kanaler viste ingen flekker eller bare spor farging av SULF-1 (≈54%) eller SULF-2 (≈88%). Focal farging for SULF-en eller SULF-2 ble sett i et mindretall av godartede kanaler. Diffuse svak farging av fibroblaster for både Sulfs ble observert i enkelte områder av stroma, vanligvis i forbindelse med betennelsesceller. Det var ingen flekker med IgG kontroll
A:. Representative serie deler av bukspyttkjertelen adenokarsinom ble farget med SULF-1, SULF-2 og kontroll IgG. Godartede kanaler ble sammenlignet med områder av invasiv kreft på den samme delen. B: Kvantitativ tabulation SULF immunhistokjemi resultater i bukspyttkjertelen adenokarsinom tilfeller (0 = ingen eller spor farging, 1 = moderat farging, 2 = sterk farging, ND = ikke bestemt). C: RNA ble isolert fra 24 adenokarsinom cellelinjer, ble cDNA forberedt, og utsatt for PCR med primere for
SULF1 Hotell og
SULF2 Hotell og β-
ACTIN
som lasting kontroll . D: immunoblot ble utført på cellelysatene og kondisjonert medium (CM) ved anvendelse av antistoffer mot SULF-1 (øvre panel) og SULF-2 (midtre og nedre panel). Bare SULF-2-proteinet ble påvist i CM.
Deretter bestemmes vi ekspresjon av de Sulfs i humane pankreas adenokarsinom-cellelinjer ved hjelp av RT-PCR for å kartlegge et panel av 24 cellelinjer. Disse ble avledet fra enten primære eller metastatisk bukspyttkjertel adenokarsinomer [5].
SULF1
transkripsjoner ble oppdaget av RT-PCR i 12/24 og
SULF2
transkripsjoner i 21/24 av disse linjene (figur 1C). For å undersøke uttrykk på proteinnivå, undersøkte vi fire av disse cellelinjene, tre av disse var positive for begge
SULF
transkripsjoner (CFPAC-1, HS766T, L3.6sl) og 1 som var positivt for bare
SULF2 plakater (BxPC-3). Vi utførte immunoblotter på detergentlysater og kondisjonert medium (CM) avledet fra disse cellene (figur 1D). SULF-1-protein ble detektert i bare en cellelinje (HS766T celler), mens SULF-2-protein var til stede i alle 4. I detergentlysater, molekylvekten av de større artene var 130 kDa, som tilsvarer en ubehandlet form for både proteiner [22]. SULF-2-protein ble frigjort i CM med alle 4 cellelinjer. I motsetning til dette ble SULF-1 ikke er detektert i HS766T CM. Som tidligere observert i flere brystkreft cellelinjer [25], ble SULF-2 protein påvist i CM som behandlet 75 kDa-komponenten.
SULF-1 og SULF-2 fremme Wnt signale
QSulf-1 har vist seg å fremme aktivering av wnt signalveier som reaksjon på eksogene wnt ligander [20]. Vi valgte å studere effektene av den humane Sulfs på Wnt signalering i et tilsvarende rekonstituert system [20]. Vi overexpressed den Sulfs i HEK 293T og co-cultured disse cellene med fibroblaster som uttrykte enten Wnt1 eller Wnt4. Wnt signaleringsaktiviteten ble målt ved hjelp av TCF-luciferase reporter-system (TOPflash /FOPflash), en standardmetode for å måle β-catenin avhengig transkripsjonen aktivering [20]. Uttrykk for hver SULF utvidet Wnt signal i respons til enten Wnt ligand, mens mock-transfekterte HEK 293T celler ikke svare (tilleggs figur, fig. S1). Dermed kan både HSulfs, som QSulf-1 [20], fremme Wnt signal.
Uttrykk for sFRP-2 hemmer Wnt signal i bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer
Tidligere arbeid har etablert aktiv Wnt signal innenfor en serie av pankreas adenokarsinom-cellelinjer, blant de 4 linjene over [M. Pasca di Magliano og M. Hebrok, upubliserte observasjoner]. For å avgjøre om Wnt signal i disse 4 linjene var autokrint i naturen, ansatt vi skilles frizzled relaterte protein-2 (sFRP-2) som et ekstracellulært Wnt antagonist [35], [36]. Vi transient transfektert cellelinjer med et cDNA for sFRP-2 eller med den tomme vektoren (ctrl) og målt Wnt aktivitet av TCF-luciferase reporter-analyse. sFRP-2 ekspresjon redusert Wnt signale ≈60% i 3 av linjene, men hadde ingen virkning på CFPAC-1 celler (figur 2). Disse resultatene fastslå at BxPC-3, HS766T og L3.6sl celler har en autokrint Wnt signalveien.
De angitte bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer ble transfektert med sFRP-2 cDNA (sFRP-2) eller kontroll vektor ( ctrl) og TOP /FOPflash reporter system. Wnt aktivitet ble bestemt ved luciferase-aktivitet. De viste verdiene er gjennomsnitt ± SD er for 3 uavhengige bestemmelser. Forskjeller mellom sFRP og kontroll var betydelig i Student t-test med p-verdiene av. 0,002 for BxPC-3, HS766T og L3.6sl
Katalytisk inaktive menneske sulfatase protein hemmer Wnt signalering og cellevekst
neste spurte om de endogene Sulfs i disse cellelinjene var direkte involvert i Wnt signalering. Når vi overuttrykt i Sulfs, var det ingen effekt på Wnt signal (data ikke vist). Siden alle disse cellene uttrykte betydelige nivåer av Sulfs, neste spurte vi hvorvidt det kunne være hemmende effekter hvis vi uttrykt katalytisk inaktive former av disse proteinene. Vi har tidligere vist at mutasjon av to cysteiner i sulfatase domenet av hvert SULF eliminert sulfatase-aktivitet [22]. Vi transfektert et cDNA som koder for inaktivt SULF-1 (S1ΔCC) SULF-2 (S2ΔCC) eller tom vektor (ctrl) inn i hver av de 4 cellelinjer og målt igjen Wnt aktivitet. Som vist i figur 3A, ekspresjon av enten inaktive SULF inhiberte Wnt aktivitet ≈50% i alt, men CFPAC-1-celler. De 3 svarer linjene var de samme som viste autokrint Wnt signal (figur 2). Det faktum at enten inaktive SULF utøves tilsvarende effekter på disse bukspyttkjertelkreft cellelinjer tyder funksjonell redundans av de to enzymene
A:. Fire bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer som indikert ble transient transfektert med cDNA som koder for enten en katalytisk inaktiv form av SULF-1 ( «S1ΔCC») eller en katalytisk inaktiv form av SULF-2 ( «S2ΔCC»), eller med det tomme vektor ( «kontroll»). Mutantene ble foretatt ved å erstatte to tilstøtende cysteiner med alaniner. Wnt signal ble bestemt ved å utnytte TOP /FOPflash reporter system. Verdiene som vises er midler ± SD er for 4 selvstendige avgjørelser og forskjeller mellom mutant og kontrollceller var statistisk signifikant med p-verdier og lt; 0,02 for BxPC-3, HS766T og L3.6sl celler (Student t-test). B: i pankreas adenokarsinom-cellelinjer ble dyrket med kondisjonert medium avledet fra hver av de følgende: foreldre HEK-293-celler ( «kontroll»), HEK-293T-celler som stabilt uttrykker villtype-SULF-2 (betegnet «SULF-2»), eller som uttrykker en katalytisk inaktiv form av SULF-2 ( «S2ΔCC»). Villtype SULF-2-protein og mutanten var tilstede i det kondisjonerte medium av de to produserende celler ved omtrent tilsvarende nivåer. Wnt signalering ble bestemt som før med TCF-luciferase reporter-analyse. De angitte verdiene er gjennomsnitt ± SD er for 3 uavhengige bestemmelser og forskjeller mellom SULF-2-mutant og kontroll var statistisk signifikant for BxPC-3 (p = 0,002), HS766T (p = 0,01) og L3.6sl (p = 9 x 10
-6) (Student t-test). C: De bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer ble dyrket i et transwell system over næringslag som består av: medium alene ( «Medium»); foreldre HEK 293T celler ( «HEK 293T»); HEK 293T-celler som stabilt produserer villtype-SULF-2 ( «SULF-2»); eller en katalytisk inaktiv form av SULF-2 ( «S2ΔCC»). Cellevekst ble overvåket ved hemacytometer telling i 4 dager. De viste verdiene er gjennomsnitt ± SD er for 3 uavhengige bestemmelser.
neste spurt om eksogene tillegg av katalytisk inaktive SULF protein vil også forstyrre Wnt signalering. Som en kilde for SULF-2-protein, anvendte vi HEK 293T-celler som var stabilt transfektert med enten villtype human SULF-2 (S2) eller katalytisk inaktivert SULF-2 (S2ΔCC) [25]. Vi har også brukt foreldre HEK 293T celler (293T) som kontroller. De stabile transfektanter utskilte de aktive og inaktive Sulfs ved sammenlignbare nivåer (data ikke vist). Vi inkuberes de pankreatiske adenokarsinomceller i 16 timer med CM fra disse cellene eller med kontrollmediet og i forhold Wnt signalering. Eksponering for den inaktive SULF-2 protein (S2ΔCC) hemmet Wnt signal i de samme 3 cellelinjer som var lydhør overfor transfeksjon med S2ΔCC cDNA (figur 3B), mens CFPAC celler ikke viser effekt. Tillegg av medium, klimaanlegg med aktiv SULF-2 protein, ikke fremme Wnt signalering over basalnivået.
Deretter setter vi opp en co-kultur system for å undersøke effekten av rekombinant SULF protein på cellevekst av de samme cellelinjer. De kreft i bukspyttkjertelen celler ble sådd ved lav tetthet på Transwell filtre ovenfor mater lag, som besto av foreldre HEK 293T celler eller HEK 293T uttrykker aktiv eller inaktiv SULF-2. Celletall ble overvåket for de neste dagene. Resultatene Parallelt den undertrykkende effekt vi observert på Wnt signalering. Således, som sammenlignet med kontrollmedium, S2ΔCC CM hemmet veksten av BxPC-3, HS766T og L3.6sl celler (figur 3C), men hadde ingen effekt på CFPAC-1-celler. I kontrast, gjorde aktiv SULF-2 ikke fremme eller hemme cellevekst av noen av linjene.
Lentiviral shRNA stanse SULF-2 i bukspyttkjertelen adenokarcinomceller reduserer Wnt signal, celleproliferasjon og celleoverlevelse
for å undersøke hvilken rolle SULF-2 i Wnt signalering og cellevekst videre, brukte vi shRNA metode for å dempe uttrykket SULF-2 i disse cellene. Vi ansatt tre shRNA konstruerer: to uavhengige konstruksjoner rettet mot SULF-2 (1413 og 1143) og en kontrollgruppe (ctrl). Disse konstruksjonene ble anvendt i forskjellige vektor bakgrunn hvori nærvær eller fravær av GFP mulig for oss å overvåke ekspresjon av shRNAs (se MATERIALER OG METODER). Transduced celler ble sortert for GFP uttrykk og deretter analysert for SULF-2 uttrykk. De 1143 og 1413 konstrukter (PLV-1143, PLV-1413) ga 80% og 90% reduksjon av SULF-2-proteinet, henholdsvis, i L3.6sl celler, sammenlignet med kontrollgruppen shRNA (PLV-ctrl) (figur 4A). Det var ingen reduksjon av proteinet i PLV-ctrl behandlede celler i forhold til ubehandlede celler (data ikke vist). PLV-1413 konstruere produsert en tilsvarende reduksjon i BxPC3 celler i to forskjellige vektor bakgrunner (PLV og pSico).
Inaktivering av Wnt signale resulterer i redusert nivå av aktivert β-catenin (N-terminalt ikke-fosforylert) i kjernen [3]. Vi isolerte derfor atom brøkdel av SULF-2 forstummet og kontrollceller (BxPC-3 og L3.6sl) og analysert nivåer av aktivert β-catenin. Det var en reduksjon ≈80% av β-catenin i SULF-2 dempede BxPC-3-celler, og en ≈30% reduksjon i L3.6sl celler (figur 4B). Vi kvantifisert også Wnt aktivitet ved hjelp av TCF-luciferase reporter system. I samsvar med den β-catenin resultat, bekreftet denne analysen at Wnt signal ble vesentlig hemmet i SULF-2 forstummet celler i forhold til kontroll-behandlede celler for både BxPC-3 og L3.6sl celler (Figur 4C). Igjen, BxPC-3 celler viste sterkere hemming (52% med PLV-1413) enn de L3.6sl celler (35% hemming med PLV-1413 eller PLV-1143)
A:. Celler ble transduced med betinget (pSico) eller nonconditional lentivirus (pLVTHM) koding enten SULF-to spesifikke (1413, 1143) eller kontroll (ctrl) shRNAs. Cellene ble lysert og like mengder av proteiner ble underkastet SDS-PAGE. I tilfelle av pSico ble celler lysert 10 dager etter transfeksjon cre. SULF-2 proteinnivåer ble bestemt ved å utføre immunoblot og de samme lysater ble probet med anti actin-antistoff som en lasting kontroll. B: 100 ug totalt protein av atomfraksjonen fra cellene ble påført SDS-PAGE og mengder av aktiv beta-catenin ble påvist ved anvendelse av et antistoff mot ikke-fosforylert beta-catenin. Som lasting kontroll, ble de samme lysatene analysert med en anti histone antistoff. C: Foreldre, PLV-ctrl, PLV-1413 og PLV-1143 omsatte celler ble transfektert med FOP /TOPflash reporter system og luciferase aktivitet ble registrert 48 timer senere. De viste verdiene er gjennomsnitt ± SD er for 3 uavhengige bestemmelser og forskjeller mellom ctrl og SULF-2 forstummet celler var statistisk signifikant (BxPC-3, p = 0,002 og (L3.6sl, p = 0,013 og 0,017 for de to støydempere vektorer) .
bestemmes effekten av SULF-2 stanse på celleproliferasjon ved å måle inkorporering av 5-bromdeoksyuridin (BrdU) inn i cellene. det var en 25-30% reduksjon av celler som gjennomgår S- fase i L3.6sl, BxPC3, og HS766T celler, og kun en 5% reduksjon i CFPAC-1 celler (figur 5A). i tillegg utførte vi apoptose analyser ved å måle annexin V farging. De SULF-2 forstummet BxPC-3 celler viste en økning i apoptose av 33%, mens L3.6sl cellene viste økninger på 65% og 79% med to uavhengige shRNAs (figur 5B)
A.: de angitte celler ble transdusert med kontroll (PLV-ctrl ) eller SULF-2 shRNA (PLV-1413, PLV-1143). cellene ble deretter inkubert med BrdU i en time og BrdU-inkorporering ble detektert ved strømningscytometri-analyse. Verdiene som vises er gjennomsnittet +/- SD er for 2 uavhengige eksperimenter. Forskjellene i BrdU opptak mellom ctrl og SULF-2 forstummet celler var statistisk signifikant for BxPC-3 (p 0,005), L3.6sl (p 0,007) og HS766T (p 0,001). B: BxPC-3 og L3.6sl bukspyttkjertelen celler ble transduced med kontroll (PLV-ctrl) eller SULF-2 shRNA (PLV-1413, PLV-1143) ble høstet og inkubert med PE-konjugert annexin V. Deretter cellene ble utsatt for flowcytometri analyse. Forskjellene mellom mellom ctrl og SULF-2 forstummet celler var statistisk signifikante med p-verdier på 0,0001 for BxPC-3 og p 0,004 for L3.6sl. C og D: L3.6sl celler ble transduced med enten PLV-1413, PLV-1143 eller PLV-ctrl og blandede bestander av siRNA og ikke-siRNA uttrykker celler ble dyrket. Prosenter av transduced til ikke-transduced celler ble målt over tid ved GFP uttrykk. BxPC-3 celler ble transduced med enten pSico-ctrl eller pSico-1413 og transient transfektert med CRE-rekombinase å aktivere uttrykk for shRNA. De resulterende blandede bestander av celler med aktivert (GFP-) og inaktivert (GFP +) shRNA uttrykk var co-kultivert. Forhold mellom GFP + til GFP- celler, ved hjelp av flow cytometri ble analysert som en funksjon av tid. Uttrykk av GFP ikke har noen effekt på cellevekst i kontrollpopulasjonen.
For å undersøke cellevekst over tid i SULF-2 forstummet celler, vi sammenlignet vekst av celler der SULF-2 ble stille med ikke-transdusert parentale celler i en blandet kultur. I parallelle ko-kulturer, sammenlignet vi veksten av kontroll shRNA-transduserte celler med sperre ikke-transdusert celler. For begge de SULF-2 spesifikke shRNAs, ikke-forstummet foreldre L3.6sl celler gradvis overtok de forstummet celler med tiden i kultur. Lignende resultater ble sett med BxPC-3 celler (Figur 5D). I kontrast, var det ingen endring i forholdet mellom kontroll-transduced celler til foreldre celler over tid (figur 5C).
stanse av SULF-2 hemmer tumorvekst in vivo
For å finne ut effektene av SULF-2 stanse på tumorigenitet av L3.6sl og BxPC-3 celler
in vivo
, vi sammenlignet veksten av svulster som dannes i immunsupprimerte mus med eller uten lyddemping SULF-2. Naken mus (CD-1) ble injisert subkutant med enten PLV-ctrl eller PLV-1413 omsatte celler en uke etter transduksjon. Tumorstørrelse ble fulgt med tiden ved utvendig palpasjon. Ved slutten av forsøket ble dyrene avlivet og tumorvekt ble målt. Som vist i figur 6, tumorer avledet fra SULF-2 dempede celler (L3.6sl eller BxPC-3) vokste ved en vesentlig lavere hastighet enn de avledet fra kontrollcellene (figur 6B). De høstede svulster fra dempede celler ble tilsvarende redusert i vekt uten overlapping av de to grupper for hver cellelinje (figur 6C).
L3.6sl og BxPC-3-celler ble transdusert med enten PLV-1413 eller PLV -ctrl og subkutant injisert inn i nakne mus på 5 × 10
6 per område. A: L3.6sl avledet svulster høstet fra mus etter 17 dager med vekst B: Tumor størrelse ble overvåket over tid og verdier representerer gjennomsnittet (+/- SEM) av fire mus for L3.6sl celler og 6 (PLV-ctrl) eller 5 (PLV-1413) mus for BxPC-3 celler. C: Dyrene ble avlivet og tumorvekten ble undersøkt. Forskjellen i tumorvekt mellom de to gruppene var signifikant for L3.6sl celler med en p-verdi på 0,01 og for BxPC-3 celler med en p-verdi på 0,029 (Student t-test).
diskusjon
det rådende synet i litteraturen har vært at Sulfs er negative regulatorer av tumorcellevekst. En rekke rapporter har vist at overekspresjon av SULF-1 [28] – [34] eller SULF-2 [32] i tumorcellelinjer inhiberte vekstfaktor aliserte respons på flere faktorer, inkludert FGF-2, HB-EGF, og HGF. Dessuten ble det tumorgenisiteten SULF-overuttrykkende celler i immunocompromized mus redusert [31], [32], [34]. De negative effektene av Sulfs for FGF-2-signalisering er i overensstemmelse med de kjente krav for 6S på HSPGs i FGF-2 aliserte kompleks [37]. Disse cellelinje funn har ført til forslaget om at nedregulering av Sulfs kunne gi tumorceller med en vekstfordel i bestemte innstillinger. Denne modellen kan ha gyldighet for betydelig undergruppe (to tredeler) av eggstokkreft tilfeller [28] og mindre undergruppe (29%) av leverkreft tilfeller [30] der
SULF1
uttrykk er nedregulert i forhold til at i normalt vev. Imidlertid er modellen problematisk for de betydelige undergrupper av flere kreftformer som viser økning i
SULF
uttrykk. Således kan for eksempel,
SULF1
blir oppregulert i betydelige undergrupper av brystkreft [38], bukspyttkjertelkreft [31], [39] (tabell 1), lunge adenokarsinom [40] og hepatocellulært karsinom [30], mens
SULF2
er oppregulert i myelomatose [32], brystkreft og CNS-kreft [41].
for å forstå betydningen av oppregulert
SULF
uttrykk i en kreft, vi valgte å fokusere på bukspyttkjertelen adenokarsinomer grunn av klare bevis assosiere denne kreft med kanoniske Wnt signalering, et signalveien kjent for å være positivt regulert av Sulfs under utvikling (se ovenfor). I samsvar med avskrift uttrykk data (tabell 1), fant vi at begge Sulfs ble sterkt uttrykt på proteinnivå ved maligne epiteliale celler i bukspyttkjertelen adenokarsinom. For å lette etterforskningen av disse enzymene i kreft i bukspyttkjertelen, vi undersøkte
SULF
uttrykk i et stort panel av bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer og fant utbredt uttrykk, spesielt på
SULF2
. Vi valgte 4 linjer for studium, som alle blir uttrykt SULF-2-protein og en av dem blir uttrykt både Sulfs. Tidligere studier har vist at proliferasjon og overlevelse av tre av disse (BxPC-3, HS766T og L3.6sl) avhenge aktivert Wnt signale [M. Pasca di Magliano og M. Hebrok, upubliserte observasjoner]. Vi viste at Wnt signal ble markert inhibert ved overekspresjon av rekombinant sFRP-2 i følgende cellelinjer. Videre overekspresjon av katalytisk inaktive SULF-2 i de samme linjene resulterte i en markert hemming av Wnt aktivitet, og eksponering av cellene til inaktiv SULF-2-protein i løpet av kulturen inhiberte både Wnt signalering og vekst. Disse resultater er konsistente med Wnt-ligand-avhengig vekst av disse cellene ( «autocrine Wnt signalering»), som blir modulert av det ekstracellulære Sulfs. Det er sannsynlig at den CFPAC-1 cellelinjen, som var ildfast til alle disse behandlingene, bærer en aktiverende mutasjon i nedstrøms elementer av Wnt signalveien som ville omgå behovet for ekstracellulære wnt ligander og Sulfs. Det bør bemerkes at de Sulfs representerer et ytterligere eksempel på et ekstracellulært faktor, som modulerer Wnt signalering.
