Abstract
Formålet med denne studien var å undersøke spesifikke molekylære markører som kan føre til ny innsikt i identifiseringen av innovative behandlinger. Rollen DNMT3b og sin prediktiv kraft i prognosen for oral cancer ble identifisert. Menneske orale kreftcellelinjer inkludert SCC4 og SCC25 ble valgt for cellulære eksperimenter. Endringer i tumorvekst, aggressivitet og ansvarlig signalveien ble undersøkt
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre ble 125 muntlige kreft vevsprøver analysert ved hjelp av immunhistokjemisk farging på vevet microarray lysbilder, og korrelasjoner beregnet mellom nivået på DNMT3b og det kliniske utfallet av pasientene. Våre data viser at inhibering av DNMT3b resulterte i langsommere tumorvekst, tumorinvasjon svekket evne og epiteliale mesenchymale overgang, som bestemt ved
in vitro
og
in vivo
eksperimenter. Aktivert IL-6 signal kan være ansvarlig for induksjon av DNMT3b overekspresjon på kreft i munnhulen. Angående kliniske data, forekomsten av DNMT3b immunreaktivitet i orale kreftprøvene var betydelig høyere enn i ikke-ondartet epitel, og positivt forbundet med ekspresjon av IL-6. Videre er ekspresjon av DNMT3b var signifikant forbundet med risiko for spredning til lymfeknuter, tilbakefall av sykdommen og kortere overlevelse hos pasienter med patologisk stadium III-IV oral cancer. Som konklusjon, kan IL-6 -DNMT3b aksen brukes til å forutsi prognosen for kreft i munnhulen i klinikker, og målretting DNMT3b kunne representere en lovende behandlingsstrategi
Citation. Chen WC, Chen MF, Lin PY (2014 ) Betydningen av DNMT3b i Oral Cancer. PLoS ONE 9 (3): e89956. doi: 10,1371 /journal.pone.0089956
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: Oktober 30, 2013, Godkjent: 24 januar 2014; Publisert: 13 mars 2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet var støtte ved Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan, gi CMRPG6A0222-3. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
de mest oral cancer er muntlig plateepitelkarsinom (OSCC) som er de mest ondartede svulster i hode og nakke. Denne aggressive epiteliale svulster er assosiert med alvorlig sykelighet. Post-operative kjemoradioterapi (CCRT) resulterer i bedre lokoregionalt kontroll og overlevelse for lokalt fremskreden hode- og nakkekreftpasienter med høy risikofaktorer [1]. Til tross for betydelige fremskritt i behandlingen, 40-50% av pasienter med lokalt avansert sykdom tilbakefall med lokal eller fjern sykdomsprogresjon [2]. Gransker spesifikke molekylære markører knyttet til ubalanse mellom celledød og spredning, kapasitet for vev invasjon og behandling følsomhet, kan gi ny innsikt for identifikasjon av innovative behandlinger.
OSCC er en multifaktoriell sykdom, som er først og fremst knyttet med kronisk tobakk, alkohol og mutter bruke [3]. Genetisk predisposisjon har også vært innblandet i oral tumorigenesis, og flere genetiske og epigenetiske alter er involvert i veksten av kreft [4]. Avvikende DNA metylering spiller en sentral rolle i kreftutvikling, som fører til epigenetisk stanse av tumor-suppressor gener involvert i cellesyklus regulering, apoptose og DNA-reparasjon [5], [6]. DNA hypermethylation oppstår ofte i forstadier til kreft og kreft vev [7]. I OSCC, P14, P16, MGMT, DAP-kinase og E-cadherin ofte og omfattende studier metylerte gener [8] – [12]. DNA metylering er vanligvis formidles av DNA metyltransferaser (DNMT) og i pattedyr genomer er det tre DNMT gener; DNMT3a og DNMT3b er ansvarlig for de novo metylering og endre unmethylated DNA, og DNMT1 er antatt å være ansvarlig for å opprettholde metylering mønstre [13] – [15]. DNMT3b har blitt rapportert til å delta i karsinogenese av flere krefttyper, inkludert øsofageal, gastrisk og lungekreft [16] – [18], men rollen til DNMT3b i OSCC krever videre undersøkelse. Vi har tidligere rapportert at aktivert IL-6 signal var assosiert med aggressiv svulst atferd i munnhulekreft [19]. I orale kreftceller, ble IL-6 rapportert å fremme tumorgenese ved alterinig DNA-metylering [20]. Følgelig, undersøkte vi uttrykket av DNMT3b i OSCC og dens kobling med IL-6 signal i denne studien. Rollen DNMT3b i OSCC
in vitro Hotell og
in vivo
, og korrelasjonen med de kliniske utfall av pasienter med OSCC bruker immunkjemiske flekker analyse ble også undersøkt.
Materialer og metoder
Vevsprøver og kjennetegn ved pasientene
Institutional Review Board (IRB) fra Chang Gung Memorial Hospital godkjent denne studien (Permit Number: 98-3546B). De skriftlige samtykke ble signert av pasientene for sin prøven og informasjon som skal lagres på sykehuset og brukes til forskning. Samtykket Prosedyren ble godkjent av IRB. Prøvene ble retrospektivt samlet inn fra pasienter diagnostisert med lokalavansert OSCC som fikk kurativ behandling, og bygget inn microarray (TMA) steiner for immunkjemiske analyser. I studien ble TMA blokker besto av 125 OSCC tilfeller med patologisk stadium III-IV (bukkal, n = 48, gingival, n = 24; leppe, n = 10; tunge, n = 35; gane, n = 8) etter AutoTiss 1000 (Ever bioteknologi, Canada). Når blokkene var tilgjengelige, hematoksylin og eosin-farget lysbilder ble re-evaluert av en patolog for å vurdere kvaliteten på TMA skred. Data om første diagnose, iscenesettelse, patologiske faktorer, tilbakefall og overlevelse ble samlet (tabell 1). Overlevelsessannsynlighets analyser ble utført ved anvendelse av Kaplan-Meier-metoden. Betydning forskjell mellom gruppene ble vurdert ved hjelp av Sperman-rank test. Multivariate analyser ble utført ved hjelp av en Cox regresjonsmodell for total overlevelse. Alle statistiske tester var tosidig, med betydning definert som p. 0,05
Immunhistokjemisk farging (IHC)
Tissue seksjoner fra TMA blokker og formalinfikserte, parafininnstøpte vev var skåret i 4-mikrometer seksjoner, montert på lysbilder, deparaffinized med xylen og dehydrert ved hjelp av en gradert etanol serien. Antigen gjenfinning med bruk av sitronsyre (pH 6,0) i 30 minutter, etterfulgt av behandling with3% hydrogenperoksyd. Platene ble inkubert over natten ved 4 ° C med antistoffer mot spesifikke proteiner. Antistoffer spesifikke for p-H2AX, MMP-9, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), og CD31 ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA), Chemicon (Temecula, CA), Research og deretter 3-amino-9-etylkarbazol-løsning ble tilsatt. Seksjonene ble kontra med hematoksylin. IHC data ble analysert ved hjelp av Image Pro Plus 6.3 (IPP). Mikrovaskulær tetthet (MVD) målinger ble ved hjelp av CD31-farging Hver immunoreaktivt endotelial celleklase i kontakt med det valgte felt ble tellet. Dataene i IHC ble undersøkt ved god tilgang scan lysbilder plattform, og analysert ved Image Pro Plus 6.3 (IPP). Denne analysen viste at antistoffer rettet mot proteinene som var sterkt uttrykt i tumor epitelceller (fig. 1) sammenlignet med tilstøtende ikke-kreftvev. For histologisk evaluering av DNMT1 og DNMT3b flekker, i tillegg til IPP-analyse, ble objektglassene på nytt kontrolleres av en enkelt patolog. DNMT1 og DNMT3b immunoreaktivitets av en vevsprøve ble regnet for cellene viste positiv atom farging, uavhengig av cytoplasmatiske staining.The prøvene ble vurdert ved hjelp av semi-kvantitative immunoreactive poengsum (IRS). IRS ble beregnet ved å multiplisere den fargeintensitet (gradert som: 0 = ingen, 1 = svak 2 = moderat, og 3 = sterk farging) og prosentandelen av positivt fargede celler (0 = mindre enn 10% av fargede celler, 1 = 11-50% av fargede celler, 2 = 51-80% av fargede celler, og 3 = mer enn 81% av fargede celler). Kriteriet for positiv farging er et eksemplar med en IRS score klasse 2.
A. Nivåer av DNMT1 og DNMT3b ble undersøkt i kreft (CA) og ikke-ondartet vev (NT) ved Western blotting-analyse. B. Nivåer av DNMT1 og DNMT3b ble undersøkt i seks prøver (paret kreft (CA) og tilstøtende ikke-ondartet vev (NT),. Ved hjelp av RT-PCR Y-aksen viser forholdet mellom mål-protein i kreftvevet dividert med det i . ikke-maligne prøven Columns, mener tre separate forsøk, barer, standardavvik (SD), *, P . 0,05 C. Representative lysbilder av IHC positiv farging med DNMT1 og DNMT3b antistoffer er vist med bilder ved hjelp av IPP (NT, tilstøtende ikke ondartet epitel,. CA, oral cancer vev) Bilder av representative lysbilder vises på forstørrelser av × 100 (øverste rad) og × 200 (nedre rad) * (+) betyr positiv farging i kreft .. ved NT
Cell kultur og reagenser
Den menneskelige orale kreftcellelinjer, SCC4 og SCC25, ble hentet fra Bioresource Collection og Research Center (BCRC). menneskelig rekombinant IL-6 antistoff ble hentet fra R .. D (Minneapolis, MN) for DNMT inhibitor 5-aza-2′-deoksycytidin ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO) Et DNMT3b-GFP stanse vektor (psiRNA-h7SK vektor som uttrykker siRNA rettet mot human DNMT3B fra den humane 7SK RNA polymerase III promoter, og GFP:Zeo fusjonsgenet som gir både reporter og antibiotikaresistens aktiviteter) og GFP-kontroll vektor (Non-effektiv egge siRNA i GFP vector) ble kjøpt fra InvivoGen. Stabile DNMT3b-forstummet kreftceller ble generert ved trans SCC4 og SCC25 celler med DNMT3b stanse vektor og valgt ved dyrking i medium som inneholder Zeomycin i 4 uker.
Cell vekst og klonogene analysen
Effekter av DNMT3b på cellevekst ble vurdert ved hjelp av celler transfektert med en DNMT3b stanse vektor eller kontroll vektor. For å måle cellevekst, 1 × 10
4 celler per brønn ble sådd ut i 6-brønners retter. Ved de indikerte tidspunktene ble celler trypsinert, oppsamlet og overlevende celler tellet ved hjelp av Trypan blå eksklusjon, hvorfra overlevelseskurver for SCC transfektanter ble etablert. I tillegg ble klonogene test som benyttes. Eksponentielt voksende celler ble inkubert ved 37 ° C i 10 dager, og platene ble farget med krystall-fiolett (Sigma) for å hjelpe til kolonitelling. Kolonier som inneholder . 50 celler ble scoret å bestemme plating effektivitet og overlevende fraksjoner for hver cellelinje
Immunoblotting
For western blotting av hele celler og ekstrakter muntlige vev, prøver ble homogenisert og /eller behandlet med lyseringsbuffer (Calbiochem, La Jolla, CA). Den muntlige vevsprøver omfattet seks kreft vevsprøver og seks ikke-maligne epitel prøver. En NE-PER kit (Pierce, Rockford, IL) ble anvendt for å separere nukleære og cytoplasmatiske proteiner. For å bestemme
in vitro
effekter av IL-6 Ab, og en DNMT inhibitor, proteiner ble ekstrahert fra celler i nærvær eller fravær 5 ug /ml IL-6 nøytraliserende antistoffer i 24 timer eller 5 uM 5- aza-2′-deoksycytidin-i 36 timer, henholdsvis. Lik mengde protein ble applisert på en 4-20% gradient SDS-PAGE-gel, ble proteinet overført på nitrocellulosefiltere etter separert i gelen. Blottene ble blokkert i 2% BSA i TBST i 1 time, ble membranene inkubert over natten (4 ° C) med antistoffer mot DNMT1, DNMT3b, VEGF, E-cadherin, STAT3, pSTAT3
Tyr705, og MMP-9. Membranene ble inkubert med HRP-konjugert sekundært anti-geit, anti-mus eller anti-kanin-antistoffer (fortynning 1:1,000-1:2,000), henholdsvis i 1 time ved romtemperatur. Proteiner ble gjort synlige ved forsterket kjemiluminescens. Membranene ble reprobed med et antistoff mot r-tubulin eller kjernefysisk Lamin å normalisere protein lasting.
Sanntids revers transkripsjon polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time RT-PCR ble utført på RNA ekstrahert fra celler og vev prøver (prøvene seks kreftvev og seks ikke-maligne orale vev, to eksemplarer som løper i hver kolonne). RNA (2 pg) ble reverstranskribert med et tilfeldig primer for å oppnå den første cDNA-tråd. Sekvensene av primere for DNMT3b var 5’GACTCGAAGACGCACAGCTG -3 «/5’CTCGGTCTTTGCCGTTGTTATAG». For å kontrollere for lasting forskjeller, ble en β-actin primer anvendt som en kontroll. Den optimaliserte PCR ble utført på en iCycler Iq flerfarget real-time PCR deteksjon system. Betydelige fluorescerende PCR-signaler fra carcinoma vev ble normalisert til gjennomsnittsverdien av de signaler som oppnås fra de ikke-maligne vev og celler i henhold til kontrollforhold.
Immunofluorescence farging (IF)
Celler som viser eksponensiell vekst ble sådd ut på dekkglass for immunofluorescens farging med eller uten behandling. På de angitte tidspunkter etter behandling ble cellene fiksert, permeabilisert med 2% paraformaldehyd i 5 minutter og vasket med PBST. Platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med antistoffer mot E-cadherin, DNMT3b, VEGF og MMP-9 i 1 time med en Texas Red-konjugert sekundært antistoff. Objektglassene ble motfarget med DAPI å visualisere kjerner. Etter to vasker med PBST, ble bestemte geografiske proteiner visualisert ved hjelp av en fluorescens mikroskop.
Cell migrasjon og celle invasjon analysen
Beholdere for celle invasjon ble bestemt ved hjelp av en celle invasjon analysen (Trevigen, Gaithersburg, MD). Etter inkubering i 24 timer ble antall celler i bunnkammeret bestemt ved måling av fluorescerende anionet calcein, frigjøres fra intracellulær calcein acetoxymethylester. For å validere eksperimenter om cellevandring, ble skrape analyser utført. En 2 mm bred ripe ble trukket tvers over hver celle laget ved hjelp av en pipette. Platene ble fotografert ved tidspunktene angitt.
Tumor xenograft modell
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr som kunngjort av Institutes of Laboratory Animal Resources, National Research Council, USA protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Chang Gung Memorial Hospital (Permit Number: 2012080902). Åtte uker gamle hunn atymiske nakne mus ble anvendt som xenograft modell tumorimplantering. I ektopisk tumor implantasjon modell, celler (ble 1 × 10
6 tumorceller injiseres subkutant per implantasjon, fem dyr per gruppe) ble implantert i bilaterale rygg gluteal regionen. Tumorstørrelse ble målt hver tredje dag etter implantasjonen (dag 0). Tumorvolumet ble beregnet ved å anta en ellipsoide form.
Resultater
Nivåer DNMT3b i oral cancer vev
uttrykk for DNMT3b i vevsprøvene (ondartet versus tilstøtende ikke-ondartet ) ble undersøkt ved Western blotting, mens mRNA ble demonstrert ved sanntids RT-PCR (fig. 1A-B). Av dataene, kreft viste et signifikant høyere nivå av DNMT3b enn ikke-maligne prøven. IHC data for TMA lysbilder bekreftet dette funnet at DNMT3b ble overuttrykt i tumorvev enn de tilstøtende ikke-maligne epiteliale vev (Fig. 1C). Av de 125 oral cancer vev analysert for DNMT3b og DNMT1 ved hjelp av IHC-analyse, 76 (61%) ga DNMT3b positiv immunreaktivitet, men bare 36% (45/125) med DNMT1 positiv farging. Videre rolle DNMT3b i det kliniske resultatet av human OSCC ble ytterligere evaluert ved hjelp av IHC-farging. Pasientene ble ytterligere klassifisert som DNMT3b (+) eller DNMT3b (-) på grunnlag av IHC resultater. Det var en positiv korrelasjon mellom forekomst av lymfeknutemetastaser, tilbakefall av sykdommen og DNMT3b positiv farging (tabell 1). Åtti-tre prosent (40/46) av pasienter med tilbakefall av sykdommen (inkludert lokale regionale svikt og fjernmetastaser) viste positiv farging for DNMT3b. I motsetning til 46% (36/79) av pasientene klassifisert som å ha sykdomsfri status uttrykt DNMT3b. Funnene tyder på at DNMT3b flekker kan ha prediktiv verdi i prognosen for kreft i munnhulen.
Rolle DNMT3b i tumorvekst
For å undersøke om vekslende DNMT3b uttrykk spilt en rolle i aggressiv tumorvekst, oral cancer celler ble transfektert med en DNMT3b-GFP silencing vektor. Som vist i figur 2A, det DNMT3b stanse vektoren signifikant hemmet DNMT3b ekspresjon i kreftceller ved Western blotting og farging immunokjemiske analyser. Effekten av DNMT3b på tumorcellevekst, ble bestemt ved telling av levedyktige celler over seks dager og kolonidannelse. Dataene etter cellulære forsøk viste DNMT3b stanse vektorer betydelig hemmet tumor celleproliferasjon
in vitro plakater (Fig. 2B). Endringen i cellesyklusfordelingen ble videre målt. Den DNMT3b stanse vektor resulterte i cellesyklus arrest (Fig. 2C). Som vist i figur 2D ved observasjon av xenograft tumorer, hemming av DNMT3b ved hjelp av støydempere vektorer signifikant reduserte tumorvekst.
A. Effekter av DNMT3b støydempere vektor på nivået av DNMT3b i SCC4 og SCC25 demonstrert ved Western blotting og immunkjemiske farging
in vitro
. Bilder av representative lysbilder vises og pilen indikerer positiv farging av DNMT3b i cellene. (C-V, celler med kontroll vektor; DNMT3b-SV, celler som er stabilt transfektert med DNMT3b stanse vektor, DNMT-I, celler behandlet med DNMT inhibitor). B. Effekt av DNMT3b på proliferasjonen av orale kreftceller som bestemt ved telling av levedyktige celler og kolonidannelse. Det samme antall celler (10
4) ble sådd ut i hver plate på dag 0 og tillatt å vokse i sine respektive kulturer. Vi telles antallet levedyktige celler etter inkubasjon i 2, 4 og 6 dager. Y-aksen representerer den levedyktige celletall. Point, betyr av tre separate forsøk; barer, SD. *,
p
0,05. C. Celler ble analysert ved hjelp av FACS for DNA-innhold i henhold til kontrollforhold eller med DNMT3b hemming. Dataene ble demonstrert ved representert bildene. D. Effekter av DBMT3b stanse vektor på nivåene av DNMT1 og DNMT3b evaluert ved IHC og xenograft tumorvekst. Hvert punkt representerer gjennomsnittet av tre separate forsøk; barer, SD; *,
P
0,05. Representative Bildene vises.
Rolle DNMT3b i tumorinvasjon
Det var en positiv sammenheng mellom DNMT3b farging og LN metastasering og sykdom svikt hos pasienter med kreft i munnhulen (tabell 1). som vist ved hjelp av migrasjon scratch og invasjon analyser, DNMT3b støydempere vektorer dempes invasjonen kapasitet på muntlige kreftceller
in vitro plakater (fig. 3A-B). Epitelial mesenchymale overgang (EMT) er en viktig begivenhet i invasivitet av en svulst [21]. Derfor ble det fastslått om dette var mekanismen bak effekten av DNMT3b på kreft i munnhulen invasivitet. Den DNMT3b stanse vektor indusert muntlige kreftceller til å øke sine epiteliale egenskaper som bestemmes av endringer i uttrykket av E-cadherin, et kjennetegn på EMT [22] og vimentin (Fig. 3C-D). EMT er rapportert å være assosiert med et antall av invasjonsrelaterte faktorer, inkludert VEGF og MMP-9. Våre data viser at hemming av DNMT3b av taushet vektoren resulterte i lavere uttrykk for VEGF og MMP-9. Angiogenese er en av de mekanismer som fremmer tumorprogresjon, og CD31-mediert endoteliale celle-celle-reaksjoner som er involvert i angiogenese [23]. Derfor er det vaskulære nettverk innen tumoren ble målt ved hjelp av VEGF-farging og mikrovaskulær tetthet (MVD) analyse etter CD31-farging. Når orale kreftceller med kontroll vektorer og de med DNMT3b støydempere vektorer ble subkutant implantert inn i mus, har vi funnet at den veksthemmende virkning indusert ved DNMT3b stanse vektor assosiert med lavere ekspresjonsnivåer av EMT- og angiogenese-relaterte faktor (fig. 3E). Derfor foreslo vi at DNMT3b overekspresjon spiller en rolle i tumorvekst, og induksjon av angiogenese og EMT kan være underling mekanismer.
A. Den invasive kapasitet på orale kreftceller med eller uten DNMT3b lyddemping vektoren ble evaluert ved migrasjon skrape analyser. Resultatene fra representative lysbilder vises. Kolonne, mener tre separate forsøk. Barer, SD. *, P 0,05. B. invasive kapasitet orale kreftceller med eller uten regulering DNMT3b ble evaluert av invasjonen analysen i SCC4 og SCC25 oral kreftceller. Resultatene er vist ved representative lysbilder og kvantitative data. *,
P
0,05. C. endring av E-cadherin i cellene blir evaluert, og resultatene er vist ved representative glidere (øvre rad, immunofluorescerende bilde farget med Ab for DNMT3b og DAPI for kjernen, lavere rad, immunofluorescerende bilde farget med Ab for E-cadherin og DAPI for nucleus); (Blå: DAPI; Grønn: GFP-vektor, Red: target protein). D. Endringene i EMT-assosierte proteiner i celler med å regulere DNMT3b ble evaluert ved Western blot-analyse (C-V, celler med kontroll vektor; DNMT3b-SV, celler med DNMT3b lyddemping vektor). E. IHC ved bruk av MMP-9, CD31, og VEGF farging i formalinfikserte, parafininnstøpte vev fra xenografttumorer. DNMT3b støydempere vektorer ble betydelig redusert ved angiogenese og EMT-relaterte endringer sammenlignet med kontroll vektor.
DNMT3b og IL-6 er knyttet til kliniske resultatet av OSCC
Tidligere vi rapporterte at aktivering av IL-6 /STAT3 signal indusert aggressiv kreft atferd og EMT endringer i munnhulekreft [19]. Derfor er korrelasjonen mellom DNMT3b og IL-6 i det kliniske resultatet av trinn III-IV human OSCC ble videre beregnet ved hjelp av IHC på TMA bestående av 125 prøver. Av de 125 vevsprøver analysert for DNMT3b og IL-6, både 59 (61%) var positive. Som vist i figur 4A, ble en signifikant positiv korrelasjon observert i kreft prøven som farget positivt for DNMT3b og IL-6. Ved hjelp av univariat analyse, tilbakefall av sykdommen og positiv farging for DNMT3b og IL-6 var alle signifikant bundet med kortere overlevelse (tabell 2 og figur 4B). Ved hjelp av multivariat analyse, uttrykk for DNMT3b og sykdom tilbakefall var signifikant prediktor for total overlevelse i de 125 orale kreftpasienter (tabell 3). Funnene fremheve bidrag DNMT3b flekker til dårlig prognose i kreft i munnhulen. Ved proteinanalyse, inhibering av IL-6 signal resulterte i redusert DNMT3b og EMT-relaterte faktorer uttrykk, assosiert med svekket STAT3 og Akt-aktivering (fig. 5A-B). Dessuten viste figur 5C at redusert DNMT3b av IL-6 antistoff økte DNA-skade og celledød. Derfor er det foreslått at aktivering av IL-6 signal kan være ansvarlig for den økte DNMT3b i orale kreftformer.
A. DNMT3b nivå var positivt korrelert med IL-6 uttrykk i humane orale kreftprøver (P 0,0001). Representative lysbilder av en selekterte tumor prøven positiv farging for både IL-6 og DNMT3b er vist ved 100 og 400 x forstørrelse. B. Overlevelses forskjeller i henhold til utvikling av sykdom svikt eller ikke, den positive farging av DNMT3b og positiv farging for både DNMT3b og IL-6. De Kaplan- Meier generelle overlevelseskurver viser at de positive gruppene ble koblet med kortere overlevelse sammenlignet med respektive negative gruppen.
A. Effekt av IL-6 på nivåene av DNMT3b og EMT-relaterte proteiner blir evaluert ved analyse immunofluoresence
in vitro
og resultatene er vist ved representative lysbilder. B. Virkning av blokkering av IL-6 på nivå med DNMT3b, blir STAT3 /AKT aktivering og EMT-beslektede proteiner evaluert ved Western blotting-analyse. C. Effekt av IL-6 på nivå av DNMT3b og celledød proteiner i SCC4 og SCC25 demonstrert av immunkjemiske farging
in vitro
.
Diskusjoner
Det har blitt rapportert at en bryter for å akkumulere DNA hypermethylation kan være forårsaket av over-uttrykk for DNA metyltransferaser [15]. Epigenetisk genet stanse, fremmet av DNMTs, har blitt observert i ulike kreftformer, som støtter påstanden om at DNMT gener er over-uttrykt i kreft hos mennesker og i løpet av cellulær transformasjon [24] – [26]. I den foreliggende undersøkelse, IHC av TMA lysbilder viste at nivået av ekspresjon DNMT3b var høyere i 76 (61%) kreftprøvene enn i tilstøtende ikke-ondartet oral epitel. Vi evaluerte videre hvis DNMT1 ble overuttrykt i OSCC hjelp IHC av TMA lysbilder. Dataene viste at bare 45 (36%) cancer prøven hadde høyere DNMT1 sammenlignet med tilstøtende ikke-maligne epitelvev. Identifisering, utvikling og valg av molekylære mål er viktige i kreftterapi. Den prediktive krefter DNMT3b ble videre undersøkt med tanke på det kliniske utfallet av kreft i munnhulen. Ved hjelp av univariat analyse, ble forbedret uttrykk for DNMT3b signifikant assosiert med en høyere forekomst av lymfeknutemetastase, en høyere tilbakefall etter behandling og kortere overlevelse. Ved hjelp av multivariat analyse, sykdom svikt og økt uttrykk for DNMT3b var signifikant assosiert med kortere total overlevelse. For ytterligere å undersøke om DNMT3b var ansvarlig for aggressiv tumorvekst av OSCC, undertrykt vi DNMT3b i orale kreftceller ved hjelp av en lyddemping vektor. Data fra cellulære eksperimenter og xenograft tumorvekstforsøk vist at inhibering av DNMT3b resulterte i langsommere tumorvekst. I tillegg kan inhibering av DNMT3b var forbundet med dempet invasivitet. De molekylære og fenotypiske forandringer som er involvert i transformasjonen av en epitelial celle til en mesenchymale celletype synes å være funksjonelt relevante for invasive egenskapene av epiteliale tumorer [21]. Det har blitt rapportert at EMT er forbundet med OSCC progresjon [27], [28]. På molekylært nivå markør, blir EMT kjennetegnet ved et tap av E-cadherin og økt ekspresjon av vimentin og invasjonsmessige forhold. De DNMT3b støydempere vektorer induserte en økning i E-cadherin og reduksjon i VEGF og MMP-9 i orale kreftceller. I tillegg er angiogenese en av de mekanismer som fremmer tumorprogresjon, og CD31-mediert endoteliale celle-celle-interaksjoner som er involvert i angiogenese. Av våre data, hemming av DNMT3b dempes tumorvekst, assosiert med redusert CD31 og VEGF uttrykk i svulster. Disse funnene indikerer at DNMT3b kan megle aggressiv tumorvekst i kreft i munnhulen, og fremming av EMT og angiogenese er en av de underliggende mekanismene.
OSCC utviklingen er delvis tilrettelagt av kroniske epitel irritasjoner og denne svulsten er mer hyppig i røyker eller som forbruker overdreven mengde alkohol. IL-6 er et proinflammatorisk cytokin som medierer kronisk inflammasjon og har blitt rapportert å spille en viktig rolle i inflammasjon drevet oral karsinogenese [29], [30]. Vi har tidligere rapportert at aktivert IL-6-trasé kan være ansvarlig for mer aggressiv tumorvekst notert i munnhulen, og høy aktivert STAT3 og p-AKT nivået ble indusert ved hjelp av IL-6 og IL-6 bindings til tumorgenese [19]. Det er rapportert at IL-6-nivåer er forhøyet i denne neoplasmer og IL-6 er betraktet som en dårlig prognostisk faktor i munnhulen. IL-6-sekresjon i munn squamous kreft lettes ved mikromiljøet, særlig ved stromal avledet faktor-1 [29]. Dessuten har en rekke prosjekter har vist at IL-6 indusert hypermethylation og genet Slå kan være mediert ved DNMTs [18], [20], [31] – [33]. Tatt sammen, foreslo vi det kronisk betennelse stress i munnhulen kan fremme tumorigenesis mediert av økt IL-6 for å indusere avvikende DNA-metylering via økt DNMT3b aktivitet. I den foreliggende undersøkelse, IHC data oppnådd fra kliniske prøver viste at DNMT3b ekspresjon ble signifikant korrelert med IL-6 farging. Svulsten aggressivitet bemerket i IL-6 positiv OSCC kan være delvis via overekspresjon av DNMT3b. For å teste hypotesen, ble forholdet mellom IL-6 signalering og DNMT3b i OSCC videre undersøkt i denne studien å se om regulering av IL-6 signal resultater i endringer av DNMT3b uttrykk. Ved eksperimenter der IL-6 signal ble undertrykt ved hjelp av IL-6 antistoff, har vi funnet at aktivert IL-6 signalering spiller en viktig rolle i aktivering DNMT3b forbundet med aktiv STAT3 og PI3K i orale kreftceller. Resultatene oppnådd fra denne studien data viste at den økede DNMT3b indusert av IL-6, som kan være mediert av aktivering av STAT3 og PI3K-signalering, er kritisk i tumor aggressivitet og prognose av kreft i munnhulen. Vi skisserte derfor de viktigste signalveier som er tenkt å knytte IL-6 og DNMT3b til munnhulekreft (Fig. 6).
I konklusjonen, betennelse og metylering er begge antas å spille sentrale roller i muntlig tumorgenese, imidlertid, inflammasjons drevet effekter på metylering trenge videre undersøkelser i denne sykdommen. Dette prosjektet etablert IL-6-DNMT3b aksen er sannsynlig å være viktig i prognosen for OSCC. Identifisering, utvikling og valg av molekylære mål er viktige i kreftterapi. Dataene støtter den nye hypotesen om at IL-6-DNMT3b aksen er en signifikant prediktor, og målretting DNMT3b kan representere en lovende strategi for behandling OSCC.
