Abstract
microRNAs (mirnas) er små, ikke-kodende RNA som er kritiske regulatorer av ulike sykdommer. MikroRNA-20a (MIR-20a) har tidligere betydelig endret i en rekke kreftformer. I denne studien, vi har oppdaget sammenhengen mellom MIR-20a og utvikling av livmorhalskreft ved QRT-PCR, fant vi at uttrykket nivået av MIR-20a var signifikant høyere i livmorhalskreftpasienter enn hos normale kontroller, avvikende uttrykk for MIR ^ 20 ble korrelert med lymfeknutemetastaser, histologisk grad og svulst diameter. Deretter opprettet vi de stabile anti-MIR-20a livmorhalskreft cellelinjer av lentivirus. Inhiberte MIR-20a forhindret tumorprogresjon ved modulering av cellesyklus, apoptose, og metastaser in vitro og in vivo. TIMP2 og ATG7 ble vist seg å være direkte mål av MIR-20a, ved hjelp av luciferase assay og western blot. Disse resultatene indikerer at Mir-20a undertrykker spredning, migrasjon og invasjon av livmorhalskreft cellen gjennom målretting ATG7 og TIMP2. Våre resultater støtter involvering av MIR-20a i cervical tumorigenesis, spesielt lymfeknutemetastase. Vi foreslår at mirnas kan brukes som terapeutisk middel for livmorhalskreft
Citation. Zhao S, Yao D, Chen J, Ding N, Ren F (2015) MiR-20a Fremmer livmorhalskreft spredning og metastase In Vitro og in vivo. PLoS ONE 10 (3): e0120905. doi: 10,1371 /journal.pone.0120905
Academic Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 25 september 2014; Godkjent: 27 januar 2015; Publisert: 24 mars 2015
Copyright: © 2015 Zhao et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor saksdokumenter filene
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Guangxi Natural Science Foundation (No.2011GXNSFA018184 og 2013GXNSFBA019132), National Natural Science Foundation of China (No.81460398), og støttes av Guangxi Health Department (No.Z2013018). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste typen kreft hos kvinner over hele verden, som er en ledende årsak til kreft død, noe som resulterer i ca 300.000 dødsfall hvert år [1]. De fleste livmorhalskreftpasienter får standard strålebehandling og kjemoterapi. Men kliniske utfall variere betydelig. Ifølge verden, var det ca 500 000 nye tilfeller hvert år, 85% av de patologiske typer var plateepitelkarsinom. Selv om livmorhals cytologi screening fordeler mye i tidlig diagnose og tidlig behandling i de siste tiårene, livmorhalskreft sykelighet fortsatt høye, og det var flere og flere unge tilfeller nylig. Så mange forskere vie seg til å finne patogenesen og mer effektiv kreftbehandling. microRNAs (mirnas) er små ikke-kodende RNA på ca 21-25 nukleotider (NT) og fungere som post-transcriptional regulatorer av genuttrykk [2]. Disse små molekyler har blitt funnet gener involvert i forskjellige biologiske prosesser som celleproliferasjon, utvikling, differensiering, apoptose og andre til å regulere. Tallrike studier har vist at endringer i mirnas syntese i humane kreftformer er ofte relatert til tumor utvikling, progresjon og metastase [3]. Våre tidlige eksperimenter ved hybridisering arrays sammenlignet mikroRNA uttrykk profilen mellom normal cervical vev og livmorhalsen plateepitelkarsinom vev, 89 mirnas ble undersøkt, og MIR-20a ble oppregulert betraktelig. MiR-20a var kjent for å tilhøre den MIR-17-92 klynge, som er den mest omfattende studert klynge som har en onkogen funksjon [4]. I denne studien har vi fokus på MIR-20a som kan være et lovende utgangspunkt for å utvikle fremtidige miRNA-basert livmorhalskreftterapi.
Materialer og metoder
Etisk erklæringen
samtykke prosedyre og ledningsevne av denne studien ble godkjent av etikkomiteen i Guangxi Medical University. Studien ble utført i samsvar med de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Data ble samlet inn anonymt. Verbal informert samtykke ble innhentet fra alle fag, vitne, og formelt registrert for hver undersøkelse. Skriftlig samtykke for bruk av prøver for forskningsformål ble innhentet fra alle pasienter før operasjonen. Dyreforsøk ble utført i henhold til Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av det amerikanske National Institutes of Health, og studieprotokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Guangxi Medical University.
Pasienter og samples
cervical vevsprøver ble samlet inn fra avdeling for gynekologisk onkologi, den Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University mellom 2010 og 2011. Åtti livmorhalskreft prøver av International Federation of gynekologi og fødselshjelp (FIGO ) stageⅠ-ⅱA ble innhentet fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk behandling. Tjue prøver av stageⅡB-Ⅳ ble fikk fra cervical biopsi. Alle prøvene var plateepitelkarsinom. Ingen tidligere lokal eller systemisk behandling hadde blitt gjennomført på disse pasientene før operasjonen eller biopsi. LNM ble bekreftet hos pasienter i stadium Ⅰ-ⅡA som vi brukte drift for første behandling. Median alder for pasientene var 49 år med en rekkevidde fra 25 til 69 år. Normale livmorhals epitel prøver ble samlet inn fra 120 pasienter som hadde hysterektomi for godartet sykdom. Gjennomsnittsalderen for kontrollpersoner var 45 år, som strekker seg fra 33 til 57 år. Vevene ble frosset i flytende nitrogen umiddelbart etter kirurgisk fjerning og lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Kvantitativ Real-Time Polymerase Chain Reaction
RNA ble ekstrahert fra frosne ferske livmorhalskreft vev, normale cervical epitel vev og livmorhalskreftceller ved å miRcut miRNA isolasjon kit (Tiangen, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Den reverstranskripsjonsreaksjoner ble utført ved anvendelse av en MiraMasTM Kit (Bioo Scientific, USA), som inneholder poly (A) polymerase anvendt for polyadenylering av miRNA. QRT-PCR ble utført ved hjelp av en standard SYBR Grønn PCR kit (Takara, Japan) .De primere ble syntetisert (Shanghai GenePharma, Kina) som følger: MIR-20a videre primer: TAC GAT AAA GTG CTT ATA GTG CAG GTA G. U6 fremover primer: ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT. Universal reverse primer: GTC CTT GGT GCC CGA GTG. Den 20 ul PCR blandingen besto av 12,5 mL SYBR Grønn SuperMix, 3,5 mL RNase-fritt vann, en ul fremover primere, en fil revers primere, og 2 pl revers transkribert produkt. Reaksjonsbetingelsene var 40 amplifikasjons-cykler av 95 ° C i 3 minutter, 95 ° C i 12 s, og 62 ° C i 50 s ved bruk av en BIO-chromo4 (Bio-Rad, USA) kvantitativ Real-Time PCR System. U6 ble brukt som referanser for miRNAs. Hver prøve ble analysert i triplikat. Sammen terskel syklus (CT) -metoden ganger endring (2-ΔΔCT) ble brukt til å analysere relative endringer.
Cell Kultur
CC cellelinjer Siha, HCC94, C33A og Caski ble oppnådd fra sentralt laboratorium av Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University. Disse cellene ble holdt ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO2 i RPMI-1640 med 10% føtalt bovint serum.
etablere stabile anti MIR-20a cervikale kreftcellelinjer av lentivirus
de lentiviral vektorer med mirnas som var basert på MIR-20a rammeverket ble bygget av GeneChem Company (Shanghai, Kina). Kort sagt ble den dobbelt-trådede oligonukleotid som koder for anti-miRNA og negativ kontroll varmebehandlet og satt inn i den lineariserte eukaryote PFU-GW-009 vektoren (GeneChem). Alle disse vektorene ble bekreftet ved sekvensering. De recombinational vektorer og emballasjen vektorer (pHelper 1.0 og pHelper 2,0) (GeneChem) ble co-transfektert inn i 293T celler (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med Lipofectamine2000 (Invitrogen). Kultursupernatantene ble samlet opp ved 48 timer etter transfeksjon, konsentrert. Alle lentiviral vektorer uttrykt forbedret grønt fluorescerende protein (GFP), som er tillatt for fniste og måle deres infeksjon effektivitet i infiserte celler. Cellene ble delt i tre grupper, ifølge våre formål: a: uten infeksjon av virus (NC); b: infeksjon av kontrollvirus (NC-LV); c:.. infeksjon av anti-MIR-20a virus (anti-MIR-20a-LV)
Cellebiologi funksjon in vitro
Cellular levedyktighet analysen
kapasitet for cellulær proliferasjon ble målt med 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Tjuefire timer etter transfeksjon, 1 x 10
4-celler ble sådd på 96-brønners mikrotiterplate i 24, 48, 72 og 96 timer henholdsvis. Deretter ble cellene inkubert med 20 pl MTT (5 mg /ml, pH = 7,4) i 4 timer ved 37 ° C og 150 ul av dimetylsulfid ble tilsatt for å oppløse krystallene i 20 minutter ved romtemperatur. Optisk tetthet (OD) ble målt ved en bølgelengde på 490 nm. Alle forsøkene ble utført tre ganger og ble beregnet under anvendelse gjennomsnittlige resultater, som vi brukte for å trekke vekstkurver. Veksthemming ble beregnet som følger: (AC-AT) /AC x 100% (AC = absorbans verdi av NC og AT = absorbans verdi av den eksperimentelle gruppen)
Cell syklus analysen.. Celler ble fiksert i 70% etanol i 2 timer ved 4 ° C. Etter vasking med PBS, ble cellene behandlet med RnaseA (50 ug /ml) og farget med propidiumjodid (25 ug /ml) i 30 minutter ved 37 ° C. Prøvene ble analysert ved hjelp av en strømningscytometer og distribusjon av cellesyklusfaser ble fastsatt ved bruk Modfit programvare (BD Biosciences). Den proliferative indeksen ble beregnet som prosentandelen av celler i S /G2 /M-fase.
Cell apoptose analysen.
Cellene ble høstet og farget med annexin V-PE og 7AAD bruker Annexin V-PE Kit (Beckman) i henhold til produsentens protokoll og utsatt for flowcytometrisk analyse.
invasivt og migrering assay.
50.000 celler ble sådd inn i transwell innsatsen (Corning) supplert med 1640 med 10% serum. Undersiden av transwells ble fylt med 1640 med 20% serum. For sjele analysen Matrige l (BD Biosciences) ble sådd i transwell innsatsen og lov til å vokse til konfluens for en dag. 50.000 celler ble sådd inn i Transwell innsatser supplert med 1640 med 10% serum. Undersiden av transwells ble fylt med 1640 med 20% serum. Etter 24 timer ble membranene farvet ved anvendelse av hematoksylin-eosin-farging ble cellene tellet under det fluorescerende mikroskop. Dette forsøk ble utført tre ganger uavhengig av hverandre i duplikater.
kolonidannelse assay.
Omtrent 500 celler ble anbragt i en frisk 6-brønns plate for en annen 12 timer og holdt i RMPI 1640 inneholdende 10% FBS i 2 uker. Kolonier ble fiksert med metanol og farget med 0,1% krystallfiolett i 20% metanol i 15 min. Cellene ble telt under fluorescerende mikroskop. Dette eksperimentet ble utført uavhengig tre ganger i duplikater.
In vivo-analyser for tumor spredning
Tjuefire seks uker gamle som veier 19-21 g immunodeficient beige /nude /xid nu /nu kvinnelig musene ble kjøpt fra Guangxi Medical University, og holdt under patogen-frie forhold med bestrålt chow. I vårt eksperiment, 2 x 10
6 celler fra forskjellige grupper i 0,2 ml PBS ble injisert subkutant inn i bagasjerommet av 24 mus, som fører til dannelse av en tumor per dyr. 0,2 ml kloralhydrat ble intraperitonealt injisert til å ta fluorescerende bilder etter anestesi når diameteren av svulsten var 2 cm. Tegn vekstkurven. Tumorvekst ble overvåket av tumorvolumet, som ble beregnet som beskrevet:. Volum (mm
3) = bredde
2 (mm
2) × lengde (mm) /2
Western blot
Cellulære proteiner ble fremstilt ved anvendelse av cellelyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl, 2 mg /ml aprotinin, 5 mg /ml leupeptin, 2 mg /ml pepstatin, 1 mM DTT, 0,1% SDS og 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid). Like mengder av protein (50 pg) ble separert ved 10% SDS-PAGE og deretter overført til nitrocellulosemembraner (NY, USA) ved elektroblotting. Membranene ble blokkert med 5% BSA i TBST (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl og 0,05% Tween 20) i 1 time, og deretter inkubert med primære antistoffer (Santa Cruz) over natten ved 4 ° C før påfølgende inkubasjon med andre antistoff (BD) i 1 time ved 37 ° C. Protein ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence reagens (Santa Cruz).
Luciferase assay
Mir-20a bindingsseter fra 3 «UTR ATG7 /TIMP2 eller mutant 3» UTR ble klonet inn i pGL3 reporter luciferase vektor (GeneChem). For reporter analysen, 100 nM MIR-20a etterligne eller tak miRNA ble ko-transfektert med 0,1 ug av den pGL3-3’UTR villtype eller mutante Plasmid-DNA inn i Siha-celler i 96-brønners plater ved bruk av Lipofectamine 2000. Luciferase-aktiviteten ble målt 48 timer posttransfection som beskrevet tidligere.
Statistisk analyse
Alle data ble behandlet ved hjelp av PASW Statistikk 16. data ble presentert som gjennomsnitt ± SEM. ved hjelp av t-tester for to-gruppesammenligninger. Selv om resultatene ikke viser normalfordeling, valgte vi å analysere data med ikke-parametriske metoder. (Mann-Whitney U-test mellom to grupper og Kruskal-Wallis test H for tre eller flere grupper). En
P
verdi mindre enn 0,05 er ansett som statistisk signifikant.
Resultater
MiR-20a er oppregulert i livmorhalskreft
Ved hjelp av en qRT- PCR-metoden, MIR-20a-nivåer ble påvist i 100 livmorhalskreft vev og 120 normale cervikale vev, så vel som cervical cellelinjer. Av de 100 pasienter med kreft i livmorhalsen, kan dataene rapportert i fig. 1A viser MIR-20a er definitivt oppregulert i svekket vev med en median på 6,92, noe som tyder på at økningen av MIR-20a ble en hyppig hendelse i livmorhalskreft. Pasienter med oppregulert uttrykk for MIR-20a tendens til å ha LNM (
P
= 0,001) som i fig. 1B, økt kreft størrelser (
P
= 0,013, Mann-Whitney U-test), avansert stadium (
P
= 0,004, Kruskal-Wallis H test), og avanserte histologisk grad (
P
= 0,027, Mann-Whitney U-test) av livmorhalskreft. Disse resultatene tyder på at Mir-20a kan spille en avgjørende rolle i livmorhalskreft metastase og progresjon
A:. MiR-20a ble målt ved QRT-PCR. Data ble presentert som log10 av fold-endring. Mann-Whitney testen ble utført for å undersøke forskjellen mellom normale kontroller og livmorhalskreftpasienter, ble Kruskal-Wallis H test som brukes til å definere forskjellen mellom stadium I-IV av livmorhalskreftpasienter. B: Vi sammenlignet ekspresjonen mellom pasienter som hadde lymp metastaser, eller ikke i det samme trinn. C: Uttrykket nivåer av MIR-20a ble oppdaget av QRT-PCR i livmorhalskreft cellelinjer (Siha, HCC94, C33A og Caski).
P
-verdi. 0,05 ble betraktet som signifikant
Dessuten ble uttrykket nivåer av MIR-20a oppdaget av QRT-PCR i livmorhalskreft cellelinjer (Siha, HCC94, C33A og Caski) (fig. 1C) som var høyest i Siha cellelinje.
MiR-20a letter livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP vekst og metastase in vitro
merker seg sammenhengen mellom oppregulert MIR-20a nivåer og livmorhalskreft progresjon, undersøkte vi effekten av MIR-20a på vekst, migrasjon og invasjon evnene til livmorhalskreft cellelinjer. Siha cellelinjen ble infisert med enten anti-MIR-20a eller kontroll lentivirus og etablere stabil anti-MIR-20a Siha cellelinje (Fig. 2A). Sammenlignet med uttrykk for kontrollgruppen, MIR-20a var signifikant nedregulert i Siha cellelinjen etter infeksjon med anti-MIR-20a-LV (Fig. 2B). Cellene ble delt i tre grupper, ifølge våre formål: a: uten infeksjon av virus (NC); b: infeksjon av kontrollvirus (NC-LV); c. smitte av anti-MIR-20a virus (anti-MIR-20a-LV)
A: GFP merking flowcytometri analyse indikerte at prosent av GFP positive celler var ca 97% i stabil lentivirus-smittet Siha cellelinje. B:. MiR-20a ble lavere uttrykt i stabil anti-MIR-20a Siha cellelinje mens uttrykket nivået av MIR-20a var fortsatt svært høy i celler infisert med negativ kontroll
Neste, cellevekst egenskaper, cellesyklus, klone formasjon, celle migrasjon, vedheft, ble celleinvasjonsforsøk utført. Vekstkurver viste at smitte av anti-MIR-20a livmorhalskreft cellelinje avtatt (Fig. 3A). Strømningscytometri viste gjennomsnittet av G1 periode av celler i den anti-MIR-20a-LV gruppe er 69,6%, mens den tilsvarende kontrollgruppen var 55%, er det for å redusere spredning syklus av celler (fig. 3B). Apoptotisk hastigheten ble økt og nådde forskjeller statistisk signifikans i hver gruppe (
P
0,001) (Fig. 3C). Migrasjon, heft evne til invasjon i livmorhalskreft celle ble også oppdaget, kunne MIR-20a lette metastasering (
P
0,01) (Fig. 3D og 3E). Kolonien dannelsen sats på de to gruppene, var ingen signifikant forskjell (
P
0,05) (Fig. 3F). Som forventet, down-uttrykk for MIR-20a undertrykte betydelig celle spredning, migrasjon og invasjon evner
A:. Nedregulert MIR-20a betydelig hemmet celledeling i Siha celler ved MTT-analyse. B: Celle syklus bestemt ved PI farging strømningscytometri. C: Celle apoptose detektert av Annexin V-PE kombinert merking flowcytometri, ble apoptotisk hastighet øket, og nådde forskjeller statistisk signifikans i hver gruppe. D, E representerer resultatene av celle invasjon og migrasjon på tvers av membranen med eller uten Matrigel, noe som viste at anti-MIR-20a reduserte cellemigrering og invasjon evne. F: The Colony dannelseshastigheten av disse tre gruppene hadde ingen signifikant forskjell
MiR-20a Øker tumorvekst in vivo
Basert på de observerte nedgang i trekk, invasive og proliferativ atferd. i Siha celler infisert med anti-MIR-20a-LV, neste undersøkte vi rollen som MIR-20a in vivo. Vi subkutant inokulert hårløse mus med like tall (1 × 10
6 celler per mus) av Siha celler med tvungen uttrykk for MIR-20a eller NC, Tumor forekomsten ble vurdert hver femte dag, og svulster dukket opp i alle mus. Resultatene viste at lentivirus mediert anti-MIR-20a i betydelig grad kan undertrykke veksten av livmorhalskreft xenotransplantater i nakne mus (Fig. 4)
A.: Humant livmorhalskreft modell transplantert subkutant i nakne mus ble fastslått. Ved slutten av forsøket, ble tumorvolumet målt for å trekke vekstkurve av forskjellige grupper. Ved subkutan tumor modell dimensjonen av tumoren i forsøksgruppen er mindre enn i kontrollgruppen. Det var en signifikant forskjell mellom hver gruppe (
P
0,01). B:. Bilder av svulster i hver gruppe
MiR-20a Direkte Målsettinger og Hemmer ATG7 og TIMP2
For å forstå hvordan MIR-20a forenkler livmorhalskreft vekst og metastasering, brukte vi tre algoritmer (Targetscan, Pictar og Miranda) for å identifisere MIR-20a mål i menneskelivmorhalskreft. Av disse målgener som ble spådd av alle tre algoritmer (Fig. 5A), autofagi relatert protein 7 (ATG7) og vev hemmere av metalloproteinase 2 (TIMP2) tiltrakk seg oppmerksomheten umiddelbart som de har vært innblandet i tumorigenesis og metastasering. Vi klonet ATG7 og TIMP2 3′-UTR inn en luciferase reporter vektor. Luciferase assay viste at Mir-20a direkte bundet til ATG7 og TIMP2 3′-UTR, og der det bemerkelsesverdig redusert luciferasepreparater aktiviteter (Fig. 5B). Men mutasjon av de antatte MIR-20a områder i 3′-UTR av ATG7 og TIMP2 avskaffet luciferase respons til MIR-20a. For å vurdere effekten av MIR-20a på ATG7 og TIMP2 uttrykk direkte, utførte vi western blot analyse. Som vist i fig. 5C, knockdown av MIR-20a, gjennom smitte av anti-MIR-20a-LV, i Siha celler økt ATG7 og TIMP2 proteinnivåer. Samlet utgjør disse resultatene indikerer ATG7 og TIMP2 er direkte nedstrøms mål for Mir-20a i Siha celler. Resultatene ovenfor bedt oss om å undersøke om MIR-20a undertrykker livmorhalskreft vekst og metastasering gjennom undertrykke ATG7 og TIMP2 uttrykk
A:. Spådd følge sammenkobling av målområdet og miRNA av Targetscan, Pictar og Miranda. B: vises Luciferase aktivitet en betydelig nedgang følgende MIR-20a håndhevet uttrykk sammenlignet med negativ kontrollgruppe. C:. Western blot analyser viste knockdown av MIR-20a, gjennom smitte av anti-MIR-20a-LV, i Siha celler økt ATG7 og TIMP2 proteinnivåer
Diskusjoner
gruppen har vært fokus på den molekylære mekanismen for livmorhals plateepitelkarsinom utvikling de siste årene, spesielt viet til etterforskningen av vekst og metastasering. Lymfeknutemetastase (LNM) er den mest viktigste prognostiske faktoren av pasientene med Stage IB eller IIA, fem-års overlevelse for pasienter avtar dramatisk fra ca 80-95% hos pasienter uten lymfeknutemetastaser til ca 50-65% i pasienter med positive lymfeknuter. Derfor forventet vi at dereguleringen av microRNAs kan lette avansert fremdriften av livmorhals plateepitelkarsinom. Zhang J et al belyse negative tilbakemeldinger regulering av NF-kB /MIR-130a /TNF-α /NF-kB i livmorhalskreft og kan gi innsikt i kreftutvikling av livmorhalskreft [5]. Wen SY, fant et al at MIR-506-ekspresjon ble nedregulert hos omtrent 80% av livmorhalskreft prøvene undersøkt og inverst korrelert med ekspresjonen av Ki-67 [6]. Blant onkogene mirnas, er en av de beste-preget MIR-17-92, en polycistronic miRNA klynge, betegnet som OncomiR-en [7]. Forløperen transkripsjon inneholder seks tandem stilk-løkke hårnål strukturer som til slutt vike seks modne mirnas: Mir-17, MIR-18a, MIR-19a, MIR-20a, MIR-19b-1 og MIR-92-1 [8]. Spesielt er MIR-17-92 plassert ved 13q31.3, en region forsterkes i flere hematopoetiske ondartede sykdommer og faste tumorer, inkludert diffus B-celle lymfomer, follikulære lymfomer, Burkitt-lymfoma, og lungekarsinom [9].
Nyere funn tyder på at disse mirnas er integrerte komponenter av molekylære veiene som regulerer tumorutvikling og tumor vedlikehold, har virkningene av MIR-20a overekspresjon blitt undersøkt i flere dyremodeller, humane kreftformer, og cellekultursystemer for sin evne til å regulere en rekke cellulære prosesser som favoriserer malign transformasjon [10-11]. Disse studiene som helhet avdekket at Mir-20a funksjoner pleiotropically under både normal utvikling og ondartet transformasjon for å fremme spredning, hemme differensiering, forsterke angiogenese, og opprettholde celle overlevelse. Men potensialet funksjonen til dette mikroRNA i menneskelig livmorhals plateepitelkarsinom progresjon har noen rapporter. I denne studien, er vi interessert i den potensielle rolle MIR-20a i ondartet progresjon av Siha celler.
I denne studien fant vi at Mir-20a var ofte oppregulert i vevsprøver. Dermed antok vi at Mir-20a kan være en roman svulst onkogen miRNA og dens deregulering kan innebære avanserte fremdriften av kreft hos mennesker. Deretter undersøkte vi funksjonen til MIR-20a i Siha celler. Etablere stabile anti-MIR-20a livmorhalskreft cellelinjer av lentivirus, og forut for cellevekstegenskaper, cellesyklus, klone dannelse, cellemigrasjon, adhesjon og invasjon eksperimenter. Modellen av down-uttrykt MIR-20a livmorhalskreft transplantater i hårløse mus ble også etablert som undersøke mulighetene for anti-MIR-20a in vivo. Da har vi funnet at hemmet MIR-20a forhindret tumorprogresjon ved å modulere cellesyklus, spredning, apoptose, og invasjon. Vekstkurver viste at smitte av anti-MIR-20a livmorhalskreft cellelinje avtatt. Modellen av down-uttrykt MIR-20a livmorhalskreft transplantater i hårløse mus ble etablert, viste resultatene at lentivirus mediert anti-MIR-20a i betydelig grad kan undertrykke veksten av livmorhalskreft transplantater i nakne mus.
Vi videre karakterisert ATG7 og TIMP2 som funksjonelle mål for Mir-20a etter luciferasereportergenet analyser og western blot analyse, henholdsvis. Autophagy leverer cytoplasmatiske komponenter til lysosomer for degradering og gjenvinning av nedbrytningsproduktene, slik som aminosyrer, karbohydrater og lipider som benyttes for å syntetisere nye proteiner og organeller, eller metaboliseres til å levere energi [12]. Autophagy er intimt forbundet med eukaryote celledød og apoptose. Faktisk i noen tilfeller de samme proteinene kontrollere både autofagi og apoptose. Apoptotisk signale kan regulere autofagi og omvendt autofagi kan regulere apoptose. Det er blitt foreslått at «autophagic celledød» er en annen form for «aktiv» programmert død [13]. ATG7 er en av hoved regulatorer av autophagy prosessen, er ansvarlig for to viktige reaksjoner som er involvert i dannelse og autophagosome i vesikkel-progresjon [14]. Dessuten var det allerede etablert at Atg7 – /- knockout mus dør innen en dag fra fødselen og viser redusert valp størrelse, på grunn av en svekket autofagi vei [8]. Yoshihiro Inami, et al fant at tap av Atg7 i muselever fører levercelleadenom [15]. Gjennom bruk av forsterknings-eller-lose molekyler, vi demonstrert at MIR-20a var i stand til å modulere autofagi varierende endogene ATG7 ekspresjonsnivåer, og denne effekt ble formidlet via en MIR-20a konsensussekvensen som finnes i den 3′-UTR av genet .
Under prosessen med tumorinvasjon, essensielle trinnene omfatter nedbrytning av basalmembraner og remodellering av den ekstracellulære matriks (ECM) av proteolytiske enzymer så som matriks-metalloproteinaser (MMP) under regulering av vev inhibitorer av metalloproteinaser (TIMPs ). MMP’er, særlig MMP-2 og MMP-9, er nøkkelenzymer som er kjent for å degradere komponentene i området ECM i løpet av kreft invasjon og metastase [16]. Beregnings prediksjon av miRNAtarget nettsider foreslo TIMP2 kanskje målet for MIR-20a, som ble bekreftet av westernblot og luciferase assay også.
Konklusjoner
Våre resultater tyder på at Mir-20a uttrykk kan være relatert med ondartet prosessen med livmorhalskreft, spesielt invasjon og metastasering ved å målrette ATG7 og TIMP2. Storskala og langsiktige oppfølgingsstudier er nødvendig for å bekrefte betydningen av MIR-20a i livmorhalskreft. Mirnas kan være et attraktivt mål for terapeutisk intervensjon.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. . Vektorkart, En: Lentivirus vektorkart; B pGL3 promotervektor kartet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120905.s001 plakater (DOC)
S2 Fig. Lentivirus Vector sekvense resultater
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120905.s002 plakater (DOC)
S1 datasett. . Target gensekvenser ved kjemisk syntese
Begge sider av de kodende sekvensene var Xbal restriksjonsenzym kutte områder, merkede soner ble binging nettsider
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120905.s003 plakater (DOC)
S1 Table. Sammenhengen mellom uttrykket av MIR-20a med clinicopathological funksjoner hos pasienter med livmorhalskreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120905.s004 plakater (DOC)
S2 Table. OD verdi etter infeksjon (MTT)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120905.s005 plakater (DOC)
S3 Table. Hemming av vekst av Siha transplantater i hårløse mus med anti-MIR-20a-LV
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120905.s006 plakater (DOC)
