Abstract
Interleukin-26 (IL-26) er en av de cytokiner utskilt av Th17 celler hvis rolle i humane tumorer er fortsatt ukjent. Her, undersøkte vi uttrykket og potensielle rolle av IL-26 i human magekreft (GC). Uttrykket av IL-26 og tilhørende molekyler som IL-20R1, STAT1 og STAT3 ble undersøkt ved real-time PCR og immunohistochemisty. Virkningene av IL-26 på celleformering og cisplatin-indusert apoptose ble analysert ved BrdU samarbeid analyse og PI-Annexin V co-farging, respektivt. Lentiviral mediert siRNA ble brukt til å utforske sin virkningsmekanisme, og IL-26 relaterte signale ble analysert ved western blotting. Menneske GC vev viste økt nivåer av IL-26 og tilhørende molekyler og aktivering av STAT3 signalering, mens STAT1 aktivering ikke signifikant forskjellig mellom GC og normal mage vev. Dessuten, IL-26 ble først fremstilt etter Th17 og NK-celler. IL-26 fremmet proliferasjon og overlevelse av MKN45 og SGC-7901 magekreftceller på en doseavhengig måte. Videre ble IL-20R2 og IL-10R1, som er to viktige reseptorer for IL-26 signalisering, uttrykt i begge cellelinjer. IL-26 aktivert STAT1 og STAT3 signale; imidlertid oppregulering av ekspresjonen av Bcl-2, Bcl-xl og c-myc indikerte at effekten av IL-26 medieres av STAT3 aktivering. Knockdown av STAT1 og STAT3 uttrykk antydet at proliferative og anti-apoptotiske virkninger av IL-26 er mediert ved modulering av STAT1 /STAT3 aktivering. I sammendraget, forhøyede nivåer av IL-26 i menneskelig GC fremme spredning og overlevelse ved å modulere STAT1 /STAT3 signale
Citation. Du W, Tang Q, Zhang C, Wu J, Gu C, Wu Z, et al. (2013) IL-26 Fremmer spredning og Survival of Human Gastric kreftceller ved å regulere Balance of STAT1 og STAT3 aktivering. PLoS ONE 8 (5): e63588. doi: 10,1371 /journal.pone.0063588
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 11 oktober 2012; Godkjent: 02.04.2013; Publisert: 21. mai, 2013
Copyright: © 2013 Du et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation (81170415 for XC) og Jiangsu-provinsen Key Provincial Talenter Program (RC2011079 for QT og RC2007056 for XC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden. GC er vanskelig å kurere selv i vestlige land, fordi det ofte ikke oppdages før de avanserte stadier av sykdommen [1]. Selv om en rekke faktorer er forbundet med utvikling og progresjon av GC, en kobling mellom kronisk gastrisk inflammasjon som atrofisk gastritt forårsaket av Helicobacter pylori, og risikoen for GC har blitt tydelig i de senere år [2]. Kronisk inflammasjon som fører til GC er en lang og komplisert prosess som skjer i løpet av mange år, og er karakterisert ved inflammatorisk skade på mageslimhinnen, cytokin-induserte DNA-syntese og celle-proliferasjon, hyperplasi og karsinogenese [3].
assosiasjon mellom kronisk inflammasjon og immunsystemet har blitt godt undersøkt, og lymfocytter er de viktigste mediatorer av inflammasjon-promo karsinogenese [4]. Th17-celler er en ny type av T-lymfocytter som uttrykker RORγT og utskiller forskjellige cytokiner, inkludert IL-17A IL-17F, IL-21, IL-22 og IL-26. Differensieringen av Th17 celler reguleres av flere cytokiner, inkludert IL-1β, IL-6, IL-23, tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), og transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) [5], [6] . Nyere kliniske studier viste at Th17 celler kan være nært knyttet til H. pylori forbundet patologi og karsinogenese av GC [7], [8], [9], [10]. Selv om flere Th17 relaterte cytokiner er blitt studert, er lite kjent om interleukin-26 (IL-26) i forhold til gastriske tumorer.
IL-26 er et utskilt protein som fungerer enten som en monomer eller en homodimer. Den ble opprinnelig beskrevet av Knappe et al. [11] under navnet AK155. IL-26 har svak, men signifikant sekvenshomologi til IL-10, og dets kodede protein er derfor et medlem av IL-10-familien av cytokiner, som for det meste tilhører klassen-2 cytokin familien. IL-26 kan bli utskilt av primære T-celler, NK-celler og T-cellekloner og er vanligvis ko-uttrykt med andre viktige IL-10-relaterte cytokiner som IL-22 [12], [13]. IL-26 binder til en distinkt celleoverflate-reseptor-komplekset som består av IL-20R1 og 10R2 IL-kjeder, og dens funksjonelle aktiviteter er forskjellig fra de som formidles av IL-10. IL-20R1 fungerer som den spesifikke ligandbindende kjeden for IL-26 og IL-10R2 er en essensiell andre kjede for å fullføre monteringen av den aktive reseptor-komplekset. Nøytraliserende antistoffer mot enten IL-20R1 eller IL-10R2 kjedene kan blokkere induksjonen av IL-26 signalisering [12]. Når ferdig montert, den reseptorkomplekset gjennomgår en konformasjonsendring (e) som induserer aktivering av reseptor-assosiert Janus tyrosinkinaser, Jak1 og Tyk2, og påfølgende forbigående forankring og fosforylering av STAT proteinene, STAT1 og STAT3 [14], [15 ].
Som en Th17 relatert cytokin, rollen som IL-26 i tumorer er ikke undersøkt. Her undersøkte vi potensialet involvering av IL-26 i menneskelig GC for første gang, og utforsket sin pro-overlevelse og proliferativ effekter
in vitro
.
Materialer og metoder
pasienter
Denne studien inkluderte 60 pasienter med GC som gjennomgikk kirurgi 2006-2009 på First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing, Jiangsu provinsen (tabell 1). Alle forsøkene ble utført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Skriftlig informert samtykke for genuttrykk analyser i vev ble innhentet fra alle pasienter før operasjon eller endoskopisk undersøkelse. Studieprotokollen og samtykkeprosedyrer ble godkjent av etisk komité av First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. Diagnosen og iscenesettelse av magekreft ble utført i henhold til AJCC (TNM) Staging System.
Kvantitativ Real-time PCR
Reverse transkripsjonsreaksjoner ble utført ved hjelp av Super First-Strand Synthesis System (Invitrogen, CA) etter behandling av RNA-templater med DNase for å unngå genomisk DNA-forurensning. For å bestemme den relative nivået av cDNA i revers transkribert prøvene, ble real-time PCR utføres med Roche LightCycler480 (Roche Diagnostics IN, USA) ved hjelp av primere for IL-26 som følger: fremover, AAGCAACGATTCCAGAAGACC og omvendt, AAGTCCTCCACAAAGCGTATTTT, med en forsterket lengde på 175 bp. GAPDH ble anvendt som en kontroll med de følgende primere: forover, AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC; revers, GGGGTCATTGATGGCAACAATA; forsterket lengde, 102 bp. The real-time PCR reaksjonen ble utført i henhold til instruksjonene som er inkludert i SYBR® Premiks Ex Taq ™ kit (Takara, Japan). Data ble normalisert til GAPDH-nivåene i prøvene.
ELISA
IL-26-konsentrasjonen i serum av GC-pasienter og friske kontroller ble målt ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige sandwich-ELISA-sett (Biotang Inc., MA).
Western blot analyse
proteiner ble hentet fra MKN45, SGC7901 og deres STAT1 og STAT3 siRNA modifisert cellelinjer, og kvantifisert ved hjelp av et protein assay (Bio-Rad Laboratories, CA). Proteinprøver (30 ug) ble fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran. Immunoblotting ble utført ved hjelp av antistoffer mot IL-26, IL-20R1, IL-10R2, p-STAT3 (S727), STAT3, p-STAT1 (Y701), STAT1, BCL-2, BCL-XL, c-myc og α- tubulin (alle kjøpt fra Abcam, MN). Resultatene ble visualisert med en kjemiluminescerende deteksjonssystem (Pierce ECL Underlag Western blot deteksjonssystem, Thermo Scientific, IL) og eksponering for autoradiografi film (Kodak XAR film).
Immunohistochemistry (IHC)
vevene ble samlet opp og fiksert i 4% paraformaldehyd over natten ved 4 ° C, behandlet og skåret i 5 um tykke seksjoner. Immunhistokjemisk farging av delene ble utført med antistoffer mot IL-26, IL-20R1, p-STAT3 (S727), og p-STAT1 (Y701) ved anvendelse av teknikker beskrevet tidligere [16].
BrdU celleproliferasjonsanalyse
Dyrkede celler ble sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
4 celler /brønn i 96-brønners plater. Den celle-proliferasjon på 0, 12, 24, 48, 60 og 72 timer ble bedømt ved bruk av BrdU celleproliferasjonsanalyse kit. BrdU løsning (Cellesignalering Technology, MA) ble tilsatt til hver brønn i henhold til produsentens instruksjoner for 12 timer. Cellen formeringshastigheten ble bestemt ved å måle absorbansen ved 450 nm ved anvendelse av en datastyrt mikroplateleser.
Isolering og Dyrkning av humane GC infiltrerte leukosytter
Friske tumorvev ble vasket to ganger i RPMI 1640- . Fatty, bindevev og nekrotisk vev ble fjernet. Vevene ble kvernet i 1-2 mm biter i RPMI 1640, overført inn i 15 eller 50 ml koniske rør, og inkubert med tredobbelt enzymkutting medium inneholdende DNase (30 U /ml), hyaluronidase (0,1 mg /ml), og kollagenase (1 mg /ml) i 2 timer ved romtemperatur med forsiktig risting. Vevene ble resuspendert i 10 ml RPMI 1640 og filtrert gjennom en 70-mikrometer celle sil (BD Pharmigen). Celler fanget av silen ble plassert i individuelle brønner som inneholdt 1 ml av T-cellevekstmedium i en 24-brønners plate for ytterligere deteksjon ved strømningscytometri.
Th17 og NK-celleisolering, stimulering, og flowcytometrisk analyse
Th17-celler ble oppnådd ved
in vitro
stimulering av CD4-positive perifere mononukleære blodceller (PBMC), som ble isolert ved hjelp av strømningscytometri under de betingelser (20 ng /ml IL-1β, 20 ng /ml IL-6, 20 ng /ml IL-23, 5 ng /ml TGF-β, 5 ug /ml anti-IL-12, og 5 mikrogram /ml anti-IL-4) som er beskrevet tidligere [17]. NK-celler ble oppnådd ved bruk av en NK-celleisoleringssett innkjøpt fra Miltenyi Biotec (Kat. 130-092-657). Th17 og NK-celler ble opprettholdt
in vitro Hotell og stimulert med 100 ng /ml LPS og
H. pylori
lysatene, henholdsvis, og analysert ved hjelp av intracellulær cytokin farging.
For intracellulære cytokin farging ble cellene stimulert ved 37 ° C i 5 timer med en Leukocytt aktiverings Cocktail (BD Pharmingen). Cellene ble deretter farget med overflatemarkører, faste, og permeabilisert med IntraPre Reagens (Beckman Coulter), og til slutt farget med intracellulære markører. Data ble ervervet på en FACSVantage SE og analysert med Cellquest programvare. Fluorokromkonjugerte konjugert mAbs mot IL-26, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56 og RORγT ble kjøpt fra BD Pharmingen.
Cisplatin apoptose og flowcytometrisk analyse
analysert celler ble dyrket i fullstendig medium med 1 mg /ml cisplatin i 24 timer. Celler ble videre analysert ved flowcytometri (FACSCalibur ™; BD Biosciences, NJ). Bruke en PI /Annexin farging kit (BD Biosciences)
siRNA Design og Lentivirus Produksjon og Transduction
sirnas målretting STAT1 og STAT3 ble utformet og syntetisert av GenScript Co (Nanjing, Kina) som følger: siRNA rettet mot STAT1, GGACAAGGTTATGTGTATA; og siRNA rettet mot STAT3, GGACATCAGCGGTAAGACC. De syntetiserte sirnas ble subklonet inn i lentiviral vektor pLL3.7 av
Hapi Hotell og
XhoI plakater (New England Biolab, Storbritannia) sammen med kontroll siRNA og navngitte pLL3.7-cs, pLL3. 7-STAT1-siRNA og pLL3.7-STAT3-siRNA. Rekombinant lentivirus ble generert fra 293T celler [16]. De humane GC cellelinjer MKN45 og SGC7901 ble anskaffet fra Kaiji Biotech Co (Nanjing, Kina) og dyrkes i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt kalveserum, 100 U /mL penicillin og 100 U /mL streptomycin (Gibco , CA), og transdusert med lentivirus ved hjelp av polybren (8 ug /ml).
Statistical Analysis
resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av ved tre uavhengige eksperimenter. Sammenligninger mellom grupper ble utført med Mann-Whitney U test. Korrelasjonen av IL-26 ekspresjon og forskjellige kliniske karakteristika ble analysert ved anvendelse av Chi-kvadrat-test. P-verdiene 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
1.. Økt Aktivering av IL-26 og tilhørende STAT3 signale i Human Gastric Cancer
IL-26 uttrykk i menneskets magekreft ble undersøkt i 60 friske tumorvev og sammenkoblede tilstøtende normale mage vev fra 60 GC pasienter. Sanntids-PCR-analyse viste signifikant over-ekspresjon av IL-26 mRNA i human GC i forhold til normal gastrisk vev (P = 0,004, ved Mann-Whitney U-test) (figur 1A). Serum-IL-26-nivåer var også signifikant høyere hos pasienter GC enn hos friske kontroller (P = 0,0064, etter Mann-Whitney U-test) (figur 1B). Videre analyse av IL-26 protein uttrykk i 60 parafin innebygd vevsprøver viste positivt uttrykk i 47 GC prøver, og svakt positive (n = 14) eller negative (n = 46) uttrykk i tilstøtende normalt vev. Den IL-26-positive celler ble hovedsakelig lokalisert i ikke-parenchymale vev, som kan bestå av immunceller som omgir og infiltrere inn i kreft eller normal gastrisk vev. Videre kvantifisering av IHC flekker resultater med bilde-pro plus (ver 5.0) i fem tilfeldige felt per lysbilde viste at IL-26 uttrykk var betydelig høyere i GC vev enn i tilstøtende normalt vev (P = 0,0087, etter Mann-Whitney U test). Deteksjon og kvantifisering av ekspresjon av IL-20R1, en reseptor for IL-26, viste at det ble uttrykt ved betydelig høyere nivåer i humant GC enn i normalt vev (P = 0,0041, etter Mann-Whitney U-test). Aktiveringsstatusen til STAT1 og STAT3, som er viktige nedstrøms signale faktorer av IL-26, ble undersøkt ved IHC hjelp av spesifikke antistoffer mot de fosforylerte rester. En betydelig økning av p-STAT3 (S727) ble detektert i GC vev, mens det ikke noen statistisk signifikante forskjeller i p-STAT1 (Y701) nivåer ble påvist mellom menneskelige GC vev og normale vev (p = 0,0094 for STAT3 og p = 0,392 for STAT1 ved Mann-Whitney U-test) (figur 1C, D)
A:. IL-26-mRNA-ekspresjon i humane magekreft (GC) (n = 60) og tilstøtende normale vev (n = 60) som detekteres real-time PCR. Dataene i A representerer mRNA-ekspresjon relativt til GAPDH, uttrykt som gjennomsnitt ± SD. B: Påvisning av IL-26 i humant sera fra friske kontroller (n = 30) og GC-pasienter (n = 60) ved hjelp av ELISA. C: Representative bilde av ekspresjonen og fordeling av IL-26, IL-20R1 p-STAT3 (S727) og p-STAT1 (Y701) i humane vev GC, normale mage vev og negative kontroller farget med isotype IgG. De mikrofotografier ved høyere forstørrelse viser det spesifikke lokalisering av de forskjellige markører. D. Gjennomsnittlig integrert optisk tetthet (IOD) ble oppnådd ved å analysere fem felt for hvert lysbilde evaluert ved bilde-Pro Plus software (ver5.0) for IHC-farging av IL-26, IL-20R1 p-STAT3 (S727) og p- STAT1 (Y701) i menneskelig GC og normal mage vev. Statistiske analyser i tallene A, B og D utført med Mann-Whitney U-test.
Analyse av sammenhengen mellom IL-26 uttrykk og clinicopathological funksjoner viste statistisk signifikant sammenheng mellom IL-26 uttrykk og tumorstørrelse og
H. pylori
infeksjon (tabell 1).
2. Th17 og NK-celler er de viktigste Cellular Kilder til IL-26 i Human Gastric Cancer
De cellulære kilder til IL-26 er primære T-celler, natural killer (NK) celler og T-celle kloner etter stimulering med spesifikke antigener eller mitogene lektiner [14]. Derfor, for å definere kilden til IL-26 i menneskelig GC, tumor infiltrerer leukocytter (Tīlss) ble isolert fra 20 friske menneske GC vevsprøver og co-farget med ulike markører. IL-26 ekspresjon var signifikant høyere hos CD3 positive celler (T-celler) fra humane GC Tīlss enn i T-celler avledet fra perifert blod mono-nukleær-celler (PBMC) (16,52 ± 9,32% for T-Tīlss vs. 3,78 ± 2,91% for T-PBMC, P 0.0001) som var i samsvar med resultatene av real-time PCR og IHC (figur 2A1, a2). Av det totale antall av T-celler, 13,5 ± 3,71% av CD4-positive T-celler uttrykte IL-26, mens bare 3,21 ± 2,61% av CD8 T-celler som var positive for IL-26 (figur 2A3, a4). Videre co-farging av IL-26 med CD4 og RORγt, en markør for Th17-celler ble observert, med 53,21 ± 16,82% av Th17-celler som uttrykker IL-26 i humane mage kreftprøver (figur 2A5, a6). Ekspresjon av IL-26 på NK-celler, en annen hyppigst rapporterte cellulær kilde av IL-26, ble analysert ved å måle antallet av CD3-, CD16 +, CD56 + -celler ko-farging med IL-26, noe som viste at 43,81 ± 19,44% av totale NK-celler utskiller IL-26 (figur 2a7, a8). Til sammen våre resultater viste at de viktigste cellulære kilder til IL-26 i menneskelig GC var Th17 og NK-celler og andelen av hver komponent er oppsummert i et kakediagram (figur 2A9 og a10).
a1 -a8: En representativ tilfelle av IL-26-ekspresjon i humane magekreft (GC) tumor infiltrerende leukocytter (n = 20) som detekteres ved hjelp av strømningscytometri ved samtidig farging med antistoffer mot CD4, CD8, RORγT, og CD3 + CD16 + CD56. a9. Sammenligning av den prosentandel av IL-26-positive celler i CD3-positive T-celler mellom PBMC som kontroller, CD3, CD4, CD8 positiv, Th17 og NK-celler avledet fra GC vev. Eksperimentet ble utført i tre eksemplarer. a10: En kakediagrammet for andelen av ulike komponenter bidra til IL-26 produksjon. b1-b4: Representative CD4 + T-celler,
in vitro
stimulerte Th17-celler og NK-celler isolerte undersøkt ved strømningscytometri. c1-c8: Flowcytometrisk analyse av IL-26 uttrykk i Th17 og NK-celler stimulert med LPS og
h.pylori
lysatene. c9: Sammenligning av IL-26-ekspresjon i hver gruppe. Forsøkene ble utført in triplo. Statistiske analyser i figur A9 og C9 ble utført ved anvendelse av Mann-Whitney U-test og sammenlignet med kontrollgruppen. ** P. 0,01
For å undersøke videre sekresjon av IL-26 i Th17 og NK-celler, PBMC ble samlet inn fra 20 friske frivillige og stimulert i henhold Th17 polariserende forhold. Den andre viktigste kilden til IL-26, NK-celler, ble hentet fra PBMC ved hjelp av en kommersiell menneskelig NK isolasjon kit. Karakteristikken av induserte eller isolerte Th17 og NK-celler ble verifisert ved intracellulær cytokin farging og ytterligere analysert ved flow-cytometri (figur 2b1, b2). Stimulering av Th17 og NK-celler med LPS og
H.pylori
lysater resulterte i en betydelig økning i utskillelsen av IL-26, noe som indikerer at IL-26 er et cytokin viktig reaksjon i magekreft (figur 2C).
3.
In vitro
proliferativ og Anti-apoptotiske Effekter av IL-26
Effekten av IL-26 ble videre undersøkt med en rekke
in vitro
studier utført i to menneske GC cellelinjer, MKN45 og SGC-7901. Effekten av IL-26 på celleformering ble undersøkt med BrdU incooperation analysen i celler behandlet med ulike konsentrasjoner av IL-26 (1, 10 og 50 ng /ml). ble påvist noen signifikante forskjeller i celleproliferasjon mellom ubehandlede celler og de som ble behandlet med 1 ng /ml IL-26. Men hastigheten av celleproliferasjon økt betydelig som reaksjon på 10 og 50 ng /ml IL-26 sammenlignet med den i ubehandlede celler (figur 3A). Videre vurdering av den anti-apoptotiske virkning av IL-26 ved hjelp av PI-AnnexinV ko-farging i celler behandlet med kjemoterapi stoffet cisplatin i forskjellige tids flekker viste at IL-26 hadde en signifikant anti-apoptotiske effekt selv ved en dose på 1 ng /ml. Den anti-apoptotiske effekt økes med økende konsentrasjoner av IL-26 til 10, og 50 ng /ml (figur 3b1, B2). Disse resultatene indikerer at IL-26 har proliferative og anti-apoptotiske virkninger på humane GC cellelinjer, som delvis forklarer sammenhengen mellom IL-26 ekspresjon og forskjellige kliniske karakteristika ble observert i kliniske studier. Imidlertid må det underliggende molekylære mekanismen som skal analyseres ytterligere
A:. Vekstkurve av magekreft (GC) cellelinjer MKN45 og SGC7901 i nærvær eller fravær av IL-26 ved de angitte konsentrasjoner, bestemt ved den BrdU samarbeid analysen. Eksperimentet ble utført i tre eksemplarer. B1: Analyse av cisplatin (1 pg /ml) indusert apoptose i MKN45 og SGC7901 celler og i celler behandlet med de angitte konsentrasjoner av IL-26 i 24 timer. Celler ble analysert ved PI-Annexin V co-farging. Ubehandlede MKN45 og SGC7901 celler ble brukt som kontroller. B2: Sammenligning av andelen av apoptotiske celler i forskjellige tids sted i hver gruppe (eksperimentene ble utført in triplo). Statistiske analyser i figurene A og B2 ble utført med Toveis ANOVA og sammenlignet med kontrollgruppen. ** P. 0,01
4. Den proliferative og anti-apoptotiske virkninger av IL-26 er forbundet med STAT3 aktiverings
Tidligere studier har vist at bindingen av IL-26 til dens reseptor-komplekset kan indusere hurtig aktivering av STAT3 og, i mindre grad, STAT1 [ ,,,0],12]. Derfor vi først bestemt ekspresjon av IL-26-reseptor-komplekset (IL-20R1 og IL-10R2) i MKN45 og SGC7901 celler og bekreftet at begge reseptorer var til stede i GC-cellelinjer for å bekrefte at transduksjon av IL-26-signaler var mulig (Figur 4A). Vi undersøkte deretter aktiveringen av STAT1 og STAT3 signalering og viste at fosforyleringen av S727 rest av STAT3 og Y701 av STAT1 stiger som respons på 10 ng /ml IL-26. IFN-γ (10 ng /ml) og IL-6 (30 ng /ml) ble anvendt som kontroller for aktiverings STAT1 og STAT3, henholdsvis (figur 4B). Basert på tidligere studier som viser at STAT1 og Stat3 signalveier ha motsatt effekt på tumordannelse [18] undersøkte vi nedstrøms mål for STAT1 og STAT3 å ytterligere belyse mekanismene bak proliferative og pro-overlevelse effektene av IL-26 mediert av STAT1 og STAT3 signalering i GC-cellelinjer. Våre resultater viste at IL-26 stimulering oppregulert ekspresjon av Bcl-2, Bcl-xl og c-myc, noe som tyder på at IL-26 har en sterkere effekt på STAT3 aktivering enn på STAT1 aliserte direkte eller indirekte (figur 4B). Dette resultatet bidrar også til vår forståelse av pro-overlevelse og proliferativ effekt av IL-26 i humane GC cellelinjer
A:. Uttrykk av IL-20R1 og IL-10R2 i MKN45, SGC7901, magekreft og normal mage vev oppdaget av vestlige-blotting. B: MKN45 og SGC7901 cellene ble stimulert med eller uten IL-26 (10 ng /ml), IL-6 (30 ng /ml) og IFN-γ (10 ng /ml), ble proteinene ekstrahert og analysert ved western blotting for STAT3 og STAT1 aktivering (fosforylert S727 for STAT3 og Y701 for STAT1) og nedstrøms protein uttrykk av Bcl-2, BCL-XL og c-myc.
5. Svulsten Fremme Effekt av IL-26 er avhengig av STAT1 /STAT3 Balance
Effekten av IL-26 på balansen mellom STAT1 og STAT3 aktivering ble undersøkt ved hjelp lentiviral mediert siRNA stanse av STAT1 og STAT3 i MKN45 og SGC-7901 celler. Den tilsvarende sirnas effektivt ned-regulert ekspresjon av STAT1 og STAT3 i begge cellelinjer (figur 5A). Celleformering ble bestemt ved BrdU samarbeid analyse i kontroll siRNA transfekterte celler og STAT1 og STAT3 siRNA behandlet GC-cellelinjer dyrket i media inneholdende 10 ng /ml IL-26. Knockdown av STAT3 ekspresjon signifikant hemmet veksten av MKN45 og SGC-7901 celler, mens STAT1 knockdown hadde ingen virkning på celleformering (figur 5b1, B2). Cisplatin-indusert apoptose ble bestemt ved PI-Annexin V ko-farging i de samme cellene opprettholdt i media med 10 ng /mL IL-26, og resultatene viste en signifikant reduksjon i den pro-overlevelse effekt av IL-26 i STAT3 knockdown cellene , mens ingen statistisk signifikante endringer i frekvensen av apoptose ble oppdaget i respons til STAT1 lyddemping (figur 5C1, C2). Resultatene indikerte at IL-26 har pro-overlevelse og proliferativ effekt på menneske GC cellelinjer formidlet i det minste delvis av STAT1 /STAT3 signale
A:. Uttrykk for STAT1 og STAT3 i MKN45 og SGC7901 celler transfektert med kontroll siRNA (angitt som MKN45cs og SGC7901cs) eller spesifikke sirnas rettet mot STAT1 og STAT3 som bestemmes av western blotting. B: Cellevekst av MKN45cs og SGC7901cs og STAT1 og STAT3 siRNA behandlede celler som bestemmes av BrdU samarbeid analysen. Forsøk ble utført in triplo. C1: Cisplatin (1 pg /ml) indusert apoptose av MKN45cs, SGC7901cs og STAT1 og STAT3 siRNA behandlede celler, som bestemt ved PI-Annexin V co-farging. B2: Sammenligning av den prosentandel av apoptose i hver gruppe (eksperimenter utført in triplo). Statistiske analyser i figurene B og c2 ble utført med Mann-Whitney U-test og sammenlignet med kontrollgruppen. ** P . 0,01
diskusjon
Tidligere studier har vist at IL-26 er ko-uttrykt med et annet viktig IL-10-relaterte cytokiner, IL-22, som også er utskilles av Th17-celler [19], [20]. Imidlertid har uttrykket og rollen som IL-26 i human kreft ikke undersøkt i detalj. Her, undersøkte vi for første gang ekspresjonen av IL-26 i humane vev og GC viste at IL-26 og beslektede molekyler slik som IL-20R1 er overuttrykt i humane vev GC.
IL-26 er co -expressed med IFN-γ og IL-22 i humane Th1- kloner, men ikke i Th2-kloner. Videre, IL-26 ko-uttrykkes med IL-17 og IL-22 ved hjelp av Th17-celler, en viktig undergruppe av CD4 + T-hjelperceller som er forskjellig fra Th1 og Th2-celler [12], [21]. I den foreliggende undersøkelse, ble IL-26 funnet å være produseres hovedsakelig av CD4-positive T-hjelperceller i human GC, hvorav omtrent halvparten av de Th17 cellene utskilte IL-26. Vi undersøkte en annen mulig cellulær kilde, NK-celler, som rapporteres å være relatert til tumorvolum og formidling i menneskelig GC [22], [23] og viste at NK-celler var også viktige kilder til IL-26 produksjon. Våre resultater er understøttet av en nylig studie hvor en ny undergruppe av CD56 + NKp44 + NK-celler ble funnet å ko-uttrykker IL-22 og IL-26, spesielt i respons til behandling med IL-23 [24]. Hughes
et al
. beskrevet en annen undergruppe av umodne NK-celler som ikke uttrykker CD56 eller NKp44, men uttrykker CD117 og CD161 og konstitutivt uttrykte IL-22 og IL-26 [25]. Videre er våre resultater viste for første gang at IL-26 fremmer proliferasjonen av humane GC-celler ved å påvirke balansen mellom STAT1 og STAT3 aktivering, og dermed gi nye bevis av forholdet mellom NK-celler og tumorvolum i human GC.
IL-26 er blitt rapportert å signalisere via en heterodimer reseptor kompleks sammensatt av IL-20R1 og 10R2 IL-kjeder. IL-20R1 fungerer som den spesifikke ligandbindende kjeden for IL-26 og IL-10R2 fungerer som en essensiell andre kjede for å fullføre sammenstillingen av den aktive reseptor-komplekset. Nøytraliserende antistoffer mot enten IL-20R1 eller IL-10R2 kjedene er i stand til å blokkere IL-26 signalisering. Når ferdig montert, den reseptorkomplekset gjennomgår en konformasjonsendring (e) som induserer aktivering av reseptor-assosiert Janus tyrosinkinaser, Jak1 og Tyk2, og den etterfølgende forbigående forankring og fosforylering av STAT proteinene, STAT1 og STAT3 [26], [27]. Som en av de nedstrøms signal faktorer av IL-26 er STAT3 oftest assosiert med tumorgenese, og det er også ansett som et onkogen. STAT3, som er ansett som en konvergenspunktet for en rekke onkogene signaliseringsreaksjonsveier, blir konstitutivt aktivert både i kreftceller og i immunceller i svulsten mikromiljøet [28], [29], [30]. Spesielt har STAT3 aktivering blitt rapportert i nesten 70% av faste og hematologiske tumorer, inkludert multippelt myelom, flere lymfomer og leukemi, brystkreft, hode- og halskreft, prostatakreft, eggstokkreft karsinom, melanom, nyrekreft, tykktarmskreft og thymus epiteltumorer [31]. STAT3 er kjent for å fremme celleproliferasjon og angiogenese, og spiller en rolle i tumorImmun-flukt, men det svekker også invasivitet og metastatisk potensial av tumorer. Våre resultater viste at STAT3 er aktivert i humane vev GC og dens aktivering kan være assosiert med overdreven IL-26 sekresjon. På den annen side ble ingen signifikante forskjeller påvist i den andre nedstrøms mål for IL-26, STAT1, mellom tumor og tilstøtende normale vev. STAT1 og STAT3 er tenkt å spille motsatt rolle i tumorigenesis [18]. STAT1 har en kompleks rekke funksjoner i både tumorceller og immunsystemet, og blir vanligvis betraktet som en tumor suppressor på grunn av sin rolle i veksthemming og apoptose fremme [32].
I sammendrag, vi viste at IL -26 fremmer cellevekst og forhindrer apoptose av humane magecancerceller ved å modulere balansen av STAT1 /STAT3 signalering, noe som indikerer at IL-26 kan være en verdifull prognostisk indikator og terapeutisk mål i magekreftpasienter.
