Abstract
Enhancer av Zeste homolog 2 (EZH2), den histon metyltransferase av Polycomb Undertrykkende kompleks to katalyser histon H3 lysin 27 tri-metylering (H3K27me3), er ofte oppregulert i kreft hos mennesker. I denne studien har vi identifisert tumor suppressor Slettet leverkreft 1 (DLC1) som et mål for undertrykkelse av EZH2-mediert H3K27me3. DLC1 er en GTPase aktiverende protein for Rho familie proteiner. Inaktivering av DLC1 resultater i hyper-aktivert Rho /ROCK signalering og er innblandet i aktin cytoskjelettet omorganisering for å fremme kreft metastasering. Av kromatin immunoutfelling analysen, viste vi at H3K27me3 ble betydelig anriket på DLC1 promoter-regionen fra et DLC1-nonexpressing HCC cellelinje, MHCC97L. Nedbryting av EZH2 i MHCC97L av shRNA redusert H3K27me3 nivå DLC1 promoter og indusert DLC1 gen re-uttrykk. Motsatt, forbigående overekspresjon av GFP-EZH2 i DLC1-uttrykke Huh7 cellene reduseres DLC1 mRNA nivå med en samtidig berikelse av EZH2 på DLC1 promoter. En invers sammenheng mellom EZH2 og DLC1 ekspresjon ble observert i lever, lunge, bryst, prostata, og ovarialcancer vev. Behandling av kreftceller med EZH2 små molekylære inhibitor, 3-Deazaneplanocin A (DZNep), restaurert DLC1 uttrykk i ulike kreftcellelinjer, noe som indikerer at EZH2-mediert H3K27me3 epigenetisk regulering av DLC1 var en vanlig mekanisme i kreft hos mennesker. Viktigere, fant vi at DZNep behandling hemmet HCC celle migrasjon gjennom å forstyrre aktin cytoskjelettet nettverk, noe som tyder på det terapeutiske potensialet i DZNep i målretting kreft metastasering. Til sammen vår studie har kastet mekanistisk innsikt i EZH2-H3K27me3 epigenetisk undertrykkelse av DLC1 og forfektet den betydelige pro-metastatisk rolle EZH2 via undertrykke tumor og metastasedempere
Citation. Au SL-K, Wong CC- L, Lee JM-F, Wong CM, Ng IO-L (2013) EZH2-mediert H3K27me3 er involvert i epigenetisk undertrykkelse av slettede i leverkreft 1 i kreft hos mennesker. PLoS ONE 8 (6): e68226. doi: 10,1371 /journal.pone.0068226
Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, USA
mottatt: 5 mars 2013; Godkjent: 28 mai 2013; Publisert: 27 juni 2013
Copyright: © 2013 Au et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av The University of Hong Kong SeedFunding Program for grunnforskning (200811159061 og 201011159045 til CMW), Hong Kong stipend~~POS=HEADCOMP Rådets generalsekretær forskningsfond (HKU 782411M til CMW) og Hong Kong stipend~~POS=HEADCOMP Rådet Collaborative Research Fund (HKU 1 /06C og HKU 7 /CRG /09 til IN). IN er Loke Yew professor i patologi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne hevder at medforfatter Chun-Ming Wong er en PLoS ONE Editorial Board medlem og dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Alle andre forfattere erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Innledning
Deregulering av oppstrøms epigenetiske regulatoriske proteiner fremmer epigenetiske forandringer og bidratt til avvikende stanse av tumorsuppressorgener i kreft hos mennesker [1]. Enhancer av Zeste homolog 2 (EZH2), den katalytiske subenhet av Polycomb Undertrykkende kompleks 2 (PRC2), er en av de mest vanlig opp-regulert epigenetiske regulatorer i forskjellige humane cancere [2-5]. EZH2 er et histon metyltransferase som spesifikt katalyserer histon H3-lysin 27 tri-metylering (H3K27me3), som i sin tur virker som et undertrykkende histone modifikasjon epigenetiske styre gentranskripsjon [6,7]. Oppregulering av EZH2 spiller en avgjørende rolle i ondartet progresjon og ble innblandet i kreft metastase [2]. EZH2 fungerer som et onkogen i ulike kreft hos mennesker hovedsakelig gjennom epigenetisk stanse av tumor og metastase suppressor gener, inkludert E-cadherin [8], RUNX3 [9], SLIT2 [10], DAB2IP [11], og KLF2 [12]. Nylig har vi også rapportert at EZH2 epigenetiske inaktiverer uttrykk for flere tumor og metastase suppressor microRNAs (mirnas), for eksempel MIR-125b og MIR-139 i human leverkreft (HCC), og dermed fremmer HCC tumorigenicity og metastasering [13]. Identifisere nye mål som forstummet etter EZH2 vil bedre avsløre de molekylære roller EZH2 i kreft metastase som vil være gunstig for utviklingen av chemotherapies rettet mot EZH2.
DLC1 ble identifisert som en
bona fide
tumor suppressor genet på en recurrently slettet kromosom regionen på kromosom 8p21 i HCC [14]. DLC1 er en Rho GTPase-aktiverende protein (RhoGAP) lokalisert på fokal adhesjon [15,16], og er spesifikk for regulering av aktiviteten av RhoA, B, C og CDC42 [17,18]. Den RhoGAP aktivitet DLC1 regulerer negativt disse Rho proteiner ved å stimulere deres iboende GTP hydrolytisk aktivitet, og dermed konverterer dem fra den aktive GTP-bundet tilstand til den inaktive BNP-bundet tilstand. Rho signalkaskade tillater god kontroll med mange biologiske prosesser slik som celleproliferasjon [19] og celle bevegelse [20] i normale celler. I løpet av malignitet utvikling, DLC1 /Rho veien er av særlig betydning på grunn av dets regulering på aktin cytoskjelettet relatert til kreft metastasering. Vi har vist at tap av DLC1 i HCC aktivert RhoA, som senere aktiveres sin nedstrøms effektor Rho-kinase (ROCK) for å fornye aktin cytoskjelettet nettverk for cellemigrering og invasjon [21,22]. Andre diverse tumorundertrykkende rollene til DLC1 omfatte formidling av caspase-3-avhengig apoptose i HCC modell [23], inhibering av VEGF-avhengig angiogenese i prostata cancer modell [24], og undertrykkelse av clonogenicity i flere typer kreft [25]. Nedregulering av DLC1 er ofte vist i et bredt spekter av humane ondartede sykdommer [26] og dens tap av ekspresjon er klassisk forbundet med kromosomal delesjon eller promoter-DNA hypermethylation (Yuan et al 1998; Wu et al 2000; Wong et al 2003; Kim et al 2003). I denne studien har vi gitt den første bevis for at DLC1 er en roman målet for undertrykkelse av EZH2-mediert H3K27me3. Vi viste videre inaktivering av EZH2 av 3-Deazaneplanocin A (DZNep) som gjen uttrykt DLC1 og bemerkelsesverdig avskaffet cytoskeletal omorganisering og hemmet celle migrasjon i kreftceller. Samlet våre funn tyder på at epigenetisk stanse av DLC1 er involvert i pro-metastatisk funksjon EZH2 i kreft hos mennesker.
Materialer og metoder
Cellelinjer
SMMC-7721 cellelinje (Shanghai Institute of Cell Biology) og Huh 7 cellelinje (japansk Cancer Research Bank) ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) -høy glukose. MHCC97L cellelinje (gave fra professor Z.Y. Tang fra Fudan University, Shanghai) [27] og Miha cellelinje (Shanghai Institute of Cell Biology) ble opprettholdt i DMEM-høy glukose supplert med natrium pyruvat. HeLa-cellelinje (American Type Culture Collection) ble holdt i DMEM-lav glukose. CNE2 (American Type Culture Collection) og HCT116 (gave fra Prof. B. Vogelstein, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD) [28] cellelinjer ble opprettholdt i Roswell Park Memorial Institute 1640 medium. Alt medium ble supplementert med 10% føtalt bovint serum og 100 enheter /ml penicillin og streptomycin.
Bisulfite modifikasjon og metylering analyse
Bisulfite modifikasjon av genomisk DNA ekstrahert fra cellelinjer ble utført ved anvendelse av EZ DNA metylering-Direct Kit (ZYMO Research, Orange, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Primere som brukes til forsterkning av DLC1 arrangøren etter bisulfite modifikasjon er: 5′-GTTTTTAGTTAGGATATGGT-3 «(fremover) og 5′-ACTTCTTTCTACACATCAAACAC-3′ (bakover) for BS-en region; og 5»-TAGAGTTATTAAGAAAAAGAAGGGA-3 «(fremover) og 5′-AAAACTAAAATATTTCCCCCAC-3» (bakover) for BS-2-regionen. PCR-produktet ble klonet inn TOPO TA Cloning vektor (Invitrogen, Carlsbad, California) og sekvensering av individuelle kloner ble utført av Sanger-sekvensering.
Chromatin immunoprecipitation (chip) assay
ChIP analysen ble utført ved hjelp av EZ ChIP kit (Millipore, Billerica, MA, USA) som tidligere beskrevet [13]. ChIP-grade antistoff mot H3K9me3 (ab8898; Abcam, Cambridge, MA, USA), H3K27me3 (07-449, Millipore, Billerica, MA, USA) og EZH2 (# 3147; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) ble brukt i analysen. Kanin IgG (Millipore, Billerica, MA, USA) eller muse-IgG (Millipore, Billerica, MA, USA) ble anvendt som negativ kontroll i analysen. Primere spenner -394nt til -325nt oppstrøms DLC1 transkripsjon start stedet ble brukt: 5′-CACCTC CGCCAAGTAAATGC-3 «(fremover) og 5′-CCGAAAAGTCGCCAACTATTG-3» (bakover). Kvantifisering av antistoff-bundet regionen ble gjort av qPCR utført med ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).
In vitro
behandling epigenetiske narkotika
DZNep (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). 5-Aza-dC (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) ble oppløst i 50% eddiksyre. TSA (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) ble oppløst i etanol. Løsningsmidlet i de kjemikalier som ble anvendt som mock i den tilsvarende behandling. For DZNep behandling, ble DZNep (1 um eller 10 uM) tilsatt til kulturmedium i 48 eller 72 timer. For 5-Aza-dC behandling, 5-Aza-dC (10 uM) ble påfylt daglig i 72 timer. For TSA behandling, TSA (0,25 mg /ml) ble bare lagt til cellene i de siste 24 timene av forsøket.
Cell migrasjon analysen
Før celle migrasjon analysen, 2×10
5 MHCC97L-celler ble behandlet med 1 uM DZNep i 48 timer. Mock og DZNep-behandlede celler (1×10
5) celler ble sådd ut i det øvre kammer til 8 pm-porestørrelse Transwell satt inn (Millipore, Billerica, MA, USA). Det nedre kammer inneholdt kondisjonert medium oppsamlet fra ubehandlede MHCC97L celler for å tiltrekke cellemigrering i 18 timer. Migrerte celler ble fiksert med metanol og farget med krystallfiolett. Tre uavhengige utsikt over Transwell membranen ble fotografert og antall migrerte celler ble talt.
immunfluorescens (IF) mikroskopi og Scanning elektronmikroskopi (SEM)
Før IF bildebehandling, 2×10
5 MHCC97L celler ble behandlet med 1 uM DZNep i 48 timer. Etter behandlingen mock og DZNep-behandlede celler (1×10
5) celler ble trypsinert og sådd ut på dekkglass i DZNep fritt kulturmedium i 24 timer. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS og permeabilisert med 0,2% Triton-X-100. Focal voksn ble farget med anti-paxillin antistoff (05-417, Millipore, Billerica, MA, USA). F-aktin ble visualisert ved farging med FITC-konjugert phalloidin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Kjerner ble kontra med DAPI (Calbiochem, San Diego, CA, USA). Hvis bildene ble sett og tatt med en Leica Q550CW fluorescens mikroskop (Leica, Wetzler, Tyskland). For SEM, ble mock og DZNep-behandlede cellene fiksert med 1% osmiumtetroksid og 2,5% glutaldehyde, etterfulgt av trinnvis etanol dehydrering. Etter trinnet med kritiske punkt tørr, ble objektglass montert på sølvpasta. Bilder ble skannet og fanget i henhold × 2000 forstørrelse ved hjelp av en Hitachi S-4800 FEG elektronmikroskop.
Statistisk analyse
Ikke-parametriske data og kontinuerlig para data ble analysert ved Mann Whiteny U test og
t
test, henholdsvis ved hjelp av GraphPad Prism versjon 5.00 (GraphPad Software, San Diego California USA). Testene ble betraktet som signifikant når
P
verdien var mindre enn 0,05.
Resultater
H3K27me3 nivå er forskjellig beriket på DLC1 promoter i udødelig normal hepatocytter og HCC cellelinjer
for å forstå hvilken rolle epigenetisk deregulering og DLC1 inaktivering i HCC, begynte vi med å analysere DLC1 promoter metylering status ved bisulfide sekvensering i udødelig normal hepatocytter cellelinje Miha og to HCC cellelinjer SMMC-7721 og MHCC97L. DLC1 arrangøren var helt unmethylated i Miha, heterogent og delvis metylert i MHCC97L, og helt metylert i SMMC-7721 (figur 1A). Metylering status for DLC1 i Miha og SMMC-7721 korrelert godt med sine DLC1 transkripsjonsnivået. Men i MHCC97L, hvorav DLC1 promoteren var bare delvis metylert, fullstendig stanse av DLC1 antydet at andre epigenetiske reguleringer kan være involvert (figur 1B). Vi har derfor en hypotese om at avvikende histone metylering kan bidra til DLC1 stanse i MHCC97L. Chromatin immunoprecipitation (chip) Analysen ble utført for å vurdere berikelse av transkripsjons undertrykkende histonmodifikasjonene, H3K9me3 og H3K27me3, på DLC1 promoter (figur 1C). Vi viste at H3K9me3 og H3K27me3 ikke var detekterbar i Miha, og dette var i samsvar med den transkripsjonelt aktive status for DLC1 genet i denne cellelinje. I motsetning til berikelse av både transcriptional undertrykkende H3K27me3 og H3K9me3 ble oppdaget ved DLC1 formidler av SMMC-7721 og MHCC97L celler. Interessant, H3K27me3 ble mer rikelig beriket i MHCC97L, sammenlignet med SMMC-7721. Denne observasjonen tyder på at i tillegg til den partielle DNA-metylering, H3K27me3 deltok også i epigenetisk lyddemping for fullstendig å inaktivere transkripsjonelt DLC1 genet i MHCC97L.
promotor-DNA-metylering og histon modifikasjon av DLC1 i HCC cellelinjer.
(A) Skjematisk diagram som viser CpG øy som ligger på DLC1 locus. DNA metylering status for 45 CpG dinukleotider (BS-1 regionen inkludert 35 CpG dinulceotides og BS-2 region inkluderte 10 CpG dinukleotider) var underlagt bisulfite sekvensering analyse. Miha viste fullstendig unmethylation, MHCC97L viste delvis metylering og SMMC-7721 viste fullstendig metylering. Åpen sirkel representerer unmethylated CpG dinukleotider og lukket sirkel representerer denaturert CpG dinukleotider. Hver kolonne representerer en enkelt klon ble sekvensert. (B) RT-PCR (øvre panel) og QRT-PCR (nedre panel) viser påviselig DLC1 mRNA uttrykk i Miha, men ikke i MHCC97L og SMMC-7721 celler. (C) Chromatin immunoprecipitation (chip) analyse kombinert med qPCR (qChIP) analyse avslørte den relative berikelse av H3K9me3 og H3K27me3 på DLC1 promoter-regionen i Miha, MHCC97L og SMMC-7721 celler. Fold av anrikning av ChIP analysen ble beregnet med henvisning til IgG kontroll etter normalisert med innspill DNA. Data er representert som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter.
Undertrykkelse av EZH2 indusert DLC1 reexpression i ulike menneskelige kreftcellelinjer
For å gi mer bevis for at EZH2-mediert H3K27me3 direkte regulerer DLC1 undersøkte vi om DLC1 uttrykk kan gjenopprettes på knockdown av EZH2. HCC cellelinjer stabilt uttrykker ikke-target-kontroll (NTC) eller EZH2 målretting shRNA (shEZH2) ble etablert i vår tidligere studie [13]. Ved stabil knockdown av EZH2 ble DLC1 transcriptionally indusert i MHCC97L (figur 2A). Tap av H3K27me3 på DLC1 promoteren ble observert i MHCC97L shEZH2 celler (figur 2B), hvilket indikerer at EZH2-mediert H3K27me3 bidrar til undertrykkelse av DLC1 i MHCC97L. I DLC1-uttrykke Huh7 celler, forbigående overekspresjon av GFP-EZH2 transcriptionally trykt DLC1 og en samtidig berikelse av EZH2 ble oppdaget på DLC1 promoter (figur 2C og D Supplerende Figur S1). I tråd med EZH2 knockdown modell, viste vi videre at behandling av tre-Deazaneplanocin A (DZNep), et lite molekyl EZH2 hemmer [29,30], betydelig redusert EZH2 proteinnivå og H3K27me3 nivå og indusert DLC1 re-uttrykk i MHCC97L celler (figur 2E). Enda viktigere, fant vi at EZH2-mediert DLC1 epigenetisk lyddemping ikke var begrenset til HCC. Re-ekspresjon av DLC1 ved DZNep behandling ble også observert i forskjellige kreftcellelinjer, inkludert den nasopharyngeal carcinoma-cellelinjen CNE2, kolorektalt karsinom cellelinje HCT116 og cervikal adenokarsinom-cellelinje HeLa (figur 2F). Ovennevnte funn indikerte at epigenetisk stanse av DLC1 av EZH2-mediert H3K27me3 er en vanlig mekanisme som deles av ulike kreft hos mennesker.
EZH2-mediert H3K27me3 var involvert i epigenetisk undertrykkelse av DLC1 i HCC og flere andre menneskelige kreftformer.
(A) DLC1 ble transcriptionally indusert ved stabil knockdown av EZH2 i MHCC97L celler. (B) qChIP analyse bekreftet uttømming av H3K27me3 berikelse på DLC1 arrangøren på EZH2 knockdown i MHCC97L celler. Data er representert som middelverdi ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. (C) DLC1 ble transcriptionally trykt i Huh7 celler etter forbigående overekspresjon av GFP-EZH2. (D) qChIP analyse viste en samtidig anrikning av EZH2 på DLC1 sin promoter locus på GFP-EZH2 overekspresjon i Huh7 celler. Data er representert som middelverdi ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. (E) EZH2 og H3K27me3 uttrykk ble redusert på 1 um DZNep behandling i 48 timer i MHCC97L celler (venstre panel). DMSO ble anvendt som uekte behandling. Pan H3 og α-tubulin var lasting kontroll av immunoblot. DZNep behandling transcriptionally indusert DLC1 uttrykk i MHCC97L som indikert av qPCR analyse (høyre panel). (F) Forskjellige humane kreftceller, inkludert nasopharyngeal carcinoma-cellelinjen CNE2, kolorektal karsinom cellelinje HCT116 og cervical adenokarsinom-cellelinje HeLa ble kontrollert for DLC1 re-ekspresjon ved DZNep behandling. Behandling av cellene med 10 uM DZNep reaktivert DLC1 uttrykk.
P
-verdier hentet fra
t
-test.
EZH2 og DLC1 uttrykk nivåer er omvendt korrelert i humane kreftvevet
For å gi kliniske relevansen av våre
in vitro
observasjoner, undersøkte vi DLC1 mRNA uttrykk i 25-paret primære HCC prøver og korrelert uttrykket nivå med våre tidligere EZH2 mRNA expression data [31]. I denne kohort av prøver, ble EZH2 signifikant oppregulert mens DLC1 var signifikant nedregulert i tumorøse vev enn de ikke-tumorøse vev (figur 3A). Interessant nok ble det observert en betydelig invers korrelasjon mellom EZH2 og DLC1 i en undergruppe av HCC prøver, hvori DLC1 promotoren ikke var stilnet av DNA-metylering [17] (figur 3B). Vi har også utvidet vår analyse til andre kreft hos mennesker ved å hente de microarray genuttrykk data på lunge [32], bryst [33], prostata [34], og eggstokkene [35] kreftformer fra Oncomine (www.oncomine.org) (Figur 3C ). I samsvar med funnene fra menneskelig HCC, samtidig DLC1 nedregulering og EZH2 oppregulering ble observert i disse kreftformer, noe som tyder på konsekvensene av EZH2 oppregulering i å kneble DLC1 uttrykk i ulike kreft hos mennesker.
Inverse sammenheng mellom EZH2 og DLC1 uttrykk i kreft hos mennesker.
(A) Tjuefem-sammenkoblede HCC prøvene ble undersøkt for EZH2 og DLC1 mRNA uttrykk av qPCR. EZH2 var signifikant oppregulert i HCC tumorous (T) vev enn ikke-tumor (NT) vev (venstre panel). I den samme prøve kullet, DLC1 var signifikant nedregulert i HCC sammenlignet med NT-vev (høyre panel).
P
verdier fra Wilcoxon matchet par test. (B) En invers korrelasjon ble observert mellom EZH2 og DLC1 uttrykk i en undergruppe av HCC prøver uten DLC1 promoter metylering. Expression nivå EZH2 og DLC1 i parvise HCC prøvene var representert ved ΔΔCt (T
(HPRT Ct -Gene av interesse Ct) -NT
(HPRT Ct – Gene interesse Ct)). Lineær regresjonsanalyse ble utført ved hjelp GraphPad Prism5 (La Jolla, CA, USA). (C) EZH2 oppregulering (venstre panel) og samtidig DLC1 nedregulering (høyre panel) ble gjennomgående observert i tumorøse vev av forskjellige typer kreft, inkludert lungekreft [32], bryst [33], prostata [34] og ovarie [35] kreft. Expression data og
P
verdier av DLC1 og EZH2 i flere krefttyper ble hentet fra Oncomine microarray database. Flytende stolpene ble vist for å illustrere den minste, midlere og maksimale normaliserte ekspresjonsenhetene i ikke-tumor (NT) og tumor (T) vev.
DLC1 er synergistisk til taushet ved H3K27me3 bare når dens promotor-DNA-er delvis metylert
Siden flere epigenetiske undertrykkende machineries er nært knyttet til å etablere en mindre ettergivende kromatin miljøet å undertrykke gentranskripsjon [36,37], forsøkte vi å demonstrere kombinatoriske effekten av ulike epigenetiske machineries i å kontrollere DLC1 uttrykk. MHCC97L og SMMC-7721-celler ble behandlet med DZNep sammen med 5-Aza-2’deoxycytidine (5-Aza-dC) henholdsvis og Trichostatin A (TSA), som er vel karakteriserte DNA-metylering og histon acetylering inhibitorer. Mens behandling av DZNep, 5-Aza-DC og TSA individuelt forhøyet uttrykk DLC1, kombinert behandling av tre medikamenter synergi restaurert DLC1 uttrykk i MHCC97L celler (figur 4A). Men den co-behandling i SMMC-7721 celler ikke viser ytterligere økning i DLC1 uttrykk i forhold til 5-Aza-dC alene (figur 4B), noe som tyder på at DNA metylering var en dominerende epigenetisk mekanisme for å kneble DLC1 i denne cellelinjen.
DLC1 uttrykk ble synergi restaurert på DZNep, 5-Aza-dC og TSA behandling i MHCC97L men ikke SMMC-7721 celler.
(A) combi epigenetisk medikamentell behandling i MHCC97L celler med 10 mikrometer 5-Aza-dC, 0,25 mg /ml TSA og 10 uM DZNep indusert den mest robuste DLC1 re-uttrykk enn noen enkel eller dobbel epigenetisk narkotika behandling. DZNep og 5-Aza-dC behandling ble utført i 72 timer. TSA ble enten tilsatt til celler alene eller sammen med andre legemidler i løpet av de siste 24 timene av behandlingen. Data er representert som middelverdi ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. (B) Tilsetning av DZNep i SMMC-7721 celler ikke lenger indusere DLC1 re-uttrykk sammenlignet med 5-Aza-DC og TSA dual behandling. Data er representert som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter.
DZNep behandling forstyrrer aktin cytoskjelettet å hemme HCC cellemigrasjon
DLC1 /Rho /ROCK veien er viktig for å regulere riktig cytoskjelettet ombygging og cellemotilitet. Våre rettssaken funn tyder på at EZH2 er involvert i å undertrykke DLC1 vi derfor videre testet om DZNep behandling kan undertrykke
in vitro
HCC migrasjon. DZNep behandling ved 1 uM i 48 timer, noe som viste minimal cytotoksisk effekt (Supplementary fig S2), effektivt hemmet cellemigrering i MHCC97L celler som demonstrert av Transwell migrasjonsanalyse (figur 5A). DZNep behandlede celler viste også bortfall av riktig aktin cytoskjelettet nettverk når undersøkt under scanning elektronmikroskop (figur 5B) og immunfluorescens farging (figur 5C). Disse celle morfologiske endringer forårsaket av behandling med DZNep sterkt lignet de av DLC1-indusert celle cytoskeletal kollaps og celle krymping [21], noe som tyder på at DZNep kan hemme cellemigrasjon via forstyrrende DLC1 /ROCK veien og forårsaket betydelig aktin cytoskjelettet uorden.
behandling av DZNep hemmet HCC celle migrasjon gjennom avbrudd av aktin cytoskjelettet.
(A) DZNep behandling effektivt avskaffet MHCC97L celle vandrende evne. Før cellemigrering analysen ble cellene behandlet med 1 uM DZNep i 48 timer. Mock og DZNep-behandlede celler ble deretter gjenstand for cellemigrasjon analysen bruker Transwell apparat. Representative bilder av tre uavhengige eksperimenter ble vist.
P
-verdier hentet fra
t
-test. (B) DZNep behandling trykkes dannelsen av filopodia (røde piler) og lamellipodia (blå piler) som illustrert ved scanning elektronmikroskopi. Bilder (2000x forstørrelse) ble tatt med en Hitachi S-4800 FEG elektronmikroskop. (C) DZNep behandling svekket aktin cytoskjelettet og forårsaket cellekrymping i MHCC97L celler. Stress fiber ble farget med FITC-konjugert phalloidin og fokale sammenvoksninger ble farget med anti-paxillin antistoff. Kjerner ble kontra med DAPI. Mock-behandlede celler viste organiserte bunter av stress fiber og godt festet paxillin. DZNep-behandlede celler krympet og mistet skikkelig aktin cytoskjelettet nettverk. Bilder (100x forstørrelse) ble tatt til fange av en Leica Q550CW fluorescens mikroskop (Leica, Wetzler, Tyskland).
Diskusjoner
En viktig pro-metastatisk rolle EZH2 i kreft er via epigenetisk stanse av tumor og metastase suppressor gener [8-12]. H3K27me3 er best karakteriserte EZH2-mediert histon modifisering i pattedyr epigenetisk system. I denne studien, gir vi bevis for at EZH2-mediert H3K27me3 er involvert i epigenetisk undertrykkelse av DLC1 under HCC utvikling. Interessant fra flere publiserte genomdata for Polycomb gruppe (PCG) target genet kartlegging i humane embryonale stamceller (HMS) celler, vi også lagt merke til at DLC1 er en kandidat PCG-regulert gen tidlig i utviklingsstadiet (Supplementary Figur S3). I Hes celler blir DLC1 promoteren okkupert av SUZ12, som er forbundet med EZH2 å danne PRC2 i mediering H3K27me3 og transkripsjon undertrykkelse [38]. I tillegg er DLC1 promoteren også merket med H3K27me3 [39] og H3K4me3 [40], som utgjør den bivalente kromatin signaturen til PCG målene [41]. Dette bivalent kromatin signatur, som involverer den H3K27me3-taushet H3K4me3-aktiverende histonmodifikasjonene, lar gener som er av viktighet og utviklings gener som kreves for stemness vedlikehold for å være klar i en klar-til-transkribere tilstand inntil differensiering [41,42]. DLC1 er avgjørende for embryoutvikling [43] og muligens har en rolle i avstamning spesifikasjon [44]. DLC1 knockout mus er embryonale dødelig [43]. Imidlertid er DLC1 overalt transkribert i voksen vev [14], noe som tyder på at PCG stanse effekten har blitt lettet i differensierte somatiske celler. Ved onkogenese, er det mulig at DLC1 gjenvinner sin embryonale PCG merking som følge av EZH2 oppregulering. På molekylært nivå, vi demonstrert at DLC1 var co-regulert av EZH2-mediert H3K27me3, DNA metylering og histon deacetylering i HCC celler. Imidlertid, ko-regulering mellom de tre epigenetiske mekanismen på DLC1 ble bare observert når dets promotor ble delvis metylert (slik som i MHCC97L celler). Når DLC1 promoter ble tett metylert (for eksempel i SMMC-7721 celler), H3K27me3 var fraværende og DNA metylering var nøkkelen undertrykkende mekanisme med beskjeden deltakelse av histon deacetylering. Denne observasjonen kan gjenspeile crosstalk av EZH2 taushet DNA metylering i et tidligere stadium av epigenetisk undertrykkelse av tumorsuppressorgener før eventuell utskifting av H3K27me3 stanse ved stallen DNA metylering maskiner [45,46]. Ja, våre funn at DLC1 er en PCG-regulert mål og dens påfølgende epigenetisk stanse i løpet av malignitet progresjon er også i tråd med den nylig foreslåtte modellen på PCG merking av gener i ES-celler er disponert for
de novo
kreft spesifikk DNA metylering [45,46].
Farmakologisk målretting av deregulerte epigenetiske proteiner fremstår som en attraktiv tilnærming i kreftbehandling [47,48]. DZNep har vist seg å utrydde tumor-initiere HCC celler i nakne mus implantert med HCC [49], indusere apoptose i brystkreftceller [29] og målrette humane akutt myelogen leukemi hos mus modellen når de anvendes i kombinasjon med panobinostat [50]. Imidlertid har den metastase undertrykkende virkning av DZNep aldri blitt evaluert. Våre funn tyder på at DZNep hemme EZH2 uttrykk og kan videre fungere som en potent metastase inhibitor gjennom å forstyrre aktin cytoskjelettet organisasjon. En detaljert farmakologisk karakterisering av DZNep å undertrykke HCC tumorvekst og progresjon in vivo er fortsatt garantert å undersøke terapeutisk potensial av DZNep som kreft behandlingsregime.
Vi har tidligere vist at EHZ2 fremmer HCC metastase delvis gjennom epigenetisk undertrykkelse av flere Rho /rock signal målretting mirnas [13]. For eksempel, MIR-139 som er rettet mot ROCK2 [22] var ofte nedregulert i menneskelig HCC av EZH2-mediert H3K27me3 [13]. I denne studien har vi i tillegg vist at DLC1, nøkkelen oppstrøms regulator av Rho /ROCK sti, er også brakt til taushet av EZH2. Til sammen våre funn løse et stramt og flerlags regulering av DLC1 /Rho /ROCK signalering av EZH2, noe som kan underbygge en kritisk epigenetisk drevet hendelsen i å fremme kreft metastasering.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Transient overekspresjon av GFP-EZH2, noe som bekreftes av immunoblotting (venstre panal) og qPCR (høyre panal), utvidet de EZH2 og H3K27me3 nivåer i Huh-7 celler. Anti-EZH2 antistoff (# 3147, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) detektert både endogene og GFP-EZH2 fusjonsprotein i immunoavtrykket. Protein og RNA ble høstet seks dager etter transfeksjon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0068226.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
MHCC97L celler behandlet med 1 uM DZNep i 48 timer, ble undersøkt for deres levedyktighet ved trypanblått-farving før cellemigrering analysen. Mock og DZNep behandlede celler var tilsvarende levedyktig
doi:. 10,1371 /journal.pone.0068226.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Offentlig tilgjengelige chipsekvensering og chip-on-chip-databasen ble analysert for å gi hint av DLC1 kromatin status i humane embryonale stamceller. DLC1 locus ble funnet å være preget av H3K27me3 (Zhao et al., 2007) og H3K4me3 (Pan et al., 2007) i uavhengige studier. Videre DLC1 arrangøren ble også funnet å være bundet av SUZ12, som er en sentral komponent i de Polycomb undertrykkende Komplekse 2.
doi (Lee et al, 2006).: 10,1371 /journal.pone.0068226.s003
(TIF)
