Abstract
Formål
PI3K /AKT /mTOR veien er ofte dysregulerte i kreft og hemming av mTOR har vist evne til å modulere pro-overlevelse veier. Som sådan, forsøkte vi å finne ut muligheten av mTOR-hemmer everolimus å forsterke antitumor effekt av irinotecan i tykk- og endetarmskreft (CRC).
Experimental Design
kombinatoriske effekten av everolimus og irinotecan var evalueres
in vitro Hotell og
in vivo
i CRC cellelinjer som bærer ofte funnet mutasjoner i
PIK3CA
,
KRAS Hotell og /eller
BRAF
. Farmakokinetisk styrt doseringsprotokoller av everolimus og irinotecan ble etablert og brukes til å vurdere in vivo antitumor effekter av agenter. Ved slutten av behandlingen ble 3-6 svulster per behandling arm høstet for biomarkør analyse av NMR metabolomics.
Resultater
Everolimus og irinotecan /SN38 vist synergistisk anti-proliferative effekter i flere CRC celle linjene
in vitro
. Kombinasjon effekter av everolimus og irinotecan ble bestemt i CRC xenograft modeller ved hjelp av klinisk relevante doseringsprotokoller. Everolimus viste betydelig tumorvekstinhibitering alene og i kombinasjon med irinotecan i HT29 og HCT116 tumorxenotransplantater. Metabolomic analyse viste at HT29 svulster var mer metabolsk responsiv enn HCT116 svulster. Everolimus forårsaket en reduksjon i glykolysen i begge tumortyper mens irinotecan behandling resulterte i en dyp akkumulering av lipider i HT29-tumorer indikerer en cytotoksisk effekt.
Konklusjoner
Kvantitativ analyse av tumorvekst og metabolomic data viste at kombinasjonen av everolimus og irinotecan var mer gunstig i
BRAF /PIK3CA
mutante HT29 tumorxenotransplantater, som hadde en additiv effekt, enn de
KRAS /PIK3CA
mutante HCT116 tumorxenotransplantater, som hadde en mindre enn additiv effekt
Citation. Bradshaw-Pierce EL, Pitts TM, Kulikowski G, Selby H, Merz AL, Gustafson DL, et al. (2013) Utnyttelse av Quantitative In Vivo farmakologi tilnærminger for å vurdere kombinasjons Effekter av Everolimus og Irinotecan i mus xenograft modeller av tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (3): e58089. doi: 10,1371 /journal.pone.0058089
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 04.09.2012; Godkjent: 31 januar 2013; Publisert: 08.03.2013
Copyright: © 2013 Bradshaw-Pierce et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Novartis International AG og Universitetet i Colorado Cancer Center Grant P30 CA046934. Novartis hadde noen innspill i studiedesign, men fikk ikke spille en rolle i datainnsamling analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Jeg har lest journalen politikk og har følgende konflikter . En del av kostnadene av studiene ble levert av Novartis. Novartis også gitt alle everolimus for studiene. Dette endrer ikke vår tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Det er for tiden betydelig fokus på utvikling av nye midler utformet for å forurolige signaltransduksjonsveiene viktige i kreft progresjon. Klinisk bruk av disse molekylært målrettede midler innebærer ofte kombinasjoner med andre terapeutiske modaliteter og flere kliniske studier har vist nytten av å legge signaltransduksjon modulatorer (STMs) til cellegift eller strålebehandling [1] – [5]. Den vellykkede utviklingen av medisinsk behandling og behandlingsstrategier krever gjennomtenkt bruk av prekliniske modeller og forsiktig tolkning av data.
Bruk av kvantitative tilnærminger, herunder bruk av farmakokinetiske data og kvantitative mål på svar, er avgjørende for å belyse virkningsmekanismer og bedre translasjonsforskning farmakologi forskning [6]. En felles mangel ved
in vivo
farmakologiske studier er bruk av doser og /eller planene som ikke er klinisk mulig som kan føre til misvisende resultater av effekt og /eller utvikling av biomarkører som ofte mislykkes i å oversette til den kliniske innstilling. Her presenterer vi en studie der vi bestemt kvantitativt fordelen av å legge et lite molekyl STM, everolimus (Novartis, East Hanover, NJ), til standard kjemoterapi, irinotecan (Pfizer Inc, New York, New York), ved bruk av doser og tidsplaner i vår preklinisk modeller spådd å gi legemiddeleksponering tilnærmet de som ble observert hos pasienter
Everolimus (40-
O Anmeldelser – (2-hydroksyetyl) rapamycin, RAD001 /Afinitor). er en muntlig biotilgjengelig hemmer av mammalian target of rapamycin (mTOR) som er godkjent for behandling av avansert nyrecellekreft og progressive nevroendokrine svulster i bukspyttkjertelen opprinnelse (PNET) [7], [8]. mTOR, et serin /treonin kinase, er en sentral regulator av trasé som signaliserer vekst, spredning, overlevelse, metabolisme og angiogenese [7], [9]. mTOR aktivitet formidles av vekstfaktor signalering, nærings og energi stater samt hypoksisk stress. Videre spiller mTOR en nøkkelrolle i fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT-reaksjonsveien som ofte dysregulerte og innblandet i veksten og utviklingen i flere kreftformer, noe som gjør det til et attraktivt terapeutisk mål [10], [11]. Nyere studier tyder på at PIK3CA mutasjoner eller AKT aktivitet konferere følsomhet for mTOR terapi [12] – [15].
PIK3CA
er genet som koder for PI3K p110 katalytiske subenhet og mutasjoner (ekson 9 og ekson 20) kan bli funnet i 10-30% av CRC [11], [16], [17].
CRC er den tredje vanligste krefttypen, står for nesten 10% av alle kreftrelaterte dødsfall i USA [18]. Mens tidlig stadium CRC har en gunstig fem års overlevelse, sent stadium sykdommen med fjernmetastaser har en 5-års overlevelse på bare 10%, noe som indikerer behovet for bedre behandlingsregimer for metastatisk CRC (mCRC). Irinotecan (Camptosar®) er en standard for omsorg kjemoterapeutisk middel som brukes til behandling av mCRC. Vi antok at everolimus vil forbedre irinotecan-behandling på grunn av modulering av effektorer på pro-overlevelse stier og forsøkte å evaluere kombinasjon i mus xenograft modeller av CRC skjuler det vanskelig å behandle samtidige
PIK3CA Hotell og
KRAS
eller
BRAF
mutasjoner. I tillegg, på grunn av de kjente metabolske virkninger av mTOR pathway inhibering, vi måles kvantitativt metabolske profiler av de tumorer som ble behandlet med klinisk relevante doser av everolimus og irinotecan ved kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi.
Materialer og Metoder
Kjemikalier og reagenser
Irinotecan for
in vivo
studier ble hentet fra University of Colorado Hospital Pharmacy (Aurora, Colorado) og SN38 for
in vitro
studier ble kjøpt fra LKT laboratorier (St. Paul, MN). Everolimus ble gitt som en suspensjon av Novartis. SN38 lager løsninger for
in vitro
forsøk ble gjort i DMSO (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Alle andre materialer som brukes ble kjøpt fra enten Fisher Scientific eller Sigma (St Louis, MO) med mindre annet er spesifisert.
Cell Kultur
Colon tumorcellelinjer, HCT8, HT29, LS180 og HCT116, var kjøpt fra American Type Culture Collection, (Manassas, VA), og opprettholdes på vevskulturplater (BD Falcon, San Jose, CA) i RPMI (Gibco) supplementert med 10% føtalt bovint serum (Gibco) og penicillin (100 enheter /ml) -streptomycin (100 mikrogram /ml, Life Technologies). Celler ble rutinemessig undersøkt for mycoplsma hjelp MycoAlert (Lonza). Alle celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2. Alle
in vitro
medikamentelle behandlinger ble gjennomført med bruk av komplett vekstmedium.
Cytotoksisitet og Kombinasjon Effects
cytotoksiske effekter ble bestemt ved bruk av sulforhodamin B (SRB) analyse. I korthet ble 5000 levedyktige celler sådd ut i 96-brønners plater og inkubert over natten før eksponering med forskjellige konsentrasjoner av medikamenter. Celler ble eksponert for økende konsentrasjoner av everolimus (0-200 nM), SN38 (0-8 nM), og kombinasjoner av de to. Etter en 72 timers inkubasjon ble mediet fjernet, og cellene ble fiksert med kald 10% trikloreddiksyre i 30 minutter ved 4 ° C Cellene ble vasket med vann og farget med 0,4% SRB i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble vasket en gang med 1% eddiksyre og flekken ble solubilisert med 10 mM tris ved romtemperatur og avlest ved en OD på 565 nm. Resultatene av den kombinerte behandling ble analysert i henhold til den isobolographic fremgangsmåten ifølge Chou og Talalay, ved hjelp av Calcusyn programmet (Biosoft, Cambride, UK). Den resulterende Kombinasjonsindeks (CI) ble anvendt som et kvantitativt mål på graden av interaksjon mellom ulike medikamenter. En CI verdi lik 1 betegner additivity; CI større enn 1, antagonisme; CI mindre enn 1, synergisme.
Immunoblotting
Celler ble sådd ut i 6-brønns plater 24 timer før behandling med hvert medikament alene eller i kombinasjon i 24 timer. Cellene ble skrapt inn i RIPA-buffer inneholdende proteaseinhibitorer, EDTA, NaF og natriumortovanadat. Totalt protein ble bestemt ved anvendelse av Pierce 660 nm proteinanalyse (Pierce, Rockford, IL). Tretti mikrogram av totalt protein ble applisert på en 4-12% gradientgel, elektroforese og overført til nitrocellulose ved hjelp av iBlot systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA). Membraner ble blokkert i en time ved romtemperatur med Licor blokkeringsbuffer (Licor, Lincoln, NE) før inkubasjon over natten ved 4 ° C med en av følgende antistoffer: pS6RP, tS6RP, Pakt, Takt, Perk, Terk, p21, PARP , aktin og α-tubulin (Cell Signaling, Beverly, MA). Alle antistoffer ble anvendt ved en fortynning 1:1000 med unntak av ekstra fordel, som ble brukt ved 1:2000. Etter primært antistoff inkubering ble blottene vasket i TBS-Tween (0,1%) og deretter inkubert med det passende sekundære antistoff ved 1:15,000 (Licor, Lincoln, NE) i en time ved romtemperatur. Etter ytterligere tre vaskinger ble blotter utviklet ved hjelp av Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE).
Dyr
Kvinner atymiske nakne mus, 5 til 10 uker gammel, ble kjøpt fra National Cancer Institutt. Dyrene ble plassert 3-5 per bur i polykarbonat bur og holdt på en 12 timers lys /mørke syklus. Mat og vann ble gitt
ad libitum
. Alle studier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) og gjennomføres i samsvar med NIH retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr, og dyrene ble plassert i et anlegg akkreditert av American Association for Akkreditering av Laboratory Animal Care .
for tumorbærende studier, ble cellene høstet og resuspendert i en 1:01 blanding av serumfritt RPMI og Matrigel (BD Bioscience). En million celler ble injisert subkutant i hver bakre flanke av mus. Tumor volum, målt ved digitale calipers, ble beregnet ved å
V plakater (mm
3) = lengde x (bredde)
2 x 0,5236.
farmakokinetisk studie
En farmakokinetisk studie av everolimus ble gjennomført i mus med HT29 tumorer (gjennomsnittlig volum ~300 mm
3). Mus ble behandlet med enten 2,5 eller 10 mg /kg everolimus daglig i 7 dager ved oral sonde. Tre mus pr dosenivå ble avlivet ved blodtapping hjerte stokk ved 30 minutter, 2, 4, 6 og 24 timer etter medikamentadministrering på dag 7. Plasma og tumorvev ble hurtigfrosset i flytende N
2 og lagret ved -70 ° C inntil det analyseres.
Everolimus ble målt i plasma og tumorer ved LC /MS /MS-analyse. Analytiske standarder, kvalitetskontroll (QC) og ukjente prøver ble alle fremstilt ved å tilsette 200 ul ukjent eller tilsatt blank plasma eller tumor-homogenat (100 mg /ml i vann) prøver til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Prøvene ble ekstrahert ved tilsetning av 1 ml metyl-tert-butyleter (MTBE), etterfulgt av 10 min virvelblanding. Prøvene ble sentrifugert ved 13000 rpm i 10 minutter og supernatanten ble oppsamlet og 900 ul overført til et rent prøverør av glass. Prøvene ble inndampet til tørrhet ved bruk av en rotasjonsfordamper, etterfulgt av resuspensjon i 100 pl av 50% acetonitril /50% 10 mM ammoniumacetat og overført til auto-sampler ampuller for analyse. Massespektra for utpakkede prøvene ble innhentet på en MDS Sciex 3200 Q-TRAP trippel kvadrupol massespektrometer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California) med en turbo ionspray kilde tilkobles en Agilent 1200 Series Binary Pump SL HPLC system (Santa Clara , CA) .Den nedre og øvre grenser for mengdebestemmelse for analysen var 1 og 5000 nM, hhv. Nøyaktighet og presisjon (% RSD) basert på analyse av standarder og QC prøver for denne undersøkelse var 90,7% og 5,5% for plasma og 93,0% og 4,2% for tumor. Ytterligere detaljer kan finnes i Supplement S1 (§ SA.1.).
Therapeutic Study
Når HT29 og HCT116 tumorer nådde en gjennomsnittlig volum av ~325 mm
3 dyr ble randomisert i fire behandlingsgrupper (n = 9-10 mus per gruppe): (i) kjøretøy, (ii) 5 mg /kg everolimus (RAD) ved oral tvangsforing (PO) daglig, (iii) 10 mg /kg irinotecan (IRI) en gang ukentlig etter intravenøs (iv) halevene-injeksjon, og (iv) en kombinasjon av RAD og IRI. Everolimus, fortynnet i sterilt vann, og irinotecan, fortynnet i steril 0,9% saltoppløsning, ble administrert ved 4 ml /kg. Dyrene ble behandlet i 28 dager. Tumorvolumer og kroppsvekter ble målt 2-3 ganger ukentlig. På dag 28 av behandling 3-6 dyr per gruppe ble ofret, ca 24 timer etter everolimus behandling, og svulster høstet for metabolomic analyse.
NMR-baserte Metabolomics
For metabolomic analyse, dyrene var fastet i 4 timer og deretter fikk 250 mg /kg [
13C 1-] glukose (Cambridge isotoper, Cambridge, MA) ved IV injeksjon 60 minutter før svulsten høsting. Snap-frosne vevsprøver gikk to-fase syreekstraksjonsmetode prosedyre (med 8% perklorsyre) tidligere etablert og omfattende publisert [19] – [22]. Ytterligere detaljer kan også bli funnet i Supplement S1 (§ SA.2.).
Data Analysis
Plasma og kreft farmakokinetiske parametre ble beregnet ved noncompartmental analyse med WinNonlin. Everolimus plasma data ble plass til en to-compartment modell med første ordens absorpsjon og simuleringer av plasmakonsentrasjoner på a /kg dose av everolimus 5 mg ble utført av SAAM II versjon 2.1 (The Epsilon Group, Charlottesville, VA /University of Washington) .
Én-veis ANOVA analyser med en Tukey post-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans mellom flere grupper. Analyser ble utført med Prism versjon 4.02.
P
verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle kvantitative metabolomic datasettene ble inkludert i spesialbygde metabolske belegg analysatorer og datagrensesnitt og presentert som metabolske varme kart [23].
data fra in vivo studien ble modellert for å vurdere den terapeutiske nytten av å legge everolimus til irinotecan. Modellen som ble anvendt var lik en tidligere publisert modell for vurdering av kombinasjonsterapi [24]. Noen endringer ble gjort, og detaljer om modellen kan bli funnet i Supplement S1 (§ SA.3.) Og Supplement S2. All modellering ble utført på enkelte dyretumorvolumdata og modellert med SAAM II versjon 2.1.
Resultater
in vitro aktivitet
De synergieffekter av everolimus (RAD) og SN38 ble vurdert i CRC cellelinjer, HT29 (
BRAF
mt;
PIK3CA
mt; p53 mt), HCT116 (
KRAS
mt,
PIK3CA
mt ), HCT8 (
KRAS
mt) og LS180 (
KRAS
mt;
PIK3CA
mt). For alle
in vitro
eksperimenter SN38 ble benyttet i stedet for irinotecan siden SN38 er den aktive metabolitten av irinotecan. HT29 celler var den mest følsomme for SN38 og everolimus og tillegg av everolimus til SN38 generelt gitt et sterkt synergistisk effekt i HT29, HCT8 og HCT116-celler med CI verdier fra 1,2 anses antagonistisk, 1,2 CI 0.8 er additiv, og CI 0,8 er synergistisk. Merk at SN38 brukes i
in vitro
analyser i stedet for irinotecan siden det er den aktive metabolitten.
Akt, p-Akt, PARP, kløyvde PARP, total ribosomalt S6 kinase ( S6), ribosomal fosfo-S6-kinase (PS6), ble ERK, p-ERK, P21 og α-tubulin målt i alle linjene etter 24 timers behandling med RAD (20 nM), SN38 (4 nM) eller en kombinasjon av to. Molekylvekter er presentert ved siden av protein navnet i parentes. Merk at SN38 brukes i
in vitro
analyser i stedet for irinotecan siden det er den aktive metabolitten.
Farmakokinetiske-Directed Dosering av Everolimus og Irinotecan
For
in vivo
studier, etablerte vi doser av everolimus og irinotecan å administrere til mus som ville vike eksponeringer på eller under klinisk oppnåelige nivåer. Menneskelig farmakokinetisk informasjon om everolimus [25], [26] og irinotecan /SN38 [27] -. [30] ble hentet fra litteraturen og er presentert i tabell 1 og 2 henholdsvis
for å bestemme passende dose av everolimus hos mus, gjennomførte vi en farmakokinetisk studie av everolimus i HT29 tumorbærende mus. Steady-state plasma og tumor konsentrasjonstidsprofiler er presentert i Supplement S3 Tall SC.2. A B og ikke-kompartment farmakokinetiske parametre presentert i tabell 1 og tabell C.1 i Supplement S3. Dataene viste at en dose på 10 mg /kg i mus resulterer i steady-state fri plasmaeksponering (AUC
ss, fri = 116 ng * t /ml) som er i området fra det som ble observert hos mennesker ved klinisk brukte doser på 5 til 10 mg /kg per dag (AUC
ss, gratis = 60-178 ng * t /ml). Plasmaproteinbindings verdier på 99% og 75% ble anvendt for å beregne frie plasmakonsentrasjoner hos mus og mennesker henholdsvis [31], [32]. Men for in vivo effektstudiene, valgte vi å bruke en dose på 5 mg /kg (AUC
ss, gratis = 37 ng * h /ml) er forsiktig med å oppnå for mye monoterapi aktivitet, noe som kan gjøre det vanskelig å vurdere kombinasjonseffekter. Tidligere studier av everolimus i mus med HCT116 tumorxenotransplantater demonstrerte monoterapi aktivitet (45-55% tumorvekstinhibitering) av everolimus ved 10-12 mg /kg [33], [34].
I vivo
SN38 data ble evaluert for å definere dosen av irinotecan som skal anvendes, siden det er den aktive metabolitten av irinotecan og karboksylesterase omdannelse av irinotecan til SN38 varierer mellom mus og mennesker. Basert på menneskelige og mus farmakokinetiske data samlet fra litteraturen [27] – [30], [35] – [40], har vi valgt en dose på 10 mg /kg av irinotecan som skal administreres intravenøst én gang i uken (tabell 2). En 10 mg /kg iv dose var anslaget for å gi en gratis eksponering av SN38 i rekken av det som ble observert hos mennesker (mus: AUC
gratis = 7,5 til 25,8 ng * t /ml, mennesker: AUC
gratis = 4,4 til 18,6 ng * t /ml for doser 125-350 mg /m
2). SN38 plasmaproteinbindingsverdier av 96,6 til 98,6% for mus og 98% for mennesker ble brukt til å beregne frie fraksjonen fra totalkonsentrasjoner [37].
Tumor Xenotransplantat Response til Everolimus og behandling med irinotecan
effekten av everolimus, irinotecan og kombinasjon av de to ble bestemt i HT29 og HCT116 tumorxenotransplantater. Figur 3A viser tumor vekst profiler av alle behandlingsgrupper for både tumortyper. Everolimus forårsaket lignende og statistisk signifikant (p 0,05 vs. kontroll) veksthemning i begge HT29 (gjennomsnittlig tumorveksthemning, TGI = 40%) og HCT116 (gjennomsnittlig TGI = 44%) tumorer, mens irinotecan forårsaket sterk veksthemning i kun HT29-tumorer (gjennomsnittlig TGI = 39%; p 0,05). Tilsetting av everolimus til irinotecan betydelig redusert volumet av HT29 (gjennomsnittlig TGI = 64%) og HCT116 (gjennomsnittlig TGI = 61%) tumorxenotransplantater (P 0,05 versus kontroll).
(A) HT29 og HCT116 tumor xenograft vekstkurver. Dyrene ble behandlet i 28 dager med kjøretøy, RAD, IRI, eller en kombinasjon av RAD + IRI. Dataene representerer gjennomsnittet ± SEM av 9-12 svulster per gruppe.
* P 0,05 versus kjøretøy. (B) Farmakokinetisk-farmakodynamisk modellering ble utført på å vurdere kvantitativt intensiteten av RAD + IRI kombinasjon i HT29 og HCT116 tumorxenografter. Dette er en grafisk fremstilling av den kryssledd (ψ) for RAD + IRI kombinasjon. Hver søyle representerer ψ verdi for den enkelte svulst. Y verdier 1.3 er synergistisk, 1,3 ψ 0,7 er additive, 0,7 ψ 0 er mindre enn additiv, og ψ 0 er antagonistisk
Modellering av tumorvekst profiler og effekt av behandling viste at kombinasjonen av everolimus og irinotecan var i gjennomsnitt additiv (gjennomsnittlig ψ =. 0.9) i HT29-tumorer (figur 3B). Hver tumor ble modellert individuelt og av de 10 HT29-tumorer, 1 viste en synergistisk respons, 8 viste en additiv respons og en var mindre enn additiv, men ikke antagonister. ψ betegner uttrykket benyttes i den matematiske modell for å beskrive den kombinatorisk effekt, hvor ψ 1,3 er synergistisk; 1.3 ψ 0,7 representerer en additiv interaksjon, 0,7 ψ 0 er en mindre enn additiv effekt og ψ 0 er antagonistisk. Detaljer om modellering og enkelte kreftdata og passer kan bli funnet i Supplement S1, seksjon SA.3., Og Supplement S2. Vekst profiler av HCT116 xenotransplantater var mye mer variable enn de HT29-tumorer. Derfor, selv om den gjennomsnittlige tumorvekst inhibering av kombinasjonsbehandlingen synes lik i de to tumortyper (TGI = 64% vs 61%), i HCT116 tumorer fordelen var i gjennomsnitt mindre enn additiv (gjennomsnittlig ψ = 0,5). Igjen ble hver tumor vekstprofil modellert individuelt og 3 tumorer viste en additiv virkning, 5 var mindre enn additiv og 2 var antagonistisk.
Virkningene av everolimus, irinotecan og kombinasjonen av de to på tumor metabolisme ble målt i en undergruppe av dyr ved slutten av studien. Metabolismeprofiler ble bestemt av
1H,
13C- og
31P- NMR. Figur 4 viser metabolske varmekart til skildre metabolske endringer blant behandlingsgruppene i forhold til kontrollgruppen i HT29 og HCT116 xenografter. Effekten av everolimus på glukosemetabolismen, reduksjon i laktat og glykolyse, var tilsvarende i HT29 og HCT116 svulster, i samsvar med tumorvekst observert på de to krefttypene. HT29-tumorer viste en mer dyptgående respons på behandling irinotecan, som er mest relatert til akkumulering av lipider, særlig poly-umettet og fosfolipider, som kan være relatert til økt cellulær nedbrytning og nekrose. Igjen, dette er i samsvar med de tumor vekst profiler av HT29 og HCT116 tumorer som viste at HT29-tumorer reagerte for irinotecan behandling mens HCT116 tumorer ikke gjorde det. Kombinasjonen av everolimus med irinotecan var assosiert med øket lipidakkumulering, membrandegradering (økt GPC og redusert PC /GPC), og til en viss grad redusert glykolyse i HT29-tumorer. Den samme reaksjon ble ikke observert i HCT116 tumorer, til tross for den gjennomsnittlige tumorvekst inhibering av kombinasjonsbehandlingen, hvilket ga omtrent samme resultat. Totalt sett HT29 svulster var mer metabolsk mottakelig for all behandling enn HCT116 svulster.
1H,
13C-, og
31P-NMR-data er representert som gjennomsnitt ± SEM av 3- 6 målinger. Metabolittene ble deres forhold og metabolske fluks gruppert basert på deres biokjemiske relevans. For kontrollgruppen, blir alle intracellulære metabolitter gitt i mikromol per gram celle våtvekt og metabolitt forhold er dimensjonsløs. Metabolske veier som ble uforstyrret av behandling presenteres som gule kart. En reduksjon i den metabolske sluttpunkt er angitt med rødt, mens en økning av grønne flekker. Statistisk signifikans for metabolitt endringene er basert på multivariat analyse av metabolske flukser med p 0,02. Den interaktive metabolske profilen rekke database var custom-baserte [23].
Diskusjoner
Utvikling av nye behandlingsformer og terapeutiske strategier krever bruk av prekliniske modeller. Ofte, ikke imponerende preklinisk aktivitet lovende nye agenter og kombinasjoner av midler ikke oversette til levedyktige kliniske behandlinger. Rational studiedesign med kvantitative endepunkter er avgjørende for effektiv oversettelse av kombinasjonsstrategier og biomarkører for beskyttelseseffekt [6], [41]. Det overordnede målet med studien beskrevet her var å kvantitativt etablere kombi effekten av everolimus og irinotecan-behandling i murine modeller av CRC, husing vanskelig å behandle genotyper, utnytte farmakokinetiske styrt doseringsregime. Basert på mennesker og mus farmakokinetisk informasjon, etablerte vi doser av everolimus og irinotecan som skal brukes i prekliniske
in vivo
studier som gir eksponeringer i rekken av de som er observert hos mennesker. Det er viktig å merke seg at vi korrigert totalkonsentrasjoner for gratis eller ubundne fraksjoner ved sammenligning av farmakokinetiske data mellom mus og mennesker. Dette er kritisk fordi plasmaproteinbinding ofte varierer mellom arter og i teorien bare den ubundne fraksjonen av narkotika er tilgjengelig for interaksjon med mål av interesse.
Vi testet everolimus og irinotecan kombinasjonen
in vivo
i to cellelinje xenograft modeller av CRC, HT29 og HCT116. Kombinasjonen ble godt tolerert som betydelige kroppsvekt endringene ikke ble observert (Supplement S3 figur SC.2.). Evaluering av studieslutt svulst data fra hver tumortype viser at behandling med everolimus og irinotecan førte til statistisk signifikant tumorvekstinhibitering og graden av respons ligner på de to typene. Men her viser vi at ved å evaluere hver tumor vekst profil, volumet som en funksjon av tid, er vi i stand til å klargjøre forskjeller i vekst og respons mellom de to tumortyper. Gjennom matematisk modellering av kontroll, monoterapi og kombinasjons armer av studien var vi i stand til å vurdere kvantitativt samspillet mellom de to forbindelsene og fant at i HT29 svulster,
BRAF Hotell og
PIK3CA
mutant, kombinasjonen var additive og i HCT116 svulster,
KRAS Hotell og
PIK3CA
mutant, kombinasjonen var ganske variabel, men mindre enn additiv i gjennomsnitt. I tillegg til å vurdere tumorvekst vi måles kvantitativt virkningene av behandlingene på tumor metabolisme ved hjelp av NMR-baserte metabolomikk.
Metabolsk, HT29-xenotransplantater var mer følsom enn HCT116-xenografter. HT29 svulster, men ikke HCT116 svulster, i irinotecan gruppen viste en typisk metabolsk signatur for kjemoterapi, akkumulering av lipider og fosfolipider, en indikasjon på cytotoksisitet /nekrose [42]. Dette resultatet er i samsvar med de tumor vekst profiler, som viser HT29-tumorer som svarer på behandling med irinotecan (TGI = 39%, p 0,05), men ikke HCT116 tumorer (TGI = 17%). Disse resultatene er også enig med de
in vitro
data som viser HT29 celler (IC50 = 3 nM) blir mer følsom enn HCT116-celler (IC50 300 nm) til SN38 behandling. Ifølge våre simuleringer (Supplement S2), de frie konsentrasjoner av SN38 i plasma varierte fra 1300 til 7.25e-4 nM i en 24 timers periode med en gjennomsnittlig konsentrasjon på 4-18 nM, som er godt under den beregnede IC50 for HCT116 celler. Til tross for likheten i tumorvekstinhibitering profiler av everolimus behandlet HT29 svulster og HCT116 tumorer (TGI = 41% vs 44%, henholdsvis), HT29 svulster dukket opp litt mer metabolsk responsiv enn HCT116 svulster. Noen nedsettelse av glykolyse ble målt i begge HT29 og HCT116 tumorer, men en økning i GPC og noen lipidakkumulering ble også observert i HT29-tumorer. In vitro, HT29-celler var mer mottakelig for everolimus behandling enn HCT116-celler, som IC50 for spredning var lavere (1,2 nM sammenlignet med 25 nM) og større p-S6RP inhibering ble observert ved 20 nM.
In vivo,
lignende svar i hemming av p-S6RP og cyclin D1 ble observert i HT29 og HCT116 tumorer (Supplement S3 Figur SC3 og SC4); imidlertid, kan målinger av p-S6RP ikke være et nyttig mål for å vurdere effekten. En tidligere publisert studie viste at everolimus behandling i både sensitive og resistente linjer kan føre til total defosforylering av S6K1 og S6 [33].
Vi spekulerer i at noe av effekten av everolimus observert i HCT116 svulster kan være relatert til antiangiogenic effekter av everolimus. Antiangiogene effekter av everolimus er tidligere blitt rapportert [33], [43] og antiangiogene effekter ville være mye vanskeligere å oppdage med hele tumor metabolomikk, som utføres her, siden den fraksjon av endotelceller sammenlignet med total tumorvev er ganske liten. Ytterligere bevis for å støtte dette kan være avledet fra everolimus farmakokinetiske data. De frie plasmakonsentrasjoner produsert ved /kg dose 5 mg i dyrene våre varierte 0,2 til 6 nM (C
min til C
max) med en gjennomsnittlig fri konsentrasjon (C
ss, avg) på ca. 1,5 nM, noe som ville være tilstrekkelig til å hemme vekst HT29, men ikke HCT116 og tidligere data rapporterer potent anti-proliferativ aktivitet av everolimus mot VEGF og bFGF-stimulerte endotelceller (HUVECs) med IC50-verdier 0,1 til 0,8 nM [33].
