Abstract
De anti-invasive og anti-proliferative effekter av betulins og abietane derivater ble systematisk testet ved hjelp av en organotypiske modell system av avanserte, kastreringsresistent prostatakreft. En foreløpig skjermen på første sett av 93 forbindelsene ble utført i to-dimensjonale (2D) vekstbetingelser, ved hjelp av ikke-transformerte prostata epitelceller (EP156T), et androgen-sensitive prostatacancer-cellelinje (LNCaP), og den kastrering-resistent, svært invasiv cellelinje PC-3. De 25 mest lovende forbindelser var alle betulin derivater. Disse ble valgt for en fokusert sekundær skjerm i tredimensjonale (3D) vekstvilkår, med det mål å identifisere de mest effektive og spesifikke anti-invasive forbindelser. Ytterligere følsomhet og cytotoksiske tester ble deretter utført ved anvendelse av en lengre cellelinje panel. Effektene av disse stoffene på cellesyklusprogresjon, mitose, spredning og uspesifikke cytotoksisitet, kontra deres evne til å spesifikt forstyrre cellemotilitet og tumorcelle invasjon var adressert. For å identifisere potensielle virkningsmekanismer og trolig sammensatte mål, ble multiplex profilering av sammensatte virkninger på et panel av 43 humane proteinkinaser utført. Disse mål de-konvolusjonsteknikker studier, kombinert med den fenotypiske analyser av flercellede organoids i 3D-modeller, avslørte spesifikk hemming av AKT signale knyttet til effekter på organiseringen av aktin cytoskjelettet som den mest sannsynlige føreren av endret celle morfologi og motilitet.
Citation: Härmä V, Haavikko R, Virtanen J, Ahonen jeg, Schukov HP, Alakurtti S, et al. (2015) Optimalisering av Invasion-spesifikke effekter av betulin Derivater på prostata kreft celler gjennom Lead Development. PLoS ONE 10 (5): e0126111. doi: 10,1371 /journal.pone.0126111
Academic Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, AUSTRALIA
mottatt: 03.02.2015; Godkjent: 23 mars 2015; Publisert: 12. mai 2015
Copyright: © 2015 Härmä et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. forfatterne ber erkjenne økonomisk støtte (Prosjektnummer nummer~~POS=HEADCOMP 252308, BARC – Betulins, abietans og harpiks som romanen blyforbindelser for kreft) fra Academy of Finland ( til KMOC), og svulstens mikromiljø Metastase i Kastrering resistent prostatakreft (prosjektnummer 267326) til MN. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bortsett fra hudkreft, prostatakreft (PRCA) er den vanligste kreftformen hos menn, spesielt i Europa. PRCA er vanligvis hormonavhengig og rollen av androgener i progresjonen fra androgen-avhengige hormon-ildfast PRCA er godt etablert [1]. Tidlig stadium PRCA kan håndteres ved bruk alene og tilbakevendende svulster blir behandlet av ablasjon av sirkulerende androgener ved kjemisk kastrering. I kontrast, sent stadium kastrering-resistente PRCA (CRPC) med karakteristisk metastatisk spredning av primær tumor, vanligvis til beinet, er fortsatt den viktigste årsaken til kreft-assosiert død. Selv om betydelige fremskritt har blitt gjort i behandlingen av primære og androgen-sensitive prostatakreft, kurativ behandling som er spesielt rettet mot metastatisk spredning av avanserte og aggressive CRPC dag ikke eksisterer. Delvis, er dette relatert til mangel på eksperimentelle modellsystemer som trofast representerer funksjonene i invasivitet og cellemotilitet
in vitro
eller
in vivo
.
Verken standard to- dimensjonale (2D) cellekultur modeller (cellelinjer) eller dyremodeller (mus xenoimplantater) representerer nøyaktig den fulle kompleksiteten i kliniske svulster. 2D modeller mangler spesielt svulsten mikromiljøet (TME), den ekstracellulære matriks (ECM), og stromal celletyper. Slike modeller dårlig overens med narkotika følsomhet observert
in vivo product: [2]. Disse funksjonelle mangler av pre-klinisk legemiddelforskning reflekteres av den høye attrition priser for kreftlegemidler ( 95%) [3] i senere kliniske studier. Dermed biologisk mer relevant
in vitro
tumormodeller må utvikles for å øke produktiviteten til medisiner og redusere antall dyr som kreves i legemiddelutvikling [4]. ECM preparater fra ulik opprinnelse har vist seg spesielt kritisk å undersøke celle-celle interaksjoner og differensiering i 3D kultur [5]. Integrert, robust og standardiserte 3D-plattformer har blitt kompatibel for både high-throughput (HTS) og high-innhold screening (HCS) innstillinger [2], og effektiv oversettelse av 3D cellekultur metoder fra grunnforskning til industrielle applikasjoner pågår [6 ]. Biologisk relevant ECM som kollagen eller laminin rike basalmembranekstrakter som Matrigel er nå mye brukt til å studere cellulære mekanismer som cellemotilitet og invasjon. Spekteret av flercellede morfologi dannet av prostata epitel og kreftceller i 3D kulturer spenner fra fullt fungerende kjertel acini, dysfunksjonelle kreft kuler; til invasive stel strukturer [7,8] som mangler mest differensierte egenskaper. Således er forskjellig morfologi manifestert i 3D lrECM kultur er en solid indikator som korrelerer med ulike stadier av ondartet progresjon. Slike biomimetic 3D cellemodeller gir et kraftig middel til å kvantifisere kreftrelaterte biologiske prosesser. Invasjon og metastasering er de mest kritiske kjennetegnene til kreft som kan forvandle lokalisert kreft i en livstruende sykdom [9]. I 3D-kultur, tumorcelle-invasjon manifestert enten av enkeltceller eller celleaggregater som aktivt invadere omgivende ECM, ved hjelp av forskjellige moduser av motilitet (f.eks amoeboid eller kollektive invasjons) [10]. PC-3 er en av de få PRCA cellelinjer som viser kollektiv invasjonsegenskaper både
in vitro Hotell og
in vivo product: [7,11]. Slike komplekse flercellede prosesser kan ikke gjengis i forankrings uavhengig, ikke-heftende 3D-systemer som mangler biologisk funksjonell ECM, som poly-HEMA [12], myk agar [13] eller «henge-slipp» kulturer av isolerte kuler [14] . En fersk studie viste at genuttrykk profiler av brystkreft celler dyrket i 3D lrECM var mye nærmere
in vivo
enn enkeltlag eller poly-HEMA kulturer [15]. Høye innhold skjermer (HCS) med lrECM-baserte plattformer har blitt rapportert for prostata [16], bryst [15], bukspyttkjertel [17], og eggstokkreft [18]. Slike standardiserte grundig og miniatyrisert vev-lignende modeller er påkrevet for systematisk å fange opp virkningene av småmolekylære forbindelser /narkotika, sirnas, biologiske (f.eks antistoffer og peptider), vekstfaktorer eller toksiner på tumorbiologi. Disse komplekse biomimetic tilnærminger er nyttige som trofaste pre-kliniske verktøy for å undersøke kort- og langsiktige narkotika reaksjoner, behandling svikt, eller utvikling av resistens [19]. Kombinert med høyt innhold av mikroskopiske bildebehandling og bildeanalyse metoder, kan 3D-fenotypiske modeller også være svært informativ for bly oppdagelse og bly optimaliseringsstudier (henholdsvis LD eller LO,), spesielt hvis den molekylære stoffet målet er ukjent, og komplekse mekanismer som vev-spesifikk differensiering, og celle-celle-interaksjoner kan vurderes basert på objektiv, multiparametric avlesing. Multipleksing av bildebaserte avlesningen gjør det også mulig samtidig vurdering av cytotoksisitet, apoptose, og effekter på cellesyklus, f.eks ved hjelp av egnede fluorescerende prober [2,20], og dermed redusere behovet for overdreven valideringsstudier. I tillegg kan sanntid og levende celle 3D-analyser basert på høy-innhold bildeanalyse kombineres med endepunktsstudier adressering uttrykket av biomarkører, som beskrevet i tidligere publikasjoner [7,11].
Naturlige produkter ( NPS) har vært uvurderlig som verktøy for å tyde logikk biosyntese og som utgangsmaterialer for utviklingsfrontlinjen narkotika [21]. Faktisk, de fleste av nye kjemiske enheter godkjent som legemidler av US Food and Drug Administration (FDA) har gjennomgående vært enten NPs eller NP-avledet forbindelser [22]. De pentacyclic triterpenoids, sekundære plante metabolitter rikelig funnet i fruktskall, blader og stilk bark, har tiltrukket seg stor interesse som terapeutiske midler og kosttilskudd [23,24]. I tillegg har semi-syntetiske derivater av de naturlig forekommende triterpenoids vært aktivt studert i jakten på nye legemidler mot kreft, med spesiell fokus på anti-invasivitet egenskaper [24-29]. Betulin og betulinsyre er lupane-type pentacyclic triterpenes rikelig i barken på bjørke arter i slekten
Betula
L. [30]. Betulinsyre og andre betulin-derivater har antivirale, anti-inflammatorisk, anti-malaria, og anti-kreft effekt [31]. I tillegg ble betulinsyre identifisert som en selektiv induserer apoptose i melanom celler [32], utløser en sterk interesse i triterpenes som cytostatika. Videre betulin ble funnet å blokkere invasive egenskaper av hjernen og lungekreftceller, godt under dens cytotoksiske konsentrasjon, noe som tyder på en lovende Kjemopreventivt effekt mot metastaser [33]. I denne studien har vi brukt en kombinasjon av 2D og 3D PRCA cellemodeller og HCS metoder basert på bildebehandling og automatisert bildeanalyse, for å vurdere og validere antineoplastiske og anti-invasive egenskapene til et bibliotek med 93 forbindelser. I dette biblioteket, har vi tatt den foreldre forbindelser betulin, betulinsyre (2) og deres semi-syntetiske derivater, og forbindelser fra en annen klasse av terpenoids med mindre studert biologiske effekter, de abietanes. Samlet, biblioteket omfattet 78 betulins og 15 abietanes.
Diskusjon
Resultater og
Syntese av et bibliotek av betulin og abietane derivater
Et sett av 76 betulin derivater ble utarbeidet start fra betulin og betulinsyre (1), mens 13-vater fremstilt fra dehydroabietinsyre og dehydroabietylamide (figur 1-3, se også S1 fil), å bruke vår kompetanse på naturlige produkter kjemi og følge enten våre tidligere rapporterte prosedyrer eller andres [ ,,,0],34-37]. Betulonic syre (2) ble erholdt fra betulin av Jones oksydasjon, og brukes som et allsidig mellomprodukt for kjemiske synteser. Forskjellige substituenter ble innsatt i stillingene 3 og 28 av den lupane kjernen. Noen derivater ble også fremstilt ved å smelte heterocykler til ringen A, i posisjonene 2 og 3. Andre forbindelser som inneholdt en ekstra ring kondensert til ring C, D og E. Reduksjon av isoproprenyl sidekjeden av triterpene kjernen ble gjort for noen av derivatene . Sidekjede-omleiring resulterte også i germanicane-type forbindelser. I abietanes satt forbindelsene forberedt besto hovedsakelig av urea og amidderivater.
High throughput screening (HTS) for bioaktivitet
Disse forbindelsene ble utarbeidet som en bibliotek og biologisk aktivitet ble testet ved bruk av 2D-cellekulturer i 384-brønns plater i high throughput screening (HTS) format (S1 fig). Cellelinjene som ble brukt var EP156T (ikke-transformert prostata epitel), LNCaP (androgen sensitive PRCA), og PC3 (kastrering-resistent, invasiv PRCA). Forsøkene ble utført i tre forskjellige forbindelseskonsentrasjoner (0,1, 1 og 10 uM) in triplo ved å bruke CellTiterGlo som et sluttpunkt utlesning for celleproliferasjon. Et panel av 25 betulin derivatene ble syntetisert i henhold til de mest effektive og kreftspesifikke forbindelser som er identifisert i den foreløpige 2D-skjermen, og valgt for videre studier.
høyt innhold Screening (HCS) for invasjon-blokkerende aktivitet
Deretter disse 25 mest effektive forbindelser ble testet i 3D-innstillinger for spesifikke anti-invasive egenskaper. Tre standard av omsorgs forbindelser mye brukt mot PRCA ble tilsatt som kontroller; nemlig, androgen receptor antagonist enzalutamide (MDV3100), den C17α-hydroksylase /C
17,20-lyase-inhibitor abirateron (Zytiga), og den klassiske mitotisk inhibitor paclitaxel. Behandlinger startet på dag 4, da godt differensierte runde acini ble etablert. Forbindelse eksponering ble deretter fortsatte i seks dager, da de fleste av de ubehandlede flercellede strukturer hadde forvandlet til en svært invasiv fenotype.
Automatisert morfometrisk bildeanalyse (AMIDA) og statistisk evaluering
Levende 3D celle kulturer ble deretter farget med reaktive fargestoffer Calcein AM å oppdage levende, og ethidium homodimer å oppdage døde celler. Bilder (Fig 4A) ble kjøpt med konfokalmikroskop og bildedata ble analysert med AMIDA programvare [38]. Prinsippene for morfometrisk bildeanalyse er kort skissert i S2 Fig.
PC-3-celler ble dyrket i 3D Matrigel ECM i 4 dager og ble behandlet i 6 dager med 25 betulin derivater (fra 2D høy gjennomstrømning skjermer), DMSO /kjøretøy kontroll, og tre referanseforbindelser. A) Representative maksimal intensitet projeksjoner av konfokal mikroskop stack bilder for utvalgte sammensatte behandlinger på 300 nM konsentrasjon (5 × mål, målestokk 100 mikrometer). B) Tre kurver som viser den relative virkning på tre morfometriske parametere for 7 betulin derivater, DMSO kontroll, og en kontrollforbindelse (paclitaxel). Data skalering: viser den relative forskjellen mellom median på området /kompleksitet /Area Ratio, til DMSO kontroll. Paclitaxel behandlinger og DMSO kontroller har blitt tildelt verdier fra -100 og 0, henholdsvis. C) Hierarkisk clustering ble gjort ved hjelp av tre morfologiske parametere avledet fra PC3 organoids: spheroid størrelse (område), kompleksitet og antall døde celler. D) Sårtilheling kurver av to betulin derivater 4 og 20, fremhever 50% cut-off nivå (oransje stiplet linje).
Figur 4A viser representative konfokal mikroskop bilder for noen av betulin derivater . Den svært effektive, antimitosemekanisme kontroll narkotika paclitaxel sto selv ved svært lave konsentrasjoner (30 og 100 nM), viser en sterk effekt på alle morfometriske tiltak (figur 4B): Dette resulterte i mindre (redusert område), mindre invasive organoids (redusert kompleksitet ), med økt antall døde celler. Den kontrollforbindelser abiraterone og enzalutamide hadde ingen merkbar effekt på PC-3 celler. Interessant nok har betulinsyre (1) og betulonic syre (2) ikke viser signifikant anti-invasive virkning, mens forbindelse 3, som bærer en substituent i isopropyl- C19, var en av de mest potente anti-invasiv, veksthemmende midler. Tilsvarende isoksazol-derivater 4 og 5 viste sterk vekst inhiberende og anti-invasive effekter ved lavere konsentrasjoner (så lavt som 100 nM for 4 og 300 nM til 5). Alle disse effektive forbindelser skiller seg bare ved posisjon C19: Forbindelse 4 har en isopropyl-sidekjeden, mens forbindelse 5 har den opprinnelige isopropenyl i sidekjeden. Videre, når den isoksazol ring av 5 ble erstattet med en pyrazolring, den resulterende forbindelse 6 var enda mer potente og viste seg å være spesifikt anti-invasiv. I motsetning til dette isoksazol-derivater med en formylgruppe (7) eller en acetoksygruppe (8), et primært amid (9) eller en hydroksy (10) i stilling C28 vises neglisjerbare virkninger på invasive fenotype. Relevansen av den opprinnelige karboksylgruppen i posisjon C28 (betulonic syre, 2) for anti-invasiv eller cytotoksiske aktivitet ble undersøkt ved å erstatte denne gruppen med ulike amid gruppene. Ingen av disse forbindelsene viste betydelige anti-invasive effekter (11, 12, 13, og 14) (ikke vist). Også sammensatte 15 viste sterke anti-invasive effekter på 1,0 mikrometer uten veksthemming. Imidlertid, når dens karboksylgruppe ved C17 ble omdannet til en primær amidgruppe, den resulterende forbindelse 16 hadde samme høye nivå av anti-invasive effekt som Forbindelse 15. I motsetning til dette derivater med tertiært amid (17) eller nitrilgrupper (18) ved C17 var inaktive (ikke vist). To pyridinderivater ble også testet. Ingen tap i anti-invasiv aktivitet ble observert om pyridinnitrogenet var tilstøtende til C3 posisjonen av den opprinnelige lupane skjelett (19), eller ved siden av C2 posisjonen til lupane skjelettet (20). Interessant nok, begge forbindelser 19 og 20 var en potent anti-invasiv ved signifikant lavere konsentrasjoner, sammenlignet med forbindelse 15.
Deretter statistiske analyser ble utført for å tolke de sammensatte bildedata (figur 4B og 4C). For enkelhets skyld har vi fokusert på bare tre, grunnleggende morfologiske parametere fra multiparametric AMIDA avlesning (figur 4B): 1) Område (som indikerer vekst av organoids), 2) strukturell kompleksitet (som et mål på intensiteten av invasjon), og 3) Relativt Areal av døde celler innenfor organoids (rødt signal som et mål for cytotoksisitet eller apoptose). Område (størrelse av organoids, fig 4B, øvre panel) ble målt som antall piksler i en segmentert struktur. Den logaritmisk transformasjon av området /Size data ble brukt, som viste en nær Gaussian (normal) fordeling innenfor bildene. Shape kompleksitet (figur 4B, midtre panel) ble oppnådd ved å bruke strukturen størrelse (område) og omkretsen (antall grense piksler). Den mer vanlige form av en organoid, jo nærmere er en perfekt sirkel, og dermed minimere omkretsen i forhold til objektstørrelse. Vi observerte en nær lineær avhengighet mellom log (Area) og log (Perimeter), noe som indikerer en naturlig (funksjonell) sammenheng mellom disse to funksjonene. Montering av en regresjonslinje til de data som resulterte i en nyttig estimat av gjennomsnitts omkretsen av en hvilken som helst organoid struktur. Avvik fra dette gjennomsnittet (rester) ble tolket som et mål for formen kompleksitet organoids. Som en logisk nedre grense for dette tiltaket (representert ved en perfekt sirkel), vi justert skjærings (høyde nivå) av regresjonslinjen å gjengi alle returnerte rester som positive tall. Denne forenklede, rask måling av den flercellede kompleksitet indikerte at logaritmen av rester som resulterer i en nesten symmetrisk fordeling av verdier. Hierarkisk clustering, ved hjelp av disse tre grunnleggende tiltak fra PC3 kulturer ga en enkel dendrogram med to hovedgrener: den første klyngen inkludert de mest potente anti-proliferativ og anti-invasive forbindelser (fig 4C: gul). Den andre klyngen representerer svak (fig 4C: rød) og ikke-effektive (fig 4C: grå). Forbindelser
Validering av anti-invasive egenskaper
Basert på den primære skjermen, valgte vi seks betulin derivater for ytterligere validering av anti-invasive effekter ved flere metoder. I en standard sårtilheling analyse utført i monolayer 2D kultur, effekten av noen forbindelser var påfallende forskjellig til 3D-innstillinger. For eksempel kan forbindelser 4, og 20 fullstendig redusert invasjon i 3D allerede ved 300 nM, respektivt (figur 4A), men viste bare 50% reduksjon for sårheling etter 64 timer (figur 4D) i den samme konsentrasjon. Også sammensatte fem effektivt hemmet invasiv transformasjon av PC-3 kuler allerede på 300 nM i 3D (S3A figur), målt som «% rundhet» beholdt etter 10 dager), men konsentrasjonene er høyere enn 1 mikrometer var nødvendig i 2D kultur for sammenlignbare effekter (S3b fig). Også de mest potente anti-invasive midler 6, 16 og 19 (aktive på 100 nM i 3D forhold) redusert til lukking av sår i 2D kun med 50% på tre mikrometer og en mikrometer, henholdsvis (S3b fig). Forbindelse 21 er tatt med her som et eksempel for inaktive derivater. Det faktum at mange forbindelser som manglet den samme potens på konvensjonell 2D-monolagskultur antyder at de biologiske mål eller veier som er involvert i celle motilitet ikke er like aktive i cellemigrasjon på plastflater. Det er også sannsynlig at celle motilitet i 2D-monolagskultur styres av andre mekanismer enn kollektiv invasjon i et 3D-stillas.
Sekundære 3D-skjermer.
Deretter de 25 valgte betulin-derivater er vist i fig 1-3 inkludert kontrollforbindelser ble igjen grundig testet over det samme panel av prostata-avledede cellelinjer som allerede er benyttet i den innledende, 2D high-throughput skjerm. De resulterende dendrogrammer ble enten generert separat for hver cellelinje (S4 figur), kombinert i en enkelt dendrogram (fig 5A), eller som vist redusert organoid størrelser (område, fig 5B). I den ikke-invasive, men hormonfølsom LNCaP organoids, de fleste sammensatte effektene var relativt milde. Ikke-effektive behandlinger omfatter det store flertallet av grafen (S4 Fig: grå), mens de få effektive forbindelser faller i to sammenhengende grener (gul og rød). Som forventet, androgen antagonist enzalutamide men ikke abiraterone var blant de effektive behandlinger. Paclitaxel klynger sammen med betulin derivater ved høyere konsentrasjoner-disse forbindelsene var også effektiv på hormonresistent, invasive PC-3 celler. Dendrogrammet for hormonavhengig, ikke-invasiv LAPC-4 (S4B figur) viser igjen effekten av alle positive kontroller (abirateron, enzalutamide og paclitaxel, innen gule og røde klynger). De mest aktive av betulin-derivater igjen faller innenfor de samme klyngene (3, 4, 6, 16, 19 og 20) i tilknytning til positive kontroller. I motsetning til -PRCA cellelinjer, den ikke-transformerte, normal-lignende Ep156T cellelinje (Fig S4C) også reagert på betulonic syre (2), i det minste ved den høyeste konsentrasjon. Generelt, som med LNCaP og LAPC4 celler, virkningene på Ep156T vekst var milde (Fig 5B).
Eksperimentelle betulin derivater og kontrollforbindelser ble testet over et panel av prostatakreft linjer (LNCaP, LAPC-4) og ikke-transformerte, prostata epitelceller (EP156T) i 3D-kultur. A) Dendrogrammet er basert på tre hoved morfologiske parametere og kombinerer alle data fra grunnskolen og videregående 3D-skjermer. Effektive sammensatte behandlinger er angitt i rødt og gult, gul å være den mest invasjon-spesifikke. B) boksplott som viser virkningen av utvalgte forbindelser på spheroid størrelse (Area). Data skalering. Som beskrevet i figur 4 C) Effekter av alle betulin derivater og kontroll forbindelser på celledød (antall døde celler)
For å bistå funksjonell kategorisering av våre betulin derivater, vi kombinert alle data i en enkelt dendrogram, vist i figur 5A. I tillegg multiparametric representasjon av alle eksperimentelle data som en enkelt heatmap er svært informativ (S5 figur) og en potent måte å illustrere effekten av forbindelsene på vekst, strukturell kompleksitet og celledød i flere cellelinjer. Vi delt forbindelsene og styrer inn i tre grupper: 1) veksthemmende forbindelser, 2) sterke og svake anti-invasive forbindelser, og 3) inaktive forbindelser. De morfologiske effekter i 3D kultur er oppsummert i S6 Fig de mest potente anti-invasive virkninger (på PC-3-celler) ble vist av forbindelsene 3, 4, 6, 15, 19 og 20, ved konsentrasjoner på 300 nM eller lavere (med unntak av forbindelse 15), med ingen merkbar effekt på andre cellelinjer. De fleste av disse forbindelser er imidlertid viste vekst-inhiberende effekter i alle cellelinjer med konsentrasjoner på 1 uM eller høyere. Som konklusjon, er mange av betulin-derivater er cytotoksiske og hemme cellevekst ved høye konsentrasjoner (mer enn 1 uM). Men ved lavere konsentrasjoner, kan disse forbindelsene virker som potente og spesifikke hemmere av celle invasjon og bevegelighet.
Evaluering av anti-invasiv vs cytotoksisk aktivitet.
For å utelukke at cytotoksiske og antimitotiske effekter ble mistolkes som anti-invasive, testet vi forbindelsene 4, 5, 6, 19 og 20 for inhibering av proliferasjon og induksjon av celledød i et 2D-monolagskultur (oppsummert i figur 6). Et bredt spekter av sammensatte konsentrasjoner (1 nM til 30 mikrometer) ble brukt for PC-3, LNCaP og Ep156T cellelinjer, og analysert med PerkinElmer Operetta høyt innhold imager. I PC3 celler, de fleste forbindelser ikke vise merkbare effekter på spredning ved konsentrasjoner lavere enn 10 mikrometer (Fig 6A). LNCaP-celler ble mer følsom, med veksthemming /cytotoksisitet starter på 3 uM. Effektene på ikke-transform, apoptose-sensitive Ep156T celler var sterkest. Her cytotoksiske effekter ble vanligvis observert allerede på 0,3-1 mikrometer. Ingen av forbindelsene som spesifikt indusert celledød i PC-3 eller LNCaP-celler ved konsentrasjoner under 30 um (figur 6B og 6C, med unntak av forbindelse 19). Vi videre beregnede EC
50 verdier for spredning, apoptose og celledød for hver forbindelse ved hjelp av PerkinElmer Harmony-programvaren (metodevalidering vist i S7 figur). Den eneste metode som ga resultater i samsvar med de av betulin derivater testet i 2D cellekultur modellen var analysen spredning (tabell 1).
A) Celleproliferering /celle nummer, B) programmert celledød (apoptose ), og C) antall døde celler ble bestemt ved konvensjonelle analyser, kombinert med høyt innhold mikroskopi (Operetta). Celler ble behandlet med de fem mest effektive av betulin-derivater, inkludert paclitaxel kontroll i 72 timer. Proliferasjon ble målt som det totale antall kjerner (= celler), apoptose som forholdet av caspase-3 positive i forhold til alle celler og celledød som etidium homodimer-2 positive kjerner versus alle celler.
effekter på cellesyklusprogresjon og mitose
Vi testet neste hvis betulin derivatene har spesifikke effekter på cellesyklusprogresjon og mitose ved konsentrasjoner på 300 nM (ikke vist) og 1 uM i 2D kultur (fig 6D og S8 fig). Det var ingen merkbare forskjeller i cellesyklusprogresjon i respons til noen av de testede forbindelser. Vi har også vurdert celleproliferasjon og mitose ved å måle PCNA og cyclin B1 proteinnivåer (S8B Fig). Som forventet, betulin derivater viste ingen effekt på ekspresjonen av enten protein ved den konsentrasjon som testes. Disse funnene igjen støtter at betulin derivater er bare cytotoksiske eller forårsake DNA-skader ved høye konsentrasjoner (PRCA EF
50 verdier som spenner 1-90 mm), mens de fremmer betydelige anti-spredningseffekter ved lave nanomolare konsentrasjoner.
mulig mekanisme (r) for virkning av betulin-derivater.
for å belyse mulig virkningsmekanisme for våre betulin-derivater, anvendte vi en fosfo-kinase matrise som kvantitativt detekterer fosforyleringen nivåene av 43 kinaser i cellelysater (fig 7). Lysates ble hentet fra 3D-cellekulturer fra PC-3 celler, og utsatt for betulin-avledet forbindelser for kort (4 timer) eller langsiktig (6 dager) perioder. For disse studiene, valgte vi de to representative derivater 5 og 20 som de mest spesifikke, minst cytotoksiske hemmere av celle invasjon. Den kortvarig (4 timer) eksponering ble utført ved en forholdsvis høy konsentrasjon av 1 uM, mens det for den langsiktige (6 d) eksponering, en konsentrasjon på bare 300 nM ble anvendt; både godt under cytotoksiske EF
50 verdier (10 mm for sammensatte 5 og 67 um for forbindelse 20). De kinase arrays ble også kvantifisert ved bilde densitometry (Fig 7A). Fosforylering nivåer av fire kinaser, både på kort og lang sikt eksponeringer, ble tydelig redusert: STAT3 (Y727), c-Jun (S63) Enos (S1177) og PLC-γ1 (Y783) (Fig 7A topp- og bunnplater) . Begge forbindelser også redusert p53 (S15) fosforylering på kort sikt eksponering og p70 S6 kinase (T389), p53 (S392) og PYK2 (Y402) fosforylering i 6-d eksponering, og økt AMPKα1 (T174) fosforylering. Sammensatte spesifikke effekter for stoffet 20 inkludert differensial fosforylering av HCK (Y411), pan-JNK, GSK-3α /β (S21 /S9), STAT3 (Y705) og WNK1 (T60) nettsteder. Akt (S473) fosforylering ble kun inhibert av 6-D-eksponering. Forbindelse 20 også økt fosforylering av mTOR (S2448), Fyn (Y420) og Src (Y419). I kontrast, gjorde sammensatte fem ikke forårsake noen konkrete endringer i kinase aktivitet på kort tids eksponering, og viste bare noen tydelige endringer i langtidsbehandling. Mest spesielt Akt (T308) fosforylering ble også avskaffet nesten utelukkende som følge av eksponering med sammensatte fem, mens fosforylering av p53 nettsteder S46 og S392 ble konsekvent redusert (figur 7A). Reduksjonen av AKT-aktivitet av begge forbindelsene ble bekreftet ved western-blotting, ved hjelp av en uavhengig, p-AKT spesifikt antistoff (figur 7B). De korte behandlinger forårsaket bare beskjedne endringer med en maksimal reduksjon av protein fosforylering av to ganger (20: GSK-3α /β S21 /S9 og STAT3 Y705). Fosforylering nivåer av bare tre kinaser ble endret mer enn to ganger i de langsiktige eksponeringer, nemlig AKT (T308), p53 (S46) og eNOS (S1177), forårsaket av nanomolare konsentrasjoner av sammensatte 5. Forbindelse 20 hadde mye mindre dramatisk effekter på kinasefosforylasjon forhold til sammensatte 5, til tross for sin generelt mer uttalt anti-invasive effekter. Oppsummert observert redusert AKT og p53 aktivitet samt endrede fosforylering nivåer av flere proteiner inkludert Enos pan-JNK, og GSK-3α /β, foreslår bremses celle metabolisme eller redusert celle levedyktighet.
PC -3 sfæroider ble utsatt for to representative bringe betulin-derivater, 5 og 20, i 4 timer (ved 1 uM) og 6 dager (0.3 pM). A) Computational kvantifisering av signal intensiteter fra kinase arrays, justert ved hjelp av brette observerte endringene (venstre til høyre). B) Western blot av total og fosfor-Akt (S473) vist for både kort og lang tids eksponering for 20 og 5.
Vi har også utforsket 3D flercellede morfologi av PC-3, LNCaP og Ep156T kuler utsatt for de 5 utvalgte betulin derivater både for korte og lange perioder med 4 timer og 6 dager. Fra en detaljert analyse av F-aktin cytoskjelettet (phalloidin farging), ble det klart at forbindelsene 5, 6, 15 og 20 effektivt avbrutt organiseringen av aktin cytoskjelettet etter 48 timers eksponering (figur 8A). Interessant nok var en nesten identisk aktin «korketrekker» fenotype sett i normal Ep156T acini og PC-3 kuler (Fig 8A: forstørrelse panel på høyre), mens den typiske kortikale aktin organisasjon i LNCaP kuler forble intakt. Dette tyder på at disse betulin derivater kan målrette relevante baner i acinar morphogenesis og dynamiske prosesser involvert i cellemotilitet (også EP156T cellene danner dynamisk «forgrening» strukturer som penetrerer ECM). For fenotypiske sammenligninger, testet vi et panel av referanseforbindelser rettet mot Akt, Rac, ROCK, Src, og andre veier, grovt knyttet til aktin cytoskjelettet. Ingen av de testede forbindelsene kontroll påvirket cytoskjelettet i en tilsvarende måte, med unntak av den ikke-spesifikke, pan-kinase inhibitor staurosporin. Men disse effektene var ikke ensartet over hele panelet av cellelinjer (figur 8B, forstørrelse til høyre).
Actin cytoskjelettet (trådformede eller F-aktin) er farget grønn (phalloidin), kjerner med et rødt fargestoff (
