Abstract
Protein Arginin Deiminases (pads) katalyserer post-translasjonell konvertering av peptidyl-Arginine til peptidyl-Citrulline i en kalsiumavhengig, irreversibel reaksjon. Bevis fremstår som pads spille en rolle i kreftutvikling. For å bestemme kreftassosierte funksjonelle implikasjoner av pads, vi utformet et lite molekyl PAD inhibitor (kalt Chor-amidin eller Cl-amidine), og testet virkningen av dette stoffet på cellesyklusen. Data fra eksperimenter i tykktarm kreft celler indikerer at Cl-amidine fører til en G1 arrest, og at dette var p53-avhengig. I et separat sett av eksperimenter, har vi funnet at Cl-amidin forårsaket en signifikant økning i mikroRNA-16 (miRNA-16), og at denne økningen var også p53-avhengig. Fordi miRNA-16 er en antatt tumor suppressor miRNA, og andre har funnet at miRNA-16 undertrykker proliferasjon, vi antatt at p53-avhengig G1 rest knyttet til PAD hemning var, i sin tur, avhengig av miRNA-16-ekspresjon. Resultatene er i samsvar med denne hypotesen. I tillegg, fant vi at G1 rest er i det minste delvis på grunn av evnen av Cl-amidin-mediert ekspresjon av miRNA-16 for å undertrykke dens «G1-assosiert målene: cykliner D1, D2, D3, E1, og CDK6. Våre studier belyser inn mekanismer som PAD hemming kan beskytte mot eller behandle tykktarmskreft
Citation. Cui X, Witalison EE, Chumanevich AP, Chumanevich AA, Poudyal D, Subramanian V, et al. (2013) Den Induksjon av mikroRNA-16 i Colon kreft celler ved Protein Arginine deiminase Hemming Forårsaker en p53-Dependent cellesyklus arrest. PLoS ONE 8 (1): e53791. doi: 10,1371 /journal.pone.0053791
Redaktør: Michel Simon, CNRS-universitetet i Toulouse, Frankrike
mottatt: 25 oktober 2012; Godkjent: 05.12.2012; Publisert: 07.01.2013
Copyright: © 2013 Cui et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: National Institutes of Health gi 5R01CA151304 til LJH og PRT (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
feilregulert protein arginin-deiminase (PAD) aktivitet er blitt foreslått å spille en rolle i utbruddet og progresjon av mange menneskelige sykdommer, inkludert kreft [1]. PAD er en familie av enzymer som omdanner peptidyl-Arginine til peptidyl-Citrulline (Arg → Cit) [2], en prosess som kalles «citrullination». Pattedyr kode 5 isoenzymer innenfor en enkelt evolusjonært konservert gen klynge, som hos mennesker er lokalisert på kromosom 1 (1p35-36) [3]. Pattedyr PAD familiemedlemmer, som har blitt utpekt som pads 1-4 og PAD6, er sterkt knyttet enzymer både innen og mellom enkeltarter. Forhøyede nivåer av PAD-enzymer og /eller citrullinated proteiner finnes i flere kroniske tilstander, inkludert kolitt og tykktarmskreft [1], [4], [5], [6], [7]. I lys av dette har vi utviklet inhibitorer av putene, og en spesiell inhibitor, kalt Chlor-amidin (Cl-amidin), har vist seg å ha cytotoksisitet mot kreft-cellelinjer [8], og kan anvendes for å forebygge og behandle den høye tykktarmskreft risiko sykdom, ulcerøs kolitt i mus [4].
microRNAs (miRNA) er evolusjonært konservert, 20- til 25-nukleotid lange, ikke-kodende RNA som binder seg til sine mål gjennom delvis komplementær sekvens anerkjennelse. Slike bindings-resultater i enten mRNA degradering eller inhibering av translasjon, og derfor undertrykket ekspresjon av miRNA målene [9]. Virveldyr genomer blir forutsagt å kode for så mange som 1000 unike mirnas [10], som antas å regulere ekspresjonen av minst 30% av gener [11]. Derfor er det ikke overraskende at mirnas har forskjellige biologiske aktiviteter, herunder regulering av celledeling, differensiering og apoptose. For dette formål er miRNA-16 en antatt tumor suppressor miRNA, og er nedregulert i en rekke humane kreftformer, inkludert kreft i tykktarmen [12], [13], [14], [15], [16], [ ,,,0],17], [18]. Som blir gjenkjent funksjon av miRNA-16 er at den styrer den cellesyklusen i første rekke gjennom en G1 cellesyklus kontrollpunkt [13], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [ ,,,0],25], [26]. Derfor, i fravær av miRNA-16, kan kreftceller vokse ukontrollert. Med dette i bakhodet, har det nylig blitt demonstrert at hemming av pads av Cl-amidine forårsaker induksjon av p21
WAF1, som fører til en G1 cellesyklus arrest i tykktarm kreft celler [27]. Bygge av disse resultatene, for bedre å forstå de mekanismer som Cl-amidine forårsaker en G1 cellesyklus arrest, viser vi her at i nærvær av p53, G1 arrest forårsaket av Cl-amidine er avhengig av miRNA-16.
Methods
Cl-amidin
syntesen av Cl-amidin er blitt beskrevet tidligere [28], [29]. Lager konsentrasjoner av Cl-amidin ble fortynnet i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) umiddelbart før tilsetning til cellekulturer.
Cellekultur
HCT 116 villtype (WT) tykktarmskreftceller ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). HCT 116 p53
– /- kolon carcinoma celler ble avledet fra HCT 116 WT celler, og levert av B. Vogelstein og K. Kinzler. HCT 116 WT og p53
– /- celler ble dyrket i McCoys medium (ATCC, Manassas, VA) supplert med 10% serum fra nyfødt kalv (NBCS; GIBCO /Life Technologies, Grand Island, NY), 2 mM glutamin (Biofluids , Rockville, MD), penicillin (10 U /ml, Biofluids) og streptomycin (10 ug /ml, Biofluids). LS-180 tykktarmskreftceller, kjøpt fra ATCC, ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Hyclone, Logan, Utah) supplert med 10% serum fra nyfødt kalv (NBCS); GIBCO /Life Technologies), 2 mM glutamin (Biofluids, Rockville, MD), penicillin (10 U /ml, Biofluids) og streptomycin (10 mikrogram /ml, Biofluids).
siRNA og miRNA Transfeksjon
For PAD4 siRNA, 3 x 10
5-celler ble dyrket i medium i 6 brønners plater 1 dag før transfeksjon. Ved hjelp av INTERFERin siRNA Transfeksjon Regent (Plyplus, iLllkirch, Frankrike) ble cellene transfektert med 20 nmol /L av scambled siRNA som en negativ kontroll eller PAD4 Trilencer-27 human siRNA (Origene, Rockville, MD). Etter 24 timer med transfeksjon ble cellene behandlet for western blot-analyse for å evaluere effekten av slå ned. Cellesyklusen ble undersøkt etter 24 timer for transfeksjon. For anti-MIR-16 og MIR-16-etterligne (Ambion, Austin, TX) transfeksjon, 3 x 10
5-celler ble dyrket i medium i 6 brønners plater 1 dag før transfeksjon. Ved hjelp av INTERFERin siRNA Transfection Reagent ble cellene transfektert med 45 nmol /L av egge siRNA som negativ kontroll og anti-MIR-16 eller HSA-MIR-16. Etter 24 timer med transfeksjon, ble cellene høstet i RNase fri EP-rør. Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol regent. RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved Nanodrop 2000. 10 ng av total RNA ble revers-transkribert til cDNA ved anvendelse av TaqMan mikroRNA Reverse Transcription sett med mikroRNA primere som var spesifikke for HSA-MIR-16 og de små kjerneprotein RNU6B (U6) for normalisering. qPCR måling av miRNA-16 og U6 uttrykk ble utført ved bruk av TaqMan mikroRNA Analyser med 7300 PCR analysesystem. Den relative ganger endring i miRNA-16 nivå ble brukt til å representere den relative overflod av miRNA-16 sammenlignet med U6 uttrykk. Etter 24 timer av transfeksjon med anti-MIR-16, ble Cl-amidin (50 ug /ml) tilsatt og høstet for cellesyklusanalyse ved 0 timer, 2 timer, 8 timer og 24 timer. Cellesyklusen ble også undersøkt 24 timer etter transfeksjon av miRNA-16 etterligne. Alle eksperimentelle kontrollprøver ble behandlet med en lik konsentrasjon av et ikke-målsøkende kontroll ligne sekvens eller inhibitor negativ kontrollsekvens, for bruk som kontroller for ikke-sekvensspesifikke effekter i miRNA eksperimenter. Mock-transfektert kontroller ga ikke noen vesentlig effekt på noen av de analyserte parametrene.
mikroRNA uttrykk
Globalt miRNA uttrykket.
HCT 116 WT celler ble sådd på en × 10
6 celler /plate i 6-brønners plater i triplikat. Etter dyrking i 24 timer ble 25 mikrogram /ml Cl-amidin tilsatt til hver brønn. Cellene ble høstet ved 0, 12, og 24 timer hver for seg i RNase fri EP-rør. Total RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol reagens (Ambion, Austin, TX). RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved Nanodrop 2000 (Nanodrop, Wilmington, DE). 100 ng av RNA fra HCT 116 WT celler ble brukt for NCounter miRNA Expression analysen v1.2 (Nanostring Technologies, Seattle, WA) inneholder 800 miRNA følger etter produsentens anvisninger.
miRNA-16 uttrykk.
celler ble sådd, utsatt for Cl-amidin, og høstet ved de samme tidspunkter som beskrevet for global miRNA ekspresjon. For miRNA-16 oppdagelse, ble 10 ng av total RNA brukes til å reversere-transkribere til cDNA ved hjelp av TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Bisystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens instruksjoner og miRNA primere spesifikke for HSA-miRNA-16 for påvisning og den lille kjernefysiske protein RNU6B (U6) for normalisering (Applied Biosystems). qPCR måling av miRNA-16 og U6 uttrykk ble utført ved bruk av TaqMan miRNA Analyser (Applied Bisystems) med 7300 PCR analysesystem (Applied Bioystems). Den komparative terskel syklus (Ct) metoden ble brukt til å evaluere den relative overflod av MIR-16 sammenlignet med U6 uttrykk (fold endringer i forhold til U6). Alle eksperimentelle behandlinger ble utført på tre separate anledninger; hver gang med tre gjentak.
Western blot analyse
Western blot ble utført som beskrevet tidligere [30]. Antistoffer brukt inkluderer anti-p53 (EMD Millipore, Rockland MA; Mouse monoklonale, katt # op43, 1:500), anti-p21
WAF1 /Cip1 (Sigma, Rabbit Polyclonal, katt # p1486, 1:1000), anti -GAPDH (Cell Signaling, Rabbit monoklonale, katt # 2118, 1:1000), og anti-PAD4 (Origene; Mouse monoklonale, katt # TA504813, 1:2000). Pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer ble innkjøpt fra Amersham. Begge sekundære antistoffer ble fortynnet til 1:2000. Western blot signal ble oppdaget av SuperSignal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Thermo Scientific, Rockford, IL) og utviklet på Hyper (GE biovitenskap, Piscataway, NJ).
Cell syklus analyse
1 × 10
6-celler ble vokse i 6-brønners plater i McCoys 5A medium en dag før behandling og deretter behandlet med 50 ug /ml Cl-amidin for tilsvarende tider. Cellene ble høstet og fiksert med iskald etanol. Etter vasking med 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 0,5% bovint serumalbumin to ganger, ble cellene inkubert med DNA-farging oppløsning bestående av propidium jodid (PI; 10 ug /ml) og RNase (0,1 mg /ml) i 30 minutter ved værelsestemperatur i mørket. Andelen av celler i hver fase av cellesyklusen, ble bestemt ved DNA-innhold farget med PI ved hjelp av en BD-LSR-II flow-cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA). Data fra ble analysert med BD FACSDiva programvare (BD Biosciences). Hver behandling ble gjentatt ved tre anledninger.
mRNA analyse
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, CA). Ett pg av total RNA tjente som templat for enkelt tråd cDNA-syntese på en reaksjon ved anvendelse av oligo (dT) primere og AMV revers transkriptase (Promega Corp., WI) under betingelser som er angitt av produsenten. PCR fra cDNA-prøvene ble utført med prøver forsterkede for 30 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 50 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 30 s med endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min . Sekvensene for Real Time PCR primere som ble brukt var: CCND1 Forward 5′-CCC TCG GTG TCC TAC TTC AA-3 «, CCND1 Reverse 5′-AGG AAG CGG TCC AGG TAG TT-3′; CCND2 Forward 5»-TGG GGA AGT TGA AGT GGA AC-3 «, CCND2 Reverse 5′-ATC CAC GTC TGT GTT GGT GA-3′; CCND3 Forward 5»-TGA TTT CCT GGC CTT CAT TC-3 «, CCND3 Reverse 5′-AGC TTC GAT CTG CTC CTG AG-3′; CCNE1 Forward 5»-ATC CTC CAA AGT TGC ACC AG-3 «, CCNE1 Reverse 5′-AGG GGA CTT AAA CGC CAC TT-3′; CDK6 Forward 5»-CCG TGG ATC TCT GGA GTG TT-3 «, CDK6 Reverse 5′-TCT CCT GGG AGT CCA ATC AC-3′; GAPDH Termin 5»-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3 «, GAPDH Omvendt 5′-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3» (Integrated DNA Technologies, Inc). Real-time PCR (qPCR) ble utført ved hjelp av 7300 Real-Time PCR-analyse System (Applied Biosystems, CA) med Power SYBR grønt PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA) og primere for CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CDK6 og GAPDH henhold til leverandørens protokoll. Den CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CDK6 genekspresjon ble normalisert ved GAPDH genuttrykk. The ganger endring i genuttrykk er i forhold til vektoren behandlet (1x PBS) celler høstet etter 24 timer.
statistikker
Når mer enn to grupper ble sammenlignet, bestemt vi statistiske forskjeller ved hjelp av en en-veis analyse av varians, etterfulgt av en Scheffe multiple sammenligningstest. Dersom to grupper ble sammenlignet, benyttet vi en Student T-test. For global miRNA analysen ble alle data importeres til NSolver Analysis Software v1.0 (Nanostring Technologies) og normalisert til geometrisk gjennomsnitt av de 100 microRNAs med de høyeste uttrykk verdier. Normalisert data ble importert til BRB-ArrayTools v4.1.0 for analyse. Før analyse av data ble filtrert, hvor en hvilken som helst verdi som er mindre enn 10 ble utelatt og noen mikroRNA mangler i 50% av prøvene ble ekskludert forlater 169 microRNAs for analyse. Klasse sammenligningstest benyttet Student t-tester for å sammenligne microRNAs av behandlede vs. ubehandlede celler. Trend tester brukt lineær regresjon modellering av bestilte kategoriske variabler av 0 h, 12 h og 24 h. Den Benjamini-Hochberg prosedyren ble brukt til å beregne falske funnrate. P verdi valgt for betydning i denne studien var 0,05.
Resultater
Cl-amidine fører til en p53-avhengig G1 arrest
For å utforske de funksjonelle konsekvensene av PAD hemming, vi først spurt om PAD-hemmer, Cl-amidine, påvirker cellesyklus. Ved hjelp av to uavhengige p53 WT tykktarmskreft cellelinjer, fant vi at Cl-amidine forårsaket en cellesyklus arrest i G1 fasen (Tabeller 1A og B; Tall S1A og S1B). Fordi virkningen på G1 fase var assosiert med en økning i p53 og p21 (figur S2), testet vi hypotesen om at Cl-amidin forårsaket G1 rest via en p53-mediert mekanisme. Resultatene er i samsvar med denne hypotesen. I motsetning HCT 116 WT celler, gjorde Cl-amidine ikke føre til en G1 arrest i isogen HCT 116 p53
– /- celler (tabell 1C, figur S1C). For å bekrefte at dette arrestasjonen var ikke på grunn av off-target mekanismer, vi slått ned PAD4 av siRNA (figur S3A), deretter undersøkt celleforandringer syklus. I samsvar med den forståelse at G1 cellesyklus arrest av Cl-amidine skyldes minst delvis til sin evne til å undertrykke PAD aktivitet, PAD4 knockdown også forårsaket en G1 cellesyklus arrest (tabell 1D, figur S3b) i HCT 116 celler. Cellesyklusen ble undersøkt 24 timer etter transfeksjon.
Cl-amidin bevirker en p53-avhengig induksjon av miRNA-16
Vi har tidligere vist at PAD-inhibitor, Cl-amidin, stimulerer apoptose av inflammatoriske celler og beskjedent stimulerer apoptose i HT-29 colon cancerceller [4]. I tillegg fikk vi bekreftet tidligere resultater fra Li et al. [27] i den PAD4 knock-down og Cl-amidine behandling forårsaket en G1 cellesyklus arrest i en p53-avhengig måte (tabell 1; Figurer S1 og S2). Siden miRNA-er har dukket opp som viktige moderatorer av colonic celleproliferasjon og apoptose [31] undersøkte vi globale miRNA uttrykk endringer i HCT 116 tykktarm kreft celler eksponert for Cl-amidine. Tabell 2 viser at det var en signifikant positiv korrelasjon i 11 mirnas, og betydelig negativ korrelasjon i 7 mirnas etter eksponering av HCT 116 celler til CL-amidin 0 t, 12 timer og 24 timer. Basert på den forståelse at miRNA-16 er nedregulert i tykktarmskreft [18], og miRNA-16 viste seg å være den miRNA som var mest oppregulert (betydelig) ved Cl-amidine (1,5 ganger på 12 timer, 2 fold på 24 timer, tabell 2), bestemte vi oss for å videre utforske konsekvenser og mekanismer for Cl-amidine-mediert miRNA-16 oppregulering. For å bekrefte miRNA-16 oppregulering av Cl-amidine, vi gjentok eksperimentet og undersøkt miRNA-16 aktivering av QRT-PCR. I samsvar med den globale miRNA analyseresultatene viser figur 1A at det var økende miRNA-16 ekspresjon med økende tid da HCT 116 celler ble eksponert for Cl-amidin, med betydning som blir oppnådd ved både 12 timer og 24 timer (p 0,05). Det var også en økning i miRNA-16 med økende tid utsatt for Cl-amidin i p53 WT LS-180 colon cancer-cellelinje; idet signifikans er nådd ved 24 timer (figur 1B). Den nedre Økningen i miRNA-16-induksjon er konsistent med den forholdsvis beskjedne G1 cellesyklusarrest i LS-180 celler (tabell 1B, figur S1B)
(A) HCT 116 WT celler.; (C) LS-180 celler .; (C) HCT 116 p53
– /- celler. Celler ble eksponert for 25 ug /ml Cl-amidin angitte tider (N = 9 plater per tidspunkt). ble oppdaget Relative endogene MIR-16 uttrykk nivåer av QRT-PCR bruker TaqMan primere og prober for å påvise moden MIR-16 og den lille kjernefysiske RNA RNU6B (U6), en intern kontroll. Relative MIR-16-ekspresjonsnivåer ble normalisert til gjennomsnittsverdien av de ikke-behandlede prøver (0-t). * Indikerer signifikant forskjell fra 0 hr kontroll.
Fordi p53 forbedrer post-transcriptional modning av miRNA-16 [32], og Cl-amidine fører til en induksjon i p53 (figur S2), vi undersøkt om induksjon av miRNA-16 ved Cl-amidine var p53-avhengig. Figur 1C viser Cl-amidine var ute av stand til å føre til en økning i miRNA-16 i HCT 116 p53
– /-. Celler, indikerer miRNA-16 induksjon var faktisk p53-avhengig
p53-avhengige G1 arrestasjonen av Cl-amidine reguleres av miRNA-16
Gitt den observasjon at både G1 arrest og økning i miRNA-16 ved Cl-amidine var p53-avhengig; at p53 øker modningen av MIR-16 [32]; og det andre har vist miRNA-16 bevirker en G1 arrest [13], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], vi hypotese at miRNA-16 er i krysningen av p53-avhengige G1 arrest indusert av PAD hemming. For å teste denne hypotesen, vi slått ned miRNA-16 (figur S3C) i HCT 116 celler, deretter eksponert cellene til CL-amidine. Resultatene vist i tabell 3A og fig S3D faktisk indikerer at G1 rest forårsaket av Cl-amidin i HCT 116 WT-celler er avhengig av miRNA-16, fordi i fravær av miRNA-16, Cl-amidin var ute av stand til å forårsake cellesyklusen arrestere. For å bekrefte disse resultatene, transfektert vi HCT 116 celler med miRNA-16 siRNA og en miRNA-16 etterligne. Etter inkubering i 24 timer uten transfeksjon, transfeksjon av miRNA-16 siRNA eller MIR-16 ligner, ble cellene høstet og cellesyklus undersøkt. Tabell 3B viser miRNA-16 ligne forårsaket en G1 cellesyklus arrest, støtter hypotesen om at induksjon av miRNA-16 ved Cl-amidine er en viktig hendelse som fører til en G1 arrest i tykktarm kreft celler med en p53 WT bakgrunn. Tatt sammen, konkluderer vi at p53-avhengig G1 arrest er igjen avhengig av evnen til PAD hemming av Cl-amidine å opp-regulerer uttrykket av miRNA-16.
CL-amidin årsaker en nedregulering av miRNA-16 som er involvert i en G1 arrest
Vi har vist at miRNA-16 er i krysningen av G1 arrest i tykktarm kreft celler ved Cl-amidine. Det vil derfor stå til grunn for å undersøke effekten av Cl-amidine på miRNA-16 mål som er involvert i en G1 cellesyklus arrest. Slike mål inkluderer: cyklin D1 (CCND1) [13], [19], [33], [34], [35], [36], cyklin D2 (CCND2) [13], cyklin D3 (CCND3) [33] , cyklin E1 (CCNE1) [13], [21], [24], [35], og cyklin-avhengig kinase-6 (cdk6) [35]. Ved undersøkelsen av virkningen av Cl-amidin på følgende miRNA-16 mål, har vi funnet en signifikant reduksjon i alle endepunkter (figur 2). Dette er i overensstemmelse med hypotesen om at PAD inhibering av Cl-amidin aktiverer miRNA-16, som i sin tur, nedregulerer flere gener som er kjent å være involvert i G1 progresjon.
HCT 116-celler ble behandlet med 1 x PBS ( -.) eller 25 mikrogram /ml Cl-amidin (+) i 24 timer, deretter RNA høstet for qPCR som beskrevet i metodene. Den CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, og CDK6 genekspresjon ble normalisert ved GAPDH genuttrykk. * Indikerer signifikant forskjell fra kontrollgruppen (-) (p 0,05)
Diskusjoner
pads ble først oppdaget i virveldyr i begynnelsen av 1980-tallet innenfor epidermis av nyfødte rotter [. ,,,0],37]. Siden da har det blitt stadig klarere at PAD aktivitet, med resulterende protein citrullination, driver mange inflammatoriske sykdommer og kreft, inkludert kolitt og tykktarmskreft [1], [4], [5], [6]. Derfor, for å utvikle behandlinger basert på PAD signalering for å undertrykke eller forebygge kreft i tykktarmen, er det viktig å forstå mekanismene. Vi har identifisert at inhiberingen av putene ved vår nye små molekyl-inhibitor (Cl-amidin) undertrykker den høye tykktarmskreftrisiko sykdom, ulcerøs kolitt, i mus [4]. Her har vi utvidet disse studiene, og viste at Cl-amidin bevirker en G1 cellesyklusarrest i kolon kreftceller, at denne effekten er mediert av opp-regulerer ekspresjonen av det antatte tykktarmskreft tumor suppressor mikroRNA, miRNA-16; og at dette bare skjer i nærvær av tumor suppressor protein, p53. Selv om vi har ennå til å vise at Cl-amidine undertrykker tykktarmskreft hos mus, resultatene her dissekere mekanismer som PAD hemming av Cl-amidine vil sannsynligvis undertrykker tykktarmskreft. Gitt den nære sammenhengen mellom tykktarmsbetennelse og tykktarmskreft [38], [39], [40], [41], [42], vår tidligere studie som viser at Cl-amidine undertrykker kolitt [4] spår også at Cl-amidine kan anvendes for å forebygge og /eller behandle kreft i tykktarmen. I tillegg til å undertrykke betennelse, viser denne studien at en ekstra mekanisme (for å undertrykke tykktarmskreft med Cl-amidine) er gjennom p53 og miRNA-16 avhengig G1 cellesyklus arrest i tykktarm kreft celler. Den nøyaktige begrunnelsen for cellesyklus arrest forårsaket av PAD hemming-mediert økning i miRNA-16, men er fortsatt ikke klarlagt. Selv om vi så en økning i p21
WAF1 med Cl-amidine behandling (figur S2), dette synes ikke å være den eneste hendelsen som forårsaker G1 arrest, på grunn av vår miRNA-16 bevis (miRNA-16 ablasjon benekter G1 arrest av Cl-amidine: Tabell 3; Tallene S3C og S3D). For å oppnå dette, har miRNA-16 dukket opp som en spesielt viktige miRNA i G1 cellesyklus sjekkpunkt. miRNA-16 mål flere cellesyklus regulatorer, inkludert cyclin D1 (CCND1), cyclin D2 (CCND2), cyclin D3 (CCND3), cyclin E1 (CCNE1), cyclin-avhengig kinase-en (CDK1), CDK6, cdc25a, og ADP -ribosylation faktor-lignende protein 2 (ARL2) [13], [19], [21], [24], [26], [33], [34], [35], [36], [43], [44]. Gitt deres klare roller i å drive progresjonen av delende celler gjennom G1 fase, spesielt cdk6, cyklin D, og cyclin E, evne til miRNA-16 for å målrette mot slike molekyler er den mest sannsynlige årsaken til våre funn (figurene 2 og 3) . En annen separat sett av eksperimenter utenfor omfanget av denne studien innebærer de funksjonelle konsekvensene av andre miRNA er vist å ha ulike uttrykk etter eksponering av HCT 116 celler til CL-amidine (tabell 2).
hemming av pads av Cl-amidin aktiverer p53, som i sin tur aktiverer miRNA-16. Aktivering av miRNA-16 fører til en G1 cellesyklus arrest, antagelig ved å målrette cykliner D, E og /eller CDK6.
Siden Cl-amidine er en pan-PAD-hemmer [45], er det fortsatt å bli vist som PAD er nøkkelen til induksjon av en G1 cellesyklus arrest. Våre funn at nedregulering av PAD4 gjennom siRNA bevirker en tilsvar G1 arrest med den i Cl-amidin (tabellene 1A og 1D), indikerer PAD4 er i det minste en av de viktigste PAD enzymer som er ansvarlige for cellesyklusprogresjon uavhengig av de andre PAD . I samsvar med dette funnet er den forståelse at PAD4 aktivitet er forhøyet i tykktarm adenokarsinomer [6]. Men på grunn av den pan-PAD aktivitet av Cl-amidine, vi kan ikke utelukke effekten av andre pads på cellecyklusprogresjonen. Dette gjelder spesielt for PAD kjent for å bli uttrykt i celler av epitelial /karsinom opprinnelse (de som ble brukt i denne studien), inkludert PAD1 [46], PAD2 [47] og PAD3 [7].
Vårt funn at Cl-amidin forårsaker en induksjon av p53 (figur S2) og hemmer cellevekst i et p53-avhengig måte som er i overensstemmelse med andre grupper [27], [48]. Mekanismene for p53 induksjon av PAD hemming imidlertid fortsatt uklare. PAD4 kan regulere ekspresjon av gener katalysere posttranslational citrullination av en rekke Arg-rester i histon substrater [49], [50]. PAD4 kan rekrutteres til histoner ved sin interaksjon med p53 [27]. Som et resultat, blir PAD4 rekruttert til promoterene fra p53-målrettede gener hvor det citrullinates histoner og undertrykker transkripsjonen av p53-målrettede gener. PAD4 kan også citrullinate ikke-histonproteinene som forbinder med p53 og er involvert i kreftutvikling. Spesielt, kan PAD4 citrullinate hemmer vekst protein 4 (ING4), og dermed hemme ING4-mediert aktivering av p53 [51]. Slike mekanismer støtter funn at PAD hemming av Cl-amidine fører p53 induksjon. Endelig er vi utforsker muligheten for at p53 kan være citrullinated, som fører til generering av SDS-uløselig tilslag, i likhet med en rekke kreft forbundet p53 mutasjoner [52]. Dersom dette er tilfelle, inhibering av p53 citrullination (med Cl-amidin) ville føre til økt p53-nivåer ved å forhindre aggregering denne fenotype.
Som konklusjon, gitt den økende forståelse for at PAD-aktivitet (og resulterende citrullination) spiller en nøkkelrolle i kroniske sykdommer slik som inflammatoriske sykdommer og kreft, er det viktig å bedre forstå mekanismene. Meget lite er for tiden kjent i denne forbindelse. Med hensyn til kreft, her har vi vist at miRNA-16 spiller en viktig rolle i moduler G1 cellesyklus sjekkpunkt indusert av PAD hemming i p53 WT tykktarmskreft cellelinjer
in vitro
. Selv om
in vivo
oversettelsen gjenstår å vise disse nåværende eksperimenter kaste lys inn i mekanismen som PAD hemming av vår roman PAD-hemmer, Cl-amidine fungerer. Våre mekanistiske funn åpner opp muligheten for at PAD-hemmere alene, eller sammen med p53 og /eller miRNA-16 etterligner, kan ha effekt i chemoprevention og /eller behandling av tykktarmskreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Representative strømningscytometriske histogrammet på angitt tykktarm kreft cellelinjer. (A) Histogram ved angitte tidspunkter som viser Cl-amidin (50 ug /ml) induserer en fase G1 arrest i HCT 116 celler, som er p53 WT. (B) Histogram ved angitte tidspunkter som viser Cl-amidin (50 ug /ml) induserer en fase G1 arrest i LS-180 celler, som er p53 WT. (C) Histogram på angitte tidspunkter viser Cl-amidine (50 mikrogram /ml) ikke induserer en G1 fase arrest i HCT 116 p53
– /- celler, som er mangelfull i p53
doi:. 10,1371 /journal.pone.0053791.s001 product: (TIF)
Figur S2.
Cl-amidin forårsaker en induksjon i p53 og p21 i HCT 116 celler, men ikke i HCT 116 p53
– /- celler. Celler ble utsatt for angitte konsentrasjoner av Cl-amidin i 24 timer, deretter høstet for western blot-analyse. Tall under band er GAPDH justert densitometry verdier i forhold til kontrollgruppen (0 mikrogram /ml Cl-amidine)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0053791.s002 plakater (TIF)
Figur S3 . product: (A, B). Knocking ned PAD4 (A) fører til en G1 cellesyklus arrest i HCT 116 celler (B). (A) Western blot-analyse som viser PAD4 knockdown med siRNA til PAD4. Tall under band er GAPDH justert densitometry verdier i forhold til egge siRNA kontrollgruppen. (B) Representative cellesyklus tomter etter 24 timer. transfeksjon med enten egge siRNA eller siRNA til PAD4. (C, D). Etter banket ned MIR-16 (C), betyr Cl-amidine (50 mikrogram /ml) ikke føre til en G1 cellesyklus arrest i HCT 116 celler (D). (C) Kvantifisering av miRNA-16 uttrykk ved Q-PCR. * Indikerer signifikant reduksjon i miRNA-16-ekspresjon etter 24 timer post-transfeksjon, sammenlignet med egge kontroll siRNA. Merk at Cl-amidine ikke påvirke effektiviteten av miRNA-16 knockdown. (D) Representative strømningscytometrisk histogrtams etter 24 timer. transfeksjon med anti-MIR-16, og deretter eksponering av Cl-amidin (50 ug /ml) for angitte tidspunkter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0053791.s003 plakater (TIF)
