Abstract
Autophagy er en svært regulert, energiavhengig cellulær prosess hvor proteiner, organeller og cytoplasma er sequestered i autophagosomes og fordøyd å opprettholde cellulære homeostase. Vi antok at under autophagy indusert i kreftceller ved i) sult gjennom serum og aminosyre mangel eller ii) behandling med PI-103, et klasse I PI3K /mTOR inhibitor, ville glykolytisk metabolisme bli påvirket, noe som reduserer fluks til laktat, og at denne effekten kan være reversibel. Vi undersøkt metabolisme under autofagi i kolorektal HT29 og HCT116 Bax knock-out celler ved hjelp hyperpolarized
13C-magnetisk resonans spektroskopi (MRS) og steady-state
1 H-MRS. 24 timer PI103-behandling eller sult forårsaket signifikant reduksjon i den tilsynelatende fremover hastighetskonstanten (k
PL) for pyruvat til laktat utveksling sammenlignet med kontroller i HT29 (100 uM PI-103: 82%, p = 0,05) og HCT116 Bax -ko-celler (10 pM PI-103: 53%, p = 0,05; 20 uM PI-103: 42%, p 0,0001, sult: 52%, p 0,001), forbundet med redusert laktat utskillelse og intracellulær laktat i alt saker, og uendret laktat dehydrogenase (LDH) aktivitet og økt NAD + /NADH ratio følgende PI103 behandling eller redusert LDH aktivitet og uendret NAD + /NADH ratio følgende sult. Etter 48 timers utvinning fra PI103 behandling, k
PL forble under kontrollnivåer i HT29 celler (74%, p = 0,02), og økt ovenfor behandlet verdier, men forble under 24 timers behandlede kontrollnivåer i HCT116 Bax-ko celler (65%, p = 0,004) begge var ledsaget av vedvarende reduksjon i utskillelse laktat, utvinning av NAD + /NADH-forhold og intracellulær laktat. Etter utvinning av sult, k
PL var signifikant høyere enn 24 vehikkelbehandlede kontroller t (140%, p = 0,05), forbundet med øket LDH-aktivitet og totalt cellulært NAD (H). Endringer i k
PL og mobilnettet og utskilles laktat gitt målbare indikatorer på de store metabolske prosesser følger starvation- og legemiddelindusert autofagi. Endringene er reversible, tilbake mot og overstiger kontrollverdier på mobilnettet utvinning, som potensielt identifiserer motstand. k
PL (hyperpolarized
13C-MRS) og laktat (
1 H-MRS) gir nyttige biomarkører for autophagic prosessen, slik at ikke-invasiv monitorering av Warburg effekten
Citation.: Lin G, Andrejeva G, Wong Te Fong AC, Hill DK, Orton MR, Parkes HG, et al. (2014) Redusert Warburg Effect i kreftceller gjennomgår Autophagy: steady-state
1 H-MRS og Real-Time hyperpolarized
13C-MRS Studies. PLoS ONE 9 (3): e92645. doi: 10,1371 /journal.pone.0092645
Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA
mottatt: 27 juni 2013; Godkjent: 25 februar 2014; Publisert: 25 mars 2014
Copyright: © 2014 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne erkjenne mottatt støtte fra Cancer Research UK og EPSRC Cancer Imaging Centre i forbindelse med MRC og Department of Health (England) gi C1060 /A10334, også NHS midler til NIHR Biomedical Research Centre, MRC-finansierte student, også Chang Gung Medical Foundation (Taiwan) gir CMRPG370443 og CMRPG3B1922. MOL er en NIHR Senior etterforsker. Forfatterne takker også Alice warley ved Kings College London Senter for ultra Imaging (CUI) for å få hjelp med elektronmikroskopi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Autophagy er en lysosome avhengig reversibel katabolsk cellulær respons aktivert i sult eller stress der proteiner, organeller og cytoplasma er sequestered i doble-membran autophagosomes og deretter fordøyd og resirkuleres for å opprettholde cellenes stoffskifte [1]. Autophagy er avgjørende for å opprettholde cellulære homeostase og er en svært regulert prosess som kan fylle tomme energi butikker under sult ved fjerning og nedbrytning av cytoplasmatiske komponenter. Imidlertid kan langvarig aktivering av autophagic veier fører til uttømming av organeller og kritiske proteiner som kan føre til celledød [2], [3]. Autophagy har vært undersøkt i mange forskningsfelt, inkludert kreft [2] – [4], kardiovaskulær sykdom [5] og nevrodegenerasjon [6], siden på den ene siden det tilveiebringer en biologisk beskyttelsesmekanisme som reaksjon på cellespenninger, men på den annen det kan også bidra til celledød mekanismer. Denne prosessen kan paradoksalt tillate kreftceller til å overleve i fiendtlige omgivelser og hjelpemiddel utvinning når belastningen er fjernet, noe som gir en potensiell mekanisme for resistens overfor terapi [4]. Noen anti-kreft behandlinger, for eksempel PI3K /mTOR-hemmere, er kjent for å indusere autofagi i kreftceller [7] og kan også føre til autofagi i tumorer, potensielt forlenge svulst overlevelse [4], [8]. For tiden er autophagy beste vurdert ved observasjon av dobbeltmembran autophagic vakuoler ved elektronmikroskopi (EM) og western-blotting av omdannelsen av ubiquitin-lignende protein LC3I til LC3II [9]. Det er for tiden ingen ikke-invasive metoder for å overvåke induksjon av autofagi eller påfølgende utvinning fra autofagi. Videre er de metabolske endringer som følger autofagi og gjenvinning fra denne prosess dårlig forstått.
Kreftceller ofte utviser forbedret aerob glykolyse, også kjent som Warburg effekt med økt transkripsjonsregulering av en rekke glykolytiske enzymer inkludert laktatdehydrogenase -A (LDH-A). Økt Warburg virkning har vist seg å drive både tumorvekst og spredning av metastaser, og er assosiert med dårlig resultat i kreft [10]. Autophagy involverer mange store metabolske prosesser, hvorav noen er regulert av onkogene signalveier. Det er betydelig samspill mellom autophagic kontrollpunktene og sentrale noder i onkogene signaliseringsreaksjonsveier som fører til skoleveien inhibitorer i noen tilfeller direkte påvirker autophagic prosessen, eller indirekte modulering av den samme metabolske baner som induseres av autofagi [11], [12]. For eksempel, hemming av mTORC1 er en sentral pådriver for induksjon av autophagy i kreftceller [11], [12]. Cellulært stress som følge av mangel på aminosyrer eller direkte PI3K hemming kan føre til autofagi via hemming av mTORC1 med begge disse prosessene som forårsaker metabolske effekter i tillegg til de som oppstår direkte fra autofagi. Slike situasjoner kan også oppstå under kreftbehandling hos pasienter.
Magnetic Resonance Imaging (MRI) er mye brukt for bildebehandling i medisin og MR spektroskopi (MRS) gir kjemisk spesifikk analyse av metabolittkonsentrasjoner i celleekstrakter, hele celler , vev biopsier og
in vivo product: [13]. Nylige fremskritt innen hyperpolariserte
13C-magnetisk resonansspektroskopi (MRS) som anvender dynamisk Nuclear Polarisering (DNP) har muliggjort en betydelig forbedring av den indre
13 C-MRS signal av mange størrelsesordener i en rekke metabolitter og har aktiverte virkelig -Tid målinger av kinetikken av en rekke viktige endogen enzymreaksjoner både
in vitro
i suspensjoner av levedyktige hele celler og
in vivo
i tumorer [14]. Den tilsynelatende valutakursen konstant av hyperpolarized [1-
13C] pyruvat til laktat (k
PL) gir en potensiell metabolsk biomarkør for diagnostisering [15] og for å vurdere behandlingsrespons [16] – [20]. k
PL har også vist seg å redusere følgende medikament indusert celledød, tilskrevet apoptose med aktivering av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og uttømming av kofaktorer nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD (H)) [14 ].
TCA-syklusen er ventet å være mer aktiv i løpet av autophagy, som aminosyrer og fettsyrer som genereres av autophagic prosess benyttes for å opprettholde energi homeostase [21], som fører til modulering av aerob glykolyse i autophagic celler. Vi antok at disse endringene vil føre til en reduksjon i forandring fra pyruvat til laktat, noe som kan bli reversert dersom cellene utvinnes fra autofagi. I denne studien målte vi den tilsynelatende [1-
13C] pyruvat til laktat valutakurs, k
PL, ved DNP og
13C-MRS, for å utvikle en ikke-invasiv biomarkør for narkotika indusert autofagi og påfølgende utvinning fra autofagi, og for å få ytterligere innsikt i de metabolske endringer som følger legemiddelindusert autofagi. Vi undersøkte de langsgående metabolske endringer knyttet til legemiddelindusert autofagi og utvinning og sammenlignet dem med de metabolske endringer knyttet til den etablerte modellen av autofagi, induksjon av sult. Vi brukte to cellelinjer, HT29 og Bax-mangel HCT116 colon carcinoma (HCT116 Bax-ko) [22], i disse studiene. HCT116 Bax-ko-celler har nedsatt apoptose reaksjonsveier som tillater evaluering av de metabolske forandringer assosiert med medikament-indusert autophagy i fravær av apoptose. Autophagy ble indusert i disse cellene enten ved å serum og aminosyre sult med Hanks «balanserte saltløsning (HBSS) media, eller ved behandling med PI-103, et klasse I PI3K /mTOR-inhibitor [7].
Vårt studien bekreftet våre hypoteser, som viser at celler som gjennomgår autofagi hadde redusert k
PL målt med DNP og
13C-MRS, sammen med redusert intracellulær laktat og laktat utskillelse målt ved
1 H-MRS, noe som reflekterer en redusert Warburg effekt under starvation- og narkotikainduserte autophagic cellulære prosesser. Disse viktige metabolske effekter er reversert når celler gjenopprette fra starvation- og legemiddelindusert autofagi, noe som gir en potensiell metode for identifisering motstand. Resultatene viser at målingene av k
PL av hyperpolarized
13C-MRS, samt laktat ved
1 H-MRS gi sensitive biomarkører av de metabolske effekter knyttet starvation- og legemiddelindusert autofagi sammen med sin utvinning, og gir viktig informasjon om en viktig del av kreft celle metabolisme.
Materialer og metoder
Cell kultur
Alle medier og reagenser for cellekultur ble kjøpt fra Life Technologies . HT29-celler (fra American Type Culture Collection, ATCC) ble dyrket i McCoy 5A medium med glutamin og HEPES. HCT116 Bax-ko-celler (en slags gave fra Dr. Bert Vogel, Johns Hopkins Medical Center, USA, via Dr. Paul Clarke, ICR, Sutton, UK [23]) ble dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium glutamin, og ikke- essensielle aminosyrer. 10% varmeinaktivert FCS med 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ble tilsatt i alle medium. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære og vekstmedier påfylt hver 48. time. HT29-celler ble behandlet med 100 uM PI-103 i 24 timer. HCT116 Bax-ko-celler ble behandlet med HBSS medium for 6 eller 24 timer og med 10 uM eller 20 uM PI-103 i 24 timer.
For den cellulære metabolske og analyse av celler utvunnet fra autophagy, 24 hr HBSS eller 20 uM PI-103-behandlede HCT116 Bax-ko-celler og 100 uM PI-103-behandlede HT29-celler ble opprettholdt i ytterligere 48 timer i normal DMEM (med glutamin, ikke-essensielle aminosyrer, 10% føtalt kalveserum og penicillin tilsettes) eller McCoy 5A medium (med glutamin og HEPES) kulturmedier under standardbetingelser, respektivt.
Cell-syklusanalyse
2 x 10
6-celler ble fiksert med 70% etanol i 30 minutter ved 4 ° C, inkubert med 100 pg /ml RNAase og 40 ug /ml PI i fosfat-bufret saltvann for 301min ved 37 ° C. DNA-histogrammer ble samlet ved FACS-analyse.
Annexin V /PI analyse
5 x 10
5-celler ble resuspendert i bindingsbuffer, inkubert ved 25 ° C i 5 min i mørke med 5 ul fluoresceinisotiocyanat (FITC) -annexin-V og 5 ul PI (BioVision), og analysert ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS, BD LSRII strømningscytometer) for å bestemme annexin-binding og PI utelukkelse.
Western blotting
Cellelysater ble analysert ved western blotting som beskrevet tidligere [22]. Cellelysat protein ble overført til Immobilon-P-membran (Millipore, Bedford, MA, USA). Blotter ble blokkert i 5% fettfri melk eller 5% bovint serumalbumin og deretter inkubert med primært antistoff for pS6RP (Cell Signaling), S6RP (Cell Signaling), P4E-BP1 (Cell Signaling), total 4E-BP1 (Cell Signaling) , Pakt (Cell Signaling), total Akt (Cell Signaling), kløyvde PARP (Cell Signaling), caspase 3 (Cell Signaling), LC3 (Cell Signaling), MCT-en (Millipore) eller MCT-4 (Santa Cruz Biotechnology). Membranene ble deretter inkubert med anti-kanin-sekundært antistoff (GE Healthcare). Western blot for α-tubulin (Cell Signaling) ga en lasting kontroll. Spesifikke bindings antistoff-target protein interaksjoner ble oppdaget ved hjelp av forbedret chemiluminescence pluss reagenser (Amersham Biosciences, Buckingham-shire, UK) og eksponering for enten Hyper ECL (Amersham) eller XOMAT Kodak (Rochester NY, USA) autoradiografi film.
laktat dehydrogenase enzymatisk analyse
Totalt mobil LDH aktiviteter ble målt ved hjelp av standard Spectro-fotometriske metoder [24]. Celler ble oppsamlet ved standard trysin behandling, lysert på is i ekstraksjonsbuffer (Trietanolamin /HCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl
2 2 mM, merkaptoetanol 26 mM) og sentrifugert ved 16 000 g i 10 minutter for å gi total proteinkonsentrasjoner i supernatantene av ca. 5 mg /ml. Reaksjoner ble startet ved tilsetning av analyseløsninger (Trietanolamin /HCl 60 mM, NADH 0,17 mM, natriumpyruvat 0,4 mM, Triton 0,05%), og aktivitetene til LDH enzymer ble målt spektrofotometrisk ved 340 nm, med enzymatiske aktiviteter målt som nmol /min per millioner av celler.
NAD + /NADH måling
Totalt cellulære NAD + /NADH forhold ble målt ved hjelp av en NAD + /NADH kvantifisering kit (BioVision, Mountain View, CA, USA), i henhold til protokollen forutsatt.
elektronmikros
Celler ble dyrket i 13 mm skåler og fast i 4 timer i 2,5% glutaraldehyd fiksativ i fosfatbuffer ved 4 ° C. Etter fiksering ble cellemono plassert i glutaraldehyd vaskeløsning og deretter legge-fiksert i Millonigs osmiumtetroksyd fiksativ i 15-30 minutter. Kulturene ble dehydratisert gjennom en gradert serie på 10% til 100% etanol, infiltrert, og deretter innleiret i medium TAAB Premix Resin. Ultratynne seksjoner ble samlet på kobbernett og farget med uranylacetat og bly citrate. Snittene ble sett ved hjelp av en Hitachi H7600 transmisjonselektronmikroskop.
DNP
13C-MRS studier
[1-
13C] pyrodruesyre inneholdende 15 mM OX63 frie radikaler ble polarisert for 1 time i en HyperSense DNP polarisator (Oxford Instruments Molecular Biotools Ltd, Abingdon, UK) på 3.35T og 1,4 K som beskrevet tidligere [25]. Den polariserte prøven ble oppløst i en fosfat-bufret oppløsning inneholdende 50 mM ikke-merket laktat, EDTA og NaOH for å oppnå en slutt-pH på 7. 100 pl av denne blandingen ble tilsatt til en 500 mL suspensjon av celler (~40-80 millioner celler) i et 5 mm NMR-rør. Den endelige konsentrasjonen av polarisert pyruvat var 8 mm, etter som serie
13C-MRS spektra ble kjøpt i en BBO sonde hver 2 sek med en 10 ° radiofrekvens puls på en 500 MHz Bruker NMR system (Bruker Biospin, Coventry, UK). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C gjennom hele. Serie spektra var fasen og baseline korrigert, og integrert ved hjelp Topspin programvare (Bruker Biospin, Coventry, UK). De integrerte topp integraler i pyruvat /laktat eksperimenter ble plottet som en funksjon av tid og minste kvadraters sittende ble utført i Matlab (The Mathworks Inc, Natick, MA, USA). De tilsynelatende hastighetskonstanter ble oppnådd ved samtidig montering pyruvat og laktat integraler til de modifiserte Bloch likninger ved hjelp av en to-site utveksling modell innlemme flip-vinkel korreksjon som tidligere beskrevet [25]. De tilsynelatende hastighetskonstanter (k
PL) for foroverreaksjonen av konvertering av pyruvat til laktat er normalisert til celle nummer.
1 H-MRS ° f kulturmedium og celleekstrakter
Celler ble hentet av to fase ekstraksjon prosedyrer som tidligere beskrevet [26]. Vannløselige ekstrakter ble frysetørret og rekonstituert i 700 ul deuterert vann (D
2o, Sigma Aldrich) og ekstraktene (500 ul) som er lagt inn i 5 mm NMR-rør. 50 ul av 0,75% natrium-3-trimetylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionate (TSP) i D
2O (Sigma Aldrich) ble tilsatt til prøvene for kjemisk skift kalibrering og kvantifisering. Kultur media prøver fra celler etter ulike behandlingsregimer ble også analysert ved
1 H-MRS, samlet før cellene ble høstet for cellulære ekstraksjon. 500 mL av mediet prøve og 50 ul D
2o ble plassert i NMR-røret med 50 ul av 0,75% TSP i D
2o for kjemisk skift kalibrering og kvantifisering. Spektrale oppdrag var basert på litteraturverdier [27].
1 H spektra ble kjøpt med en MHz spektrometer Bruker 500 (Tyskland) med 7500 Hz spektral bredde, 16384 tidsdomene poeng, 128 skanninger, temperatur 298K, oppkjøp tid ca 5 minutter. Vannet resonans ble undertrykket ved gated bestråling sentrert på vannet frekvens. Spectral behandlingen ble utført ved hjelp av Topspin-to programvarepakke (Bruker Biospin, Coventry, UK), og metabolittkonsentrasjoner ble kvantifisert og normalisert til celle nummer.
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet. For sammenligning av metabolsk fluks, metabolittkonsentrasjoner og forhold, ble det uparede t-test anvendt sammen med en P-verdi på ≤0.05 ansett for å være statistisk signifikant. Alle statistiske tester var tosidig.
Resultater
PI-103-behandling og sult fører til reversibel autofagi i HT29 og HCT116 Bax-ko celler
Induksjon av autophagy ble observert i HCT116 Bax-ko og HT29 celler behandlet med PI-103, som bekreftes av over-uttrykk for LC3II i vestlige blotter (Figur 1a og b). Induksjon av autophagy og over-ekspresjon av LC3II ble også funnet i HCT116 Bax-ko-celler etter 6 og 24 timer av sult i HCT116 Bax-ko-celler (Figur 1a). Et høyere nivå av LC3I og LC3II uttrykk ble sett etter 24 timer av sult sammenlignet med 6 timers sult. Etter fjerning av PI-103 behandling eller etterfylling av normal vekstmedium etter 24 timers av PI-103 behandling eller sult, henholdsvis over-ekspresjon av LC3II returnerte til basalnivåer etter 48 timer for utvinning (figur 1 b-d). Derfor ble det 48 timers tids poeng etter 24 timers sult eller PI-103 behandling valgt for DNP og
1 H-MRS utvinning målinger. Det var ingen indikasjon på apoptose, som vist ved mangelen på spaltede PARP eller endring i kaspase 3 uttrykk i PI-103-behandlede eller sultet celler (Figur 1a-d). For å oppnå en positiv kontroll for apoptose, ble apoptose indusert i (WT) celler HCT116 villtype av TRAIL behandling, som TRAIL har blitt rapportert å indusere apoptose i HCT116 WT-celler [22]. Som forventet, ble det observert at nærvær av spaltet PARP og redusert caspase tre-nivå i TRAIL-behandlede HCT116 WT-celler sammenlignet med vehikkelbehandlede kontroller (figur 1 b og c).
(a) Western-blots av LC3, spaltes PARP, Caspase 3 og α-tubulin i kontroll HCT116 Bax-ko-celler og på 10 uM eller 20 uM PI-103-behandlede eller 6 timer og 24 timer HBSS-behandlede HCT116 Bax-ko-celler. (B) Western blot av LC3, kløyvde PARP, Caspase 3 og α-tubulin i kontroll HT29 celler og i 24 timer 100 mikrometer PI-103-behandlede HT29 celler og ved 24 timer, 48 timer og 72 timer av sin utvinning. TRAIL-behandlede HCT116 WT celler blir anvendt som positiv kontroll for apoptose, som TRAIL har blitt rapportert å indusere apoptose i HCT116 WT-celler [22]. Som forventet ble det observert tilstedeværelse av spaltet PARP og sterkt reduserte caspase 3 uttrykk i 24-timers TRAIL behandlet HCT116 WT celler sammenlignet med kjøretøy behandlede kontroller. (C) Western blot av LC3, kløyvde PARP, Caspase 3 og α-tubulin i kontroll HCT116 Bax-ko celler og i 24 timer 20 mikrometer PI-103-behandlede HCT116 Bax-ko celler og på 24 timer og 48 timer av sin utvinning . TRAIL-behandlede HCT116 WT celler er brukt som positiv kontroll for apoptose. (D) Western blot av LC3, kløyvde PARP, Caspase 3 og α-tubulin i kontroll HCT116 Bax-ko celler og i 24 timer HBSS-behandlede HCT116 Bax-ko celler og på 24 og 48 timer av sin utvinning.
tilstedeværelsen av autophagic vakuoler ble bekreftet ved elektronmikroskopi utføres i sultet (som dobbel-membran autophagosomes) eller PI-103-behandlet (hovedsakelig som senere stadium autolysosomal strukturer) HCT116 Bax-ko-celler, noe som indikerer induksjon av autofagi (figur 2). Autophagic vakuoler var fraværende i kontrollceller.
elektronmikroskopi bilder av autophagic vakuoler i kontroll, 10 mm eller 20 mikrometer PI-103-behandlede eller 6 timer og 24 timer HBSS behandlet HCT116 Bax-ko celler. Røde piler illustrerer noen av de autophagic vakuoler på ulike stadier av autofagi prosessen.
Nivåer av apoptose og nekrose i HT29 og HCT116 Bax-ko cellene under sult og PI-103 behandling ble vurdert i heftende celler av annexin V /PI-analyse (figur 3a), som viser et flertall av levedyktige celler med en liten prosentandel av nekrotisk (HT29 DMSO-behandlede (bærerkontroll): 6,5 ± 2,2%; 100 uM PI-103: 10,7 ± 2,7% (p = 0,29); HCT116 Bax-ko DMSO-behandlede (bærerkontroll): 1,5 ± 0,1%; 6 t sultet: 1,9 ± 0,2% (p = 0,06) og 24 timer sultet: 3,0 ± 0,4% (p = 0,01); 10 uM PI-103: 4,6 ± 0,4% (p = 0,02) og 20 uM PI-103: 6,6 ± 0,4% (p = 0,79)) eller apoptotiske celler (HT29 DMSO-behandlede: 1,0 ± 0,7%; 100 uM PI- 103: 2,0 ± 1,4% (p = 0,54); HCT116 Bax-ko kjøretøykontroll: 6,6 ± 0,5%, 6 hr sultet: 10,5 ± 0,8% (p = 0,001) og 24 timers sultet: 13,8 ± 0,8% (p = 0.003), 10 uM PI-103: 4,0 ± 0,1% (p = 0,26) og 20 uM PI-103: 4,1 ± 0,2% (p = 0,30)) i kontroll- og behandlede grupper. Det er ennå flytende celler ble observert i noen av de behandlede gruppene.
(a) Annexin V og propidiumjodidfarging (PI) analyse som måler den andel av celler som gjennomgår apoptose og nekrose i HT29-celler etter 24 timer på 100 uM PI -103 behandling og HCT116 Bax-ko celler etter 24 timer på 10 mm eller 20 mikrometer PI-103 behandling, eller 6 timer eller 24 timer av sult. Data er uttrykt som middel for prosent ± S.E.M. (Minimum
n
= 3 i hver gruppe). Statistisk signifikante endringer er angitt (* p 0,05). (B) Cell tall sammenlignet med 24-timers DMSO-behandlede kontroller i HT29 celler etter 24 timers DMSO-behandlet utvinning, 24-timers på 100 mikrometer PI-103 behandling og sine kjøretøy-behandlet kontroller 48 timers utvinning og 24 timers i HCT116 Bax-ko celler etter 24 timer på 10 mm eller 20 mikrometer PI-103 behandling, eller 6 timer eller 24 timer av sult og utvinning fra 24 timer til 20 mikrometer PI-103 behandling eller sult. Data er uttrykt som middel for prosent ± S.E.M. (Minimum
n
= 3 i hver gruppe). Statistisk signifikante endringer er angitt (* p 0,05). (C) cellesyklusanalyse. Dataene er hjelp av prosent ± standardavvik HT29 celler 24 timers DMSO-behandlet kontroll, 24-timers DMSO-gjenvunnet kontroll, 24-timers PI-103-behandlet 100 mikrometer, 24 timers PI-103-restituert, 48 hr PI-103-restituert, (
n
= tre i hver gruppe); HCT116 Bax-ko celler 24 timer DMSO-behandlet kontroll, 24-timers DMSO-gjenvunnet kontroll, 24-timers PI-103-behandlet 20 mikrometer, 24 timers PI-103-restituert, 48 hr PI-103-restituert, (
n
= tre i hver gruppe); HCT116 Bax-ko celler seks timers fullt mediekontroll, 6 timers sult (HBSS), 24 timers fullt mediekontroll, 24 timers sult (HBSS), 48 hr HBSS gjenvinnes (
n
= 3 i hver gruppe) . * P. 0,01
Et redusert antall heftende celler ble funnet i alle behandlingsgruppene etter 24 timer på 100 mikrometer behandling i HT29 celler (78 ± 2%, p 0,01), 6 timer og 24 timers sulte (46 ± 0,1% og 36 ± 0,4%, henholdsvis, s 0,01) eller 24 h 10 pM og 20 pM PI-103-behandling (65 ± 0,1% og 58 ± 0,1%, henholdsvis, s 0,01 ) i HCT116 Bax-ko-celler sammenlignet med kontroller (figur 3b). En økning i antall heftende celler over de 24 timers kjøretøy-behandlet kontrollnivåer ble observert i PI-103-indusert (170 ± 8%, p 0,05 (HCT116 Bax-ko); 303 ± 16%, p 0,01 ( HT29)) og sult-indusert (117 ± 7%, p 0,05) og autophagic celler etter 48 timers gjenvinnings (figur 3b), som indikerer at cellepopulasjonen økte over kontrollnivåer etter oppvåkning fra autophagy. Den 24-timers kjøretøy behandlede celler ble brukt som kontroller for både behandling og gjenvinning grupper, som kontrollcellene ville bli altfor sammenflytende etter 48 timers for utvinning.
cellesyklusanalyse ved flow-cytometri ble utført på hver behandlingsgruppe , og etter 24 timer og 48 timer av utvinning (figur 3c). En 24 timers utvinning tid-punkt for DMSO-behandlede kontroller ble også inkludert for hver PI-103 eksperiment som celle-antall av disse gruppene er lik celletallet fra PI-103-behandlede celler etter 48 timer for utvinning. G1 arrest ble observert i HT29 og HCT116 Bax-ko-celler etter behandling med PI-103, tilbake til 24-timers DMSO-behandlet nivå med 48 timer av utvinning (figur 3c). Økt G1 fase ble også funnet i 24 timer gjenvinnes DMSO-behandlede HT29 (9 ± 3%, p = 0,01) og HCT116 Bax-ko (11 ± 1%, p = 0,004) celler når sammenlignet med 24-timers DMSO-behandlede celler. Prosentandelene av 24 timer utvinnes DMSO-behandlede celler i hver fase av cellesyklusen er svært lik den 48 hr gjenvinnes PI-103-behandlede tids punkt i både HT29 og HCT116 Bax-ko-celler (figur 3c). Dette kan være på grunn av den gjenopprettede kontroll (DMSO-behandlede) og PI-103-behandlede celler blir mer sammenflytende på følgende tidspunkter, noe som er i samsvar med deres tilsvarende celle tall.
Ingen endring i cellesyklusen profilen til HCT116 Bax-ko-celler ble observert etter 6 eller 24 timer med sult (figur 3c). En reduksjon i G1 (12 ± 4%, p = 0,04) og en økning i G2-fasen (5 ± 1%, p = 0,003) ble funnet i 48 timer gjenvinnes HCT116 Bax-ko-celler sammenlignet med 24 timers media-behandlet kontrollgruppe celler og celletallene er de samme mellom disse to gruppene (figur 3c). Ingen betydelig endring i cellestørrelse ble observert i noen av behandlingsgruppene sammenlignet med kontroller.
PI-103 behandling reduserer AKT og mTOR bane aktivering i HT29 og HCT116 Bax-ko-celler, og denne prosessen er reversibel
virkningene av PI-103 behandling på AKT og mTORC trasé ble undersøkt i HT29 og HCT116 Bax-ko celler under behandling og i løpet av 24 og 48 timer for utvinning. Redusert uttrykk for Pakt og P4E-BP1 ble sett i HT29 og HCT116 Bax-ko celler etter 24 timer av PI-103 behandling med uttrykk av disse proteinene tilbake til nivået før behandlingsnivåer etter 48 timer med utvinning (figur 4a og b). Redusert PS6 ekspresjon ble også funnet i PI-103-behandlede HCT116 Bax-ko-celler og dens nivå gjenvunnet fra 24 timers gjenvinnings (figur 4b). Tatt sammen indikerer disse data at behandling med PI-103 hemmer AKT og mTOR-reaksjonsveien i begge cellelinjer, og denne prosessen er reversibel når stoffet er fjernet og cellene tillatt å komme seg.
Western-blots av PS6 ribosomalt protein, total S6 ribsomal protein, P4E-BP1, total 4E-BP1, Pakt, total Akt og α-Tubulin (lasting kontroll) i PI-103-behandlet og utvinning i HT29 og HCT116 Bax-ko celler.
Sanntids tydelig
13C-pyruvat til laktat valutakurser er redusert i PI-103-og sult-indusert autofagi, resterende redusert etter utvinning fra PI-103, men øker med utvinning fra sult
hyperpolarized [1-
13C] pyruvat til laktat utveksling ble overvåket i sanntid av
13C-MRS å måle utveksle kinetikk i autophagic celler. Figur 5a viser gjennomsnittlig
13C-MR-spektrene beregnes for hver gruppe ved å summere over hele det dynamiske tidsserie for HCT116 Bax-ko cellesuspensjoner efter tilsetning av hyperpolariserte [
13C 1-] pyruvat i kontroll, 24 hr sult og 48 timer med utvinning fra autofagi. Figur 5b viser den tilsvarende tidsserie av den normaliserte topp integralet av laktat signal i de samme gruppene. Tilsynelatende valutakursen konstant k
PL ble målt ved ikke-lineære minste kvadraters passer til de dynamiske data i hver gruppe, og dataene blir presentert som forhold (behandlet /24 hr kjøretøy kontroll) i figur 5c.
(a) hyperpolarized
13C-spekteret fra en HCT116 Bax-ko celleanalyse som viser summen over hele dynamiske tidsserier fra en kontroll celle eksperiment, etter 6 timers sult, 24 timers sult med HBSS media og etter 24 timers sult fulgt med 48 timers celle utvinning. Spekteret viser topper fra pyruvat (Pyr), laktat (Lac) og pyruvat-hydrat (Pyr H). (B) Plot av laktat peak integral som en funksjon av tiden normalisert til pyruvat topp integral ved tiden t = 0 s og normalisert per million celler anskaffet for HCT116 Bax-ko kontrollcellene, 24 hr sult med HBSS media og 24 timers sulte etterfulgt av 48 timers utvinning. (C) De midlere forhold (behandlet /24 timer kjøretøy-kontroll) av den tilsynelatende fremover reaksjonshastigheten av pyruvat til laktat utveksling k
PL (avledet fra montering av de eksperimentelle data og normalisert til celle nummer) (± SEM) for 24 timers DMSO-behandlet utvinning, 100 mikrometer PI-103 behandlede og 48 timers restitusjon etter 100 mikrometer PI-103 behandling i HT29 celler; for 10 mm PI-103 behandlet, 20 mikrometer PI-103 behandlede og 48 timers restitusjon etter 20 mikrometer PI-103 behandling i HCT116 Bax-ko celler; og i 6 timer HBSS sult, 24 timers HBSS sult og 24 timers sult etterfulgt av 48 timers bedring i HCT116 Bax-ko celler. Minimum
n
= 3 i hver gruppe. Statistisk signifikante endringer er angitt (* p≤0.05)
Redusert k
PL ble observert i HT29 celler behandlet med PI-103. (82 ± 7% av kontroll; p = 0,05) ( Figur 5c). Ingen signifikant forskjell i k
PL ble funnet mellom den 24-timers DMSO kjøretøy behandlede gruppe og den 24-timers gjenvinnes DMSO-kjøretøy behandlede gruppen (figur 5c) i HT29-celler, til tross for det cellenummer og populasjon av celler i G1 fase er høyere i 24 timer gjenvinnes DMSO-behandlede gruppen (figur 3b og c). Derfor k
PL i gjenopprettings gruppene ble sammenlignet med sine respektive 24 timers behandlede kontroller. k
PL holdt seg lavere i HT29-celler etter 48 timer med utvinning fra PI-103-behandling (74 ± 4% av kontroll; p = 0,02)., sammenlignet med 24-timers DMSO-behandlede kontroller (figur 5c)
Redusert k
PL ble funnet i HCT116 Bax-ko celler behandlet med 10 mikrometer (52,5 ± 9,4% av kontroll, p = 0,05) og 20 mikrometer PI-103 (41,1 ± 5,3% av kontroll; p 0,0001 ) sammenlignet med DMSO-bærerkontroller (figur 5c). Etter 48 timer på utvinning den tilsynelatende hastighetskonstanten ble hevet i forhold til behandlings priser, men kom ikke tilbake til 24-timers behandlede kontrollrate (65 ± 7% av kontroll; p = 0,004). (Figur 5c)
